心麻痹液在缺血预处理产生心肌保护效应中的作用研究.doc

心麻痹液在缺血预处理产生心肌保护效应中的作用研究 【关键词】 缺血预处理Niu Hao，Zhao Jinxian，Zhu Bin Department of internal medicine，Zhongtang Peoples Hospital，Dongguan523220. 【Abstract】 Objective To investigate the function of cardioplegia in IPC-induced cardioprotection through comparing the effects of ischemic preconditioning（IPC）and IPC followed by cardioplegia on immature rabbit hearts globally suffered ischemia-reperfusion injury.Methods New Zealand rabbits aged14-21days weighing220-280g were used.The animals were anesthetized and heparinized.Chest was opened and heart was quickly removed and aorta was connected to Langendorff within30s after excision.The hearts were perfused with Krebs-Henseleit buffer balanced with gas mixture（O 2 :CO 2 =95%:5%）at60cmH 2 O（perfusion pressure）.IPC consisted of5min global ischemia plus10min reperfusion.Thirty two immature rabbit hearts were randomly divided into four groups:CON（n=8），was only made globally ischemic by withholding perfusion for30min followed by40min reperfusion;IPC（n=8），IPC and30min noreperfusion followed by40min reperfusion;CON（n=8），A cardiac arrest was induced with4St Thomascardioplegic solution and a45min noreperfusion followed by40min reperfusion;IPC+St.（n=8），IPC，4St Thomascardioplegia and30min noreperfusion followed by40min reperfusion.Coronary flow（CF），HR，left ventricle developed pressure（LVDP），anddp/dtmax were monitored at equilibration（baseline value）and the5，10，20，30and40min after reperfusion.The values got after reperfusion were expressed as percentage of their baseline value.Myocardial enzyme in the coronary effluent，and myocardial energetic metabolism were also determined.Results The four hemodynamics indexes have not significant difference between the IPC group and the CON.It took the IPC group much longer time to cardiac ischemia-beating（16.231.74min versus13.501.82min in controls P0.01）.The CK-MB leakage in IPC group was increased，although the results were not significantly different from control.The myocardial levels of ATP in preconditioning group at the end of the reperfusion was significantly decreased.Yet in IPC+St.group the recovery of CF，HR，LVDP anddp/dtmax was significantly improved compared with CONand less CK-MB leaked out and as well as preserved myocardial ATP content.Conclusion Single IPC can not bring forth cardioprotectection on immature rabbit hearts experiencing with global ischemia and reperfusion;on the contrary，it may lead to injury of the myocardium.However under the use of cardioplegia，IPC provides significant cardioprotective effects.Therefore，on the isolated hearts perfused with Langendorff model，our study firstly observed that the use of cardioplegia is the precondition of IPC-induced cardioprotection. Key words ischemic preconditioning ischemia cardioprotection cardioplegia 缺血预处理是一个在许多种动物上都观察到的内源性适应性现象，且被描述为是所能得到的心肌保护中最强的机制之一 1 。一个或多个短暂的缺血再灌注能保护其后延长的具有潜在致死性的缺血 2 。这种IPC降低了缺血后心律失常发生的严重性 3 ，改善了收缩功能 4 ，并降低了缺血后心肌梗死面积 2 。关于IPC产生心肌保护的机制，一些研究 5，6 认为ATP敏感性钾通道（K ATP channel）开放可能与之密切相关。鉴于高钾浓度的心麻痹液是临床上最为常用的心肌保护措施之一，但细胞外高浓度钾是否会影响到K ATP 通道开放?因此，本研究将利用Langendorff离体灌注模型研究缺血预处理（IPC）单独应用和与心麻痹液（St.Thomas号停搏液）联合应用对兔未成熟心脏全心缺血再灌注的影响，以了解心麻痹液在IPC心肌保护效应中的作用。1 材料与方法 1.1 动物 新西兰幼兔，体重220280g，兔龄1421天，雌雄不拘。 1.2 心脏离体及灌注 以氨基甲酸乙酯腹腔麻醉（1.5g/kg），经股静脉肝素化（150IU/kg），快速开胸取出心脏，浸入4Krebs-Henseleit缓冲液，30s内主动脉插管连于Langendorff灌注装置，用39经混合气（O 2 :CO 2 =95%:5%）平衡的Krebs-Henseleit液灌注，灌注压60mmH 2 O（1cmH 2 O=0.098kPa）。剪开肺动脉以通畅冠脉流出道。剪开左心耳，向左室插入与多导生理检测仪（Macintosh Quadra610，Maclab charts3.6v/s）相连的带球囊导管，并将心脏移入保温缸内（39，兔生理体温）。30min后，向球囊缓慢注入生理盐水，调整至左室舒张末压（LVEDP）为10mmHg（1mmHg=0.133kPa），在整个实验过程中球囊容积保持不变。 1.3 灌注媒体 灌注液为Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液（mmol/L）:NaCl118.5，NaHCO 3 25.0，KCl4.8，MgSO 4 ?7H 2 O1.2，KH 2 PO 4 1.2，pH7.4（当95%O 2 :5%CO 2 平衡时）。其中钙离子浓度降低至1.8，葡萄糖为11.1mmol/L。使用前，所有灌注液均经过孔径为5.0-醋酸纤维素膜过滤。心麻痹液为St.Thomas高钾停搏液（mmol/L）:NaCl100.0、NaHCO 3 10.0、KCl16.0、MgCl 2 6H 2 O16.0、CaCl 2 H 2 O1.2，pH7.80 0.02。 1.4 实验分组及流程 实验共分4组，每组8例。所有心脏在全心缺血（停灌注）前均接受50min平衡灌注，IPC为全心缺血前的5min停灌注-10mim再灌注。其中Con和IPC组离体灌注心脏为主动脉停灌，心脏缺血自动停跳后接受30min缺血和40min再灌注;而在Con和IPC复合心麻痹液组，用20ml4St.Thomas心麻痹液经主动脉灌注，心脏停跳后接受45min缺血和40min再灌注。 1.5 心脏缺血跳动时间 记录主动脉停灌后Con和IPC组心脏缺血跳动时间。 1.6 功能测定 所有心脏在接受15min的Krebs-Henseleit液的平衡灌注后，记录冠脉流量（CF）、心率（HR）、左室发展压（LVDP）、左室压力最大上升和下降速率（dp/dt max ）作为基础值，并分别把再灌后5、10、20、30、40min的CF、HR、LVDP、dp/dt max 测定值表达为对其相应基础值的恢复率。1.7 心肌酶测定 收集复灌后前10min的冠脉流出液，测定心肌特异的肌酸激酶同工酶（CK-MB）。自动生化分析仪为Hitachi7170A，CK-MB试剂盒购自Sigma。 1.8 ATP的测定 剪取心肌左室组织200mg;滤纸吸净表面水分，液氮保存，采用高效液相色谱技术测定ATP含量。仪器与试剂:采用美国Waters公司高效液相色谱仪，510泵，490E型紫外检测器，4.6mm250mm Spherisorb ODS2柱;5-ATP钠盐和CP（均为Sigma产品），甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为超纯水。测定方法:称取适量心肌组织（150mg），加入1ml0.4M HCLO4溶液沉淀，匀浆，冰浴中提取。5000r/m离心10min，上清液用碱调pH为中性，10000r/m离心10min。取上清液20l进高效液相色谱仪（HPLC）分析。色谱条件:ODS反相分离柱，流动相为甲醇-KH 2 PO 4 缓冲液，流速1.0ml/min，检测波长259nm。单位g/g.wet。 1.9 数据表达与统计学分析 所有数据均以Xs表示，Con与IPC组比较以及Con与IPC+St.组比较用成组t检验，P0.05为差异有显著性。表1 各组血液动力学在复灌后恢复情况 （Xs）（略） 注:和Con相比， P0.05， P0.01 表2 各组CK-MB、ATP以及心脏缺血跳动时间的比较 （Xs）（略）注:与各自对照组相比， P0.05， P0.05）。而在IPC+St.组，CF、HR、LVDP和dp/dt max 恢复率在复灌后明显高于Con组（表1）。 2.4 心肌酶学变化 IPC组的肌酸激酶同工酶（CK-MB）漏出量高于Con组，但差异无显著性（P0.05）;IPC+St.组（表2）。 2.5 心肌ATP含量 IPC组的心肌组织ATP含量明显低于Con组;而IPC+St.组心肌组织ATP含量明显高于Con组（表2）。 3 讨论既往多数缺血预处理研究能得到保护性结果，故而许多学者认为缺血预处理对心肌的保护是迄今发现最强的内源性保护 1 。即使有些结果阴性的实验也只是把原因归咎为实验动物种属和模型的不同，而从未提到预处理后的实验动物心脏在接受全心缺血时，其停跳是否迅速或缺血跳动时间延长（文献中IPC对离体心脏I/R研究罕用停搏液） 7 。但本实验结果表明:单纯的使用缺血预处理并不能保护接受缺血再灌未成熟兔心肌的心脏功能反而可能导致心肌细胞的损伤。其原因可能与主动脉停灌后，心脏缺血跳动时间显著延长从而导致能量消耗过多有关。如果经过缺血预处理的心脏在主动脉停止灌注后仍较长时间跳动，这必然导致心肌细胞损伤和能量消耗增加。但从另一角度来说，预处理过的心脏不易停止搏动本身是否意味着IPC对心肌电、机械性的保护?在本研究中，即使IPC组心肌细胞损伤较重、能量消耗增多，但其血流动力学指标及心率恢复与其对照组并无统计学差别，在复灌后各观察点HR及-dp/dt max 的恢复有好于对照组的趋势。这提示IPC对心肌的保护研究有必要与心麻痹液结合起来进行。 但是，K ATP 通道开放可能正是IPC产生心肌保护的机制 5，6 ，如果使用高钾浓度的心麻痹液会不会影响到该通道的开放?Kaukoranta等 8 的研究显示，IPC与心麻痹液合用时，细胞外高浓度钾可能会影响到K ATP 通道开放而减弱或取消IPC的保护作用。本实验结果显示:同单独的高钾停搏液组（Con组）相比，缺血预处理联合高钾停搏液明显改善了再灌注后心率（HR）、冠脉流出量（CF）、左室发展压（LVDP）及左室压力最大上升和下降速率（dp/dt max ）的恢复率，并保存了心肌ATP含量，少了肌酸激酶同工酶（CK-MB）漏出。提示在同高钾停搏液联合使用时，IPC仍具有明显的心肌保护效应;而且本研究首次观察到这种在Langendorff离体灌注心脏模型上的IPC心肌保护效应有赖于心麻痹液的参与。Galinaces等 9 对离体大鼠心脏的研究显示，当心脏停搏液的灌注受到阻碍时（2.0ml/g心肌），IPC与心脏停搏液联合应用能比单独应用心停液更有效的保护心肌组织。而Lu等 10 在风心病瓣膜置换术中对St.Thomas液联合IPC进行研究，发现预处理组较单独使用心停液组，缺血后血浆ATP含量和心肌+dp/dt max 增高，而CK释放减少。这都显示了在IPC与高钾停搏液之间存在良好的“兼容性”。事实上，St.Thomas号停搏液的“高钾”也仅为16mmol/L，较之细胞内钾浓度仍相去甚远，可能不足以妨碍K ATP 通道的开放;或者IPC机制还可能涉及到其他方面，这需要进一步实验证实。 本实验提示，IPC在单独应用时不足以保护经历全心缺血再灌注损伤的兔未成熟心脏，反而有可能导致心肌细胞的损伤;而在与心麻痹液合用时，IPC对经历全心缺血再 灌注的兔未成熟心肌具有明显的保护作用。这表明，在特定的研究模型上，IPC对心肌的保护需要与传统高钾浓度心麻痹液相结合。 参考文献 1 Lawson CS，Downey JM.Preconditioning:state of the rat myocardial protection.Cardiovasc Res，1993，27:542-550. 2 Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium.Circulation，1986，74:1124-1136. 3 Lawson CS，Coltart DJ，Hears DJ.“Dose”-dependency and temporal characteristics of protection by ischemic preconditioning against ischemia-induced arrhythmias in rat hearts.J Mol Cell Cardiol，1993，25:1391-1402. 4 Cave AC，Hearse DJ.Ischemic preconditioning and contractile function:tudies with normothermic and hypothermic global ischemia.J Mol Cell Cardiol，1992，24:1113-1123. 5 Baker JE，Holman P，Gross GJ.Preconditioning in immature rabbit hearts:role of K ATP channels.Circulation，1999，99:1249-1254. 6 张育才，曾因明，许鹏