新生兔重度胎粪吸入模型的制备.doc

新生兔重度胎粪吸入模型的制备作者：周海燕,武荣单位：滁州 安徽医科大学滁州临床学院儿科教研室【摘要】目的观察不同浓度胎粪悬混液对新生兔的影响，建立合适的机械通气胎粪吸入模型。方法21只新生兔，随机分成25 mg/ml浓度组,45 mg/ml浓度组,65 mg/ml浓度组以及对照组，分别由气管导管注入胎粪悬混液4 ml/kg（对照组注入等量生理盐水），达到通气指征后，予以机械通气。观察各组8 h内病死率、胎粪灌入前及胎粪灌入后30 min肺顺应性（Cydn）、血气、氧合指数、肺组织大体病理情况及肺损伤病理评分。 结果 25 mg/ml组肺损伤小，8 h内均未达到机械通气指征；45 mg/ml组均在0.5 h到机械通气指征，肺损伤较小；65 mg/ml组在0.5 h均达到机械通气标准，其病理显示肺损伤严重，实变及出血灶较大，病死率高。结论 45 mg/ml组达到机械通气指征的时间较理想，肺损伤程度适中，适合做为机械通气模式等相关研究的重度胎粪吸入模型。【关键词】 胎粪吸入；机械通气；模型；新生兔Model of severe meconium aspiration in newly-born rabbitsZhou Haiyan, Wu RongDepartment of Pediatrics, Chuzhou Clinical College of Anhui Medical University, Chuzhou 239000, ChinaAbstract Objective Investigate the effects of meconium solutions on newly-born rabbits, and to establish a suitable model of meconium aspiration which needs to apply mechanical ventilation.Methods 21 newly-born rabbits were randomly divided into 25mg/ml concentration group(n=6), 45mg/ml concentration group(n=6), 65mg/ml concentration group(n=6) and the control group(n=3). Meconium solutions were injected into the endotracheal tube by 4ml/kg in the first three groups while control group injected equivalent saline. Mechanical ventilation when achieved the ventilation indications. Observed the mortality within 8 hours in each group, lung dynamic compliance (Cydn) in the pre-and 30 minutes after meconium poured, blood gases, oxygenation index, lung tissue in general pathology and lung injury score.Results 25mg/ml concentration group were minimal lung injury, and failed to meet within the indications for mechanical ventilation in 8 h; 45mg/ml concentration group were able to achieve the indications in 0.5 h, and had less lung injury; 65mg/ml concentration group all reached the indications in 0.5h, its pathology revealed severe lung injury, pulmonary consolidation and hemorrhage focus were larger, and the mortality rate were higher.Conclusion 45mg/ml concentration group achieved the indications of mechanical ventilation in ideal time , the degree of the lung injury is appropriate.This group is a suitable one as a severe meconium aspiration model which can be applied in the research related to mechanical ventilation.Key words Meconium aspiration；Mechanical ventilation；Model; Newborn rabbit 胎粪吸入综合征（MAS）是新生儿常见的疾病之一，其发病率为1.2%1.6%，其中30%的患儿为重度MAS并需行机械通气1，目前国内外研究大多使用新生猪、大鼠及成年兔制备胎粪吸入模型，在模拟新生儿胎粪吸入综合征上存在一定差异。而目前观察不同通气模式及参数对MAS作用的研究报道较少，与此相关的胎粪吸入模型的制备尚无统一的指标，因此，建立符合需机械通气的胎粪吸入模型对MAS疾病的研究具有一定的意义。本实验选用新生兔，通过不同浓度的胎粪悬混液制备新生兔重度胎粪吸入模型，观察新生幼兔的血气、氧合指数、动态顺应性及肺组织病理变化，为机械通气模式等相关的研究提供合适的MAS动物模型。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 健康日本大耳白新生兔 21只，日龄2030 d，性别不限，体质量300500 g；呼吸机为德国Stephanie 小儿呼吸机。1.1.2 胎粪悬液制备 取多个足月健康新生儿头次胎粪，真空冷冻干燥。研磨成粉末状，用无菌生理盐水分别稀释成25 mg/ml、45 mg/ml、65 mg/ml浓度的均匀胎粪悬混液，分装-20保存2，待用。1.2 方法1.2.1 分组 随机分为对照组，25 mg/ml浓度组，45 mg/ml浓度组，65 mg/ml浓度组。对照组3只，其余每组各6只。1.2.2 动物模型的制备 固定，仰卧位，颈部局部麻醉，予气管插管（深度：150 mm；气管导管：2.0 mm），胶带固定，记录生理参数，然后气管导管内注入4 ml/kg的胎粪悬混物，分2次注入，每次2 ml/kg（正常组灌入同样量的生理盐水）。每次注入后使用复苏气囊按压5 min，确保胎粪均匀进入支气管及肺泡。灌注全程给100%氧气，第2次胎粪注入后5 min开始计时。各组均给50%氧气吸入，达到通气指征后，予机械通气，各组观察时间为8 h。1.2.3 机械通气 通气指征 在吸入50%氧气情况下，PaO2下降至50 mmHg以下, PaCO2在50 mmHg以上，氧合指数<200（具备其中一个条件即可）3。 通气模式及参数 SIMV，触发压力：0.5 cmH2O，参数调节以维持潮气量正常范围（68 ml/kg）及正常血气值为准。1.2.4 观察指标 8 h内病死率，胎粪灌入前及胎粪灌入后30 min测定幼兔肺顺应性（Cydn）、血气、氧合指数。1.2.5 肺组织大体病理情况 按文献4方法将其分为5级，I级：正常肺；级：肺较饱满，有水肿；级：点状肺出血，整个肺可见针尖或绿豆大小的出血；IV级：局灶性肺出血，肺表面有总面积小于2叶的小灶或小片状出血；V级：弥散性肺出血，肺表面可见总面积达2叶以上的斑块状或大片状暗红色出血。1.2.6 肺组织病理检查 4%多聚甲醛液固定的肺组织常规石蜡包埋切片，苏木素-伊红（HE）染色，400倍光镜下任取10个视野，观察肺组织病理改变。肺损伤病理评分标准5，按三个特征分为0-4分，白细胞在肺组织中的浸润范围：0=0%，1=025%，2=25%50%，3=>50%75%，4=>75%100%；肺泡腔白细胞量：0=无，1=偶有，2=大量白细胞，3=肺泡腔几乎充满白细胞，4=肺泡腔被白细胞充满并扩张；肺泡腔渗出物的量:包括纤维素、透明膜、水肿液和胎粪，0=无渗出物，1=偶见渗出物，2=清晰可见渗出物，3=几乎充满渗出物，4=肺泡腔被渗出物充满并扩张。1.2.7 统计学处理 实验数据用SPSS 13.0软件进行分析，肺病理分级采用K Independent Samples Test检验，肺损伤评分结果采用One-way ANOVA分析，以P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 各项指标变化 25 mg/ml浓度组在8 h内均未达到机械通气标准，并未出现死亡。45 mg/ml浓度组均于0.5 h达到机械通气标准，其中6.5 h死亡1只（肺大面积出血）。65 mg/ml浓度组在0.5 h均达到机械通气标准，其中死亡4只（气胸、肺大面积出血），8 h内平均死亡时间为（4.13±1.44） h。胎粪灌注前后顺应性下降明显，均大于80%，具体指标见表1。表1 各项指标变化组别8 h内病死率(%)PaO2(mmHg)（±s）PaCO2(mmHg)（±s）氧合指数（±s）Cydn下降比（±s）对照组0.00223.57±14.1639.4±0.96447.13±28.320.17±0.0625 mg/ml0.00112.33±6.6831.80±6.23224.67±13.370.87±0.0445 mg/ml16.6759.50±19.4644.73±7.65119.00±38.920.89±0.0565 mg/ml66.6755.50±16.4756.63±11.04111.00±32.930.93±0.042.2 肺组织大体病理情况 各组均有水肿、出血，其中对照组见图1。25 mg/ml浓度组肺表面可见点状肺出血及局灶性肺出血，小灶或小片状出血总面积小于2叶（图2）。45 mg/ml浓度组肺表面可见斑片状肺出血，其出血总面积小于2叶，其中1只局灶性出血总面积大于2叶（图3）。65 mg/ml浓度组肺表面可见大面积局灶性肺出血，其中4只出血总面积大于2叶（图4）。肺病理分级采用K Independent Samples Test检验，χ2=10.131,V=2,P=0.006，三组间差异具有统计学意义（表2）。 图1 正常对照组 图2 25 mg/ml浓度组 图3 45 mg/ml浓度组 图4 65 mg/ml浓度组2.3 肺组织病理结果 各浓度组均有肺泡通气不均一现象，肺泡隔增宽，伴炎性细胞浸润，肺间质和肺泡弥散性水肿，细小支气管可见胎粪颗粒。25 mg/ml浓度组：肺泡腔及肺间质可见炎性细胞浸润，偶见肺泡壁及肺泡腔内出血及少量蛋白渗出物。45 mg/ml浓度组：肺泡大小不均，肺泡内及肺间质大量炎性细胞浸润，肺叶内局部肺不张，肺泡壁增厚同时也有肺泡壁破裂。65 mg/ml浓度组：肺泡内及肺间质充满炎性细胞，肺出血、肺大泡形成较明显，肺泡壁、肺泡腔甚至支气管壁下也能见到出血(图58)。肺损伤评分结果用One-way ANOVA分析时采用LSD法，各组间差异具有统计学意义（均P=0.000），以65 mg/ml浓度组最高，25 mg/ml浓度组最低（表2）。图5 对照组（HE，100×） 图6 25 mg/ml组（HE，100×） 图7 45 mg/ml组（HE，100×） 图8 65 mg/ml组（HE，100×）表2 肺组织病理评分（分）组别n肺病理分级I IVVMean rank肺损伤评分（±s）对照组30000001.33±0.5825 mg/ml6023104.753.33±0.5245 mg/ml6002319.585.67±0.8265 mg/ml60002414.179.17±1.173 讨论 国内外实验研究多用成年兔做为实验动物，但由于成年兔的肺发育程度无法模拟新生儿肺发育不成熟的特性，故应用时有一定的欠缺性，本实验使用新生幼兔作为实验动物，模拟新生儿的肺发育特点。目前国内外常用20%胎粪混合物来制备胎粪吸入模型2，6。我们在预实验中，取多个新生儿头次胎便，用无菌生理盐水稀释成20%的胎粪混合物，冻干后称重。胎粪浓度均值在(47.95±10.55) mg/ml，其浓度变化差异较大，考虑其原因是由于个体差异及胎粪采集等误差（解便时间与收集时间差、尿布吸收水分及每次所取胎粪的量等的不同）所致。为此，我们采用胎便直接冻干后称重，用无菌生理盐水稀释成25 mg/ml、45 mg/ml、65 mg/ml浓度的胎粪悬混液，选取不同浓度的胎粪悬混液制备需机械通气的重度胎粪吸入模型。本实验结果发现，给予50%浓度氧气时，25 mg/ml浓度组肺损伤小，其在8 h内均未达到机械通气标准，且均未出现死亡，因此不适合作为研究机械通气模式的胎粪吸入模型。65 mg/ml浓度组在0.5 h均达到机械通气标准，但是其病理显示肺损伤严重，实变及出血灶较大，病死率高，因此也不适合作为研究机械通气模式的胎粪吸入模型。45 mg/ml浓度组均在0.5 h能达到机械通气标准，肺损伤相对较小，且其机械通气8 h病死率较低，可作为研究机械通气模式及其他相关研究的胎粪吸入模型。综上所述，我们认为，45 mg/ml浓度组符合新生兔重度MAS机械通气研究的要求，该模型操作相对简便，重现性较好，适合做为研究机械通气模式等相关研究的重度胎粪吸入模型。【参考文献】1 Dargaville PA，South M，Mcdougall PNSurfactant and surfactant inhibitors in mecomiun aspiration syndromePediatrics，2001，138(1)：113-115.2 Mokra D，Drgova A，Morry，et al.Combination of budesonide and a