碳样小单孢菌FIM99-663产生的新抑锈病素.doc

碳样小单孢菌FIM99-663产生的新抑锈病素作者：连云阳,谢阳,魏天恩,程振泰,程元荣单位：福建省微生物研究所 福建省新药(微生物)筛选重点实验室， 福州350007【摘要】 在筛选新抗真菌抗生素过程中，从福建邵武森林土壤样品中分离得到一株对酵母样真菌有较强抗菌作用的小单孢菌FIM 99-663。经分类鉴定为碳样小单孢菌Micromonospora carbonacea FIM 99-663。该菌株发酵次级代谢产物含三个抗真菌活性组份，主成份为Fw99-663C组份，经提取、纯化，理化性质、光谱学分析发现它与新抑锈病素(neorustmicin)同质。 【关键词】 小单孢菌； 新抑锈病素； 抗真菌抗生素 Neorustmicin produced by M.carbonacea FIM 99-663 Lian Yun-yang, Xie Yang, Wei Tian-en, Cheng Zhen-tai and Cheng Yuan-rong (Fujian Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products, Fujian Institute of Microbiology, Fuzhou 350007) ABSTRACT In the course of screening for new antifungal antibiotics, Micromonospora sp. FIM 99-663 was isolated from a forest soil sample collected in Shaowu, China. Based on the taxonomic data, the strain was identified as Micromonospora carbonacea FIM 99-663. The culture broth of FIM 99-663 contained A, B and C three bioactive components, and component A and B were traced and major component C was extracted and purified. The physico-chemical properties and spectra of component C showed it was identical with antifungal antibiotic neorustmicin. KEY WORDS Micromonospora; Neorustmicin; Antifungal antibiotic 随着抗生素、激素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂等的广泛应用和器官移植等大型手术的实施，近年来临床上深部真菌感染的发病率及其死亡率明显增加。但是，目前疗效确切可应用于临床治疗深部真菌感染的抗真菌药物只有两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑等屈指可数的几种药物。氟康唑等唑类药物的长期、大量使用，真菌耐药程度日益增加，两性霉素B等多烯类抗生素严重的毒副作用使临床应用受限。因此寻找新型、高效、低毒的抗深部真菌感染的药物一直是新药研究的重点之一1。我们在筛选新抗真菌抗生素过程中从小单孢菌中筛选到一株对隐球菌和白念珠菌有抗菌作用的菌种，编号为FIM99-663。本文报道该微生物菌种分类、发酵及其活性产物的提取纯化和鉴别。 1 材料与方法 1.1 菌种与发酵 菌株 菌株FIM99-663从福建邵武森林土壤样品中分离，其发酵代谢产物具有抗真菌活性。 分类 菌株FIM99-663的孢子悬液在高氏-天冬素琼脂平板上划线，同时斜插无菌盖玻片，35培养，分别于5、10、20d取出盖玻片用光学显微镜及电镜观察菌丝及孢子的表面特征。培养特征和生理生化特性采用国际链霉菌规划(ISP)推荐的培养基和小单孢菌菌种描述的培养基35培养2，不同时间观察并记录结果。碳源利用试验以不加淀粉的高氏一号琼脂为基础培养基，分别加入各种碳源1.85%，35培养，观察30d。 磷酸类脂、枝菌酸和甲基萘醌的测定分别参照阎逊初3和阮继生等4的方法进行；DNA的G+C mol%测定参照De Ley等的Tm值方法5。用溶菌酶法6提取总DNA模板，采用通用引物进行16S rDNA的PCR扩增，PCR产物经纯化后直接用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit测序。 发酵 从菌株FIM99-663的沙土保存管中取少量沙土，接种于高氏琼脂斜面上，35培养1215d。成熟的培养物用20%的甘油制成孢子悬液，分装后置-20备用。0.5ml的孢子悬液接入30ml种子培养基(%)：可溶性淀粉1.5，葡萄糖0.5，蛋白胨0.5，酵母粉0.5，K2HPO4•3H2O 0.05，MgSO4•7H2O 0.05，NaCl 0.05，(NH4)2SO4 0.05，CaCO3 0.1，消前pH7.5；32 200r/min振荡培养40h，以5%接种量转入发酵培养基(%)：可溶性淀粉4，葡萄糖0.5，干酪素1.4，黄豆饼粉0.5，聚蛋白胨(polypepton)0.5，MgSO4•7H2O 0.05，K2HPO4•3H2O 0.05，CaCO3 0.1，消前pH7.5；32 200r/min振荡培养96110h。 1.2 提取、纯化 发酵液离心(4500r/min)15min，得上清液和菌渣。上清液用等量的乙酸乙酯萃取，60减压浓缩至干，得上清提取粗品。菌渣用95%乙醇浸泡30min后离心去渣，上清液进行减压浓缩，浓缩液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩至干，得菌渣提取粗品。 合并上述提取粗品，少量甲醇溶解，行硅胶柱层析，丙酮-石油醚梯度洗脱，分段收集，合并相同组份的洗脱液，分别于60减压浓缩至干，少量甲醇溶解后采用岛津LC-8A制备性HPLC进样纯化，岛津PRO-ODS柱(10mm×250mm，10μm)，进样量3ml，75%甲醇水洗脱，流速10ml/min，210nm波长检测，每15ml收集一管，分析型HPLC-PDA跟踪检测各收集管，合并相同组分收集管，减压浓缩至少量体积后离心浓缩至干，少量甲醇溶解后，加适量石油醚置-20结晶。 1.3 HPLC分析 岛津SCL-10Avp高压液相色谱仪，PDA检测器。C18反相色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温50。洗脱：粗品分析采用梯度洗脱，040min内从50%甲醇水线性提高到100%甲醇；样品纯度检测用80%甲醇水，流速1ml/min。 2 结果 2.1 分类 菌株FIM99-663在所应用的琼脂培养基上均不产生气生菌丝，基内菌丝发育良好，单个孢子着生在基内菌丝的短孢子梗上，孢子梨形至椭圆形，大小0.60.7μm×0.71.0μm，外壁光滑。合成培养基上生长中等，无色-玫瑰粉(IIa14’)(色谱，科学出版社，1957)，孢子层薄，浅灰-黑色，无可溶性色素；在有机培养基上，基丝生长良好，玫瑰粉(IIa14’)-鲑鱼红(IIa25’)，在燕麦-番茄汁琼脂上为软木黄(Id45’)，孢子层厚，黑色呈干腊状，无可溶性色素，在葡萄糖-酵母膏琼脂和加碳酸钙的马铃薯块上培养后期会产生一层薄的白色假气丝。 菌株FIM99-663碳源利用情况。D-木糖、D-葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖、蜜二糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、淀粉被很好利用；L-阿拉伯糖、棉子糖、甘油、赤藓醇、山梨醇、水扬苷、柠檬酸钠可被利用；D-阿拉伯糖、核糖、山梨醇、鼠李糖、松三糖、菊糖、阿东糖醇、肌醇、甘露醇、卫茅醇、醋酸钠、草酸钠和七叶苷等只被微弱或不利用。生长温度范围1240，45不长，生长pH711，在含4% NaCl的酵母膏-麦芽膏琼脂斜面上不生长；滤纸条上能生长；在胨-铁琼脂(ISP6)上不产生黑色素；不液化明胶；牛奶凝固并胨化；能水解淀粉，硝酸盐还原阳性。 细胞壁组份II型，糖D型，即含有内消旋二氨基庚二酸和甘氨酸，阿拉伯糖和木糖。磷酸类脂为磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰肌醇(PI)，磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)和双磷脂酰甘油(DPG)，属磷脂PII型；不含枝菌酸；主要甲基萘醌(menaquinones)为MK-10(H2)，另有少量MK-9(H4)和MK-9(H6)；(GC)mol%为71.0%； 16SrDNA序列(Accession number:DQ126265)与GenBank中相关菌株的BLAST比较结果表明，该菌株与碳样小单孢菌(Micromonospora carbonacea)的16S rDNA序列同源性为98.7%，综合以上结果菌株FIM 99-663定名为：Micromonospora carbonacea FIM 99-663。 2.2 活性代谢产物鉴别 碳样小单孢菌FIM 99-663活性代谢产物经提取、硅胶柱纯化，粗品HPLC-PDA分析，通过分段收集，活性检测，发现含三个活性组份，均具有抗红酵母和新型隐球菌等酵母样真菌的活性，其中A组份活性最强，C次之，B最弱。A、B和C三个组份具有相似的UV图谱(Fig.1)，提示三者可能是结构相似的抗真菌抗生素。 FIM99-663活性粗提物进一步经制备型HPLC纯化，获得的A、B组份极微量，获得C组份(Fw99-663C，Fig.2)10mg，为白色针状晶体，溶于氯仿、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮等，不溶于水。IR光谱如Fig.3所示。数据库检索发现Fw99-663C与已知抗真菌抗生素rustmicin7极其相似，但电喷雾正、负模式质谱分析(Fig.4)Fw99-663C分子量均为364，比rustmicin少16。样品经英国Scynexis Europe Ltd.实验室Bruker DRX500测定1H-NMR谱(COSY、HMQC、HMBC)，X-WinNMR V3.1软件数据分析发现Fw99-663C 1H-NMR数据与rustmicin结构基本符合， 但未发现rustmicin的-OCH3质子信号(H16，Fig.4)，而多了一个-CH3质子信号(δ1.70，Tab.1)，且H16和H7的异核相关性与H19和H11相似。综合上述光谱数据判断Fw99-663C为抗真菌抗生素neorustmicin，结构式见Fig.5。 3 讨论 Rustmicin类抗真菌抗生素包含rustmicin和neorustmicin等，它们都是十四元环大环内酯抗真菌抗生素，对临床重要的致病菌白念珠菌和新型隐球菌有抗菌作用。1985年Otake7和Achenbach8分别从小单孢菌Micromonospora narashinoensis、小单孢菌M.chalcea和链霉菌Streptomyces galbus中发现这类化合物，当时它是作为抗植物真菌病害的药物，并不了解其作用机制。1998年Merck实验室报道了该化合物是真菌肌醇磷酸神经酰胺(IPC)合成酶的特异性抑制剂9，能够引起真菌细胞内神经酰胺堆积而造成细胞死亡，然而在动物细胞的(神经)鞘脂类合成途径中并没有IPC合成酶，因此有人认为此类化合物将来可能被开发为对动物对人毒性低的抗真菌药物。 Rustmicin和neorustmicin化学稳定性差， 容易发生分子内转酯而导致结构破坏，在碱性和中性溶液中都很不稳定，可能限制它们在临床中的应用。最近，美国、日本研究人员试图通过生物转化10、化学合成11，12等途径改造此类抗真菌药物，寻找稳定性好、抗真菌活性强的新衍生物。【参考文献】1 顾觉奋，倪孟祥，李治川. 微生物来源的抗真菌抗生素研究进展J. 中国新药杂志，2001，10(5)：328331.2 Kawamoto. 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