（高分子化学与物理专业论文）用于内毒素去除的新型亲和吸附剂的制备及性能研究.pdf

摘要 随着生物制药和生物医学工程相关领域的发展，人们对产品中可能存在的微 量有害物质的清除越来越重视。内毒素( e t ) 是一种在自然界广泛存在的污染物， 是一种毒性很强的致炎和热原物质。有效清除制品中、特别是生物制品中污染的 内毒素一直是医学、制药、生物工程等领域研究的热点。由于内毒素的相对分子 质量较大，与大分子生物制品在同一数量级，因此从这类制品中去除微量的内毒 素难度很大。迄今为止，在实际生产过程中得到应用的材料和方法并不多。一些 已经商品化的产品也存在吸附效率低，价格高等问题。因此，对这一领域的研究 仍具有十分重要的价值和实际意义。本课题针对当前内毒素亲和吸附剂存在的问 题，从载体、配基两方面着手，结合反应条件的研究，发展了几种新型的适于用 作e t 吸附的活性配基物质，制备出了对内毒素吸附量高、特异性好、血液相容 性好的新型吸附材料。通过对这些材料的吸附特性的研究，为内毒素亲和吸附剂 的进一步结构设计和制备提供依据。 在载体材料的研究方面，论文主要研究了作为活性吸附剂载体的多孔硅胶的 孔径和比表面等参数对亲和吸附剂制备的影响。以多孔硅胶为载体的亲和吸附剂 是采用表面接枝的方法制备的。选用组氨酸( h i s ) 为活性配基。经酸化处理的多孔 硅胶先以硅烷偶联剂k h 5 5 0 硅烷化，在硅胶表面引入活性胺基，然后以戊二醛 为间隔臂将组氨酸接枝在多孔硅胶载体上，制成用于内毒素去除的亲和吸附剂。 用i r ，t g a 、元素分析和功能基化学滴定的方法测定了每步反应的转化率，即 不同反应物在多孔硅胶上的接枝率。结果表明，反应物在硅胶上的含量与硅胶的 比表面积及孔径有关，且多步反应使硅胶载体的孔径不断减小。由于e t 的分子 尺寸较大，因此，选用较大孔径的多孔硅胶基质制成的亲和吸附剂对e t 的吸附 效果较好。这样才能使e t 分子扩散到硅胶孔内被接枝在孔壁上的活性配基吸附。 在配基的研究方面，本论文研究了三种不同的配基：一种是文献上已有大量 报道的组氨酸配基，一种是根据组氨酸中咪唑基对e t 的特殊亲和作用而选则的 乙烯基咪唑配基( v i ) ，最后一种是在实验过程中发现的含环氧基的亲和配基。 前两种配基中的主要活性位均是咪唑基团，但组氨酸分子中还含有负电性的羧基 和具反应活性的胺基。乙烯基咪唑是通过自由基聚合反应接枝到硅胶载体上的， 得到的是一种大分子配基。通过上述两种吸附剂对水溶液中e t 的静态和动态吸 附性能进行比较，发现以聚乙烯咪唑为配基的吸附剂对e t 有更高的吸附容量和 去除率。这不仅证明了咪唑基作为活性功能基对e t 有很高的选择吸附性，而且 也证明，配基与e t 之间的静电相互作用是使其具有较好吸附特性的主要原因。 当配基分子中含有羧基等负电性基团时，会削弱咪唑基对e t 的吸附作用。含环 氧基的化合物作为e t 的亲和配基至今未见文献报道。这种含环氧基的配基可以 通过与相应的硅烷偶联剂反应引入吸附剂表面，或是通过在含端烯基的载体上接 枝甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 而固载到载体上。研究表明，一旦环氧基被 打开，相应的吸附剂对e t 就不再呈示吸附能力，说明环氧基团是对e t 起选择 吸附作用的活性位。有关该配基与e t 作用的机理还有待于进一步的深入研究。 但这一发现拓宽了活性配基选择的范围。 聚乙烯基咪唑作为大分子配基用于e t 的吸咐虽然有很高的选择性和吸附容 量，但v i 较强的分子间作用力及咪唑基过高的接枝密度会显著影响该配基的吸 附效率。论文通过v i 与甲基丙烯酸酯的共聚较好地调节了咪唑基在接枝链上的 分布。由于v i 与甲基丙烯酸酯在溶液中发生共聚反应的竞聚率有很大差别，属 r 1 l 的非恒比共聚反应。所以在共聚时，乙烯基咪唑自聚的能力会很差。 因此，在与甲基丙烯酸酯单体形成的共聚链中绝大多数乙烯基咪唑单元会被若干 个丙烯酯单元隔开成单个分布。可以认为，对e t 基本无吸附效果的丙烯酸酯在 共聚体中发挥了间隔臂的作用，使单位咪唑基对e t 的吸附量得到提高。论文通 过共聚接枝的方法还有反相悬浮聚合的方法制备了一系列v i 与第二单体的共聚， 粒子，并测定了不同单体配比下得到的共聚接枝物对e t 的吸附性能。 在合成路线方面，除了k h 5 5 0 方法外，论文还研究了用环氧法引入组氨酸 配基的方法。首先用含环氧基的偶联剂k h 5 6 0 对硅胶载体进行硅烷化处理，引 入环氧基，然后利用环氧基与组氨酸分子上的氨基直接开环加成，或利用将环氧 基氧化形成的醛基为中介进行加成，使组氨酸配基结合在硅胶载体上。结果表明， 直接开环加成制成的吸附剂对e t 有更高的吸附容量。 论文对吸附剂的各种制备方法中配基接枝反应的条件进行了详细研究。如温 度、时间、介质的p h 、单体浓度等。例如，在作为间隔臂和桥连剂的戊二醛与 硅胶上端胺基的反应中，温度和介质的p h 有很大影响。当反应温度低于5 0 0 c ， 介质的p h 为中性条件时，二者加成所得产物中的活性醛基相对含量较高。而在 高温和碱性环境下反应时，戊二醛会发生自聚，虽然用t g a 测得的戊二醛在硅 胶上的含量较高，但活性醛基的含量却很低。因此，反应条件的控制十分重要。 论文研究了不同方法制备的亲和吸附剂对e t 的吸附特性。发现以硅胶为载 体，组氨酸为配基的亲和吸附剂在水中对e t 的等温吸附符合典型的l a n g m u i r 模型，吸附过程约2 h 达平衡。其饱和吸附量g 埘和表观解离常数凰分别为1 1 9 4 “g g 和1 3 5 1 0 母m 。该吸附剂在血清或蛋白溶液中对e t 的去除率大于8 5 ， 且对血清中各成份的非选择性吸附很小，具有良好的血液相容性。p v i 一接枝得到 的吸附剂对e t 吸附8 0 m i n 可达平衡，吸附动力学符合二级方程，且速率常数兢 随起始e t 浓度的增高而降低。e t 在p v i s i l i c ag e l 粒子表面的等温吸附较好地 满足f r e u n d l i c h 方程。测得常数厨为1 0 9 6 ，? 一1 3 5 。在更高的e t 初始浓度下， 该吸附剂的等温线行为呈现b i m o d a l 型，与文献报道的以聚合物为配基的吸附剂 的典型等温线相似。吸附剂的平衡吸附率随温度升高略增。在中性条件下， p v i s i l i c ag e l 吸附剂对b s a 蛋白溶液中的e t 去除率大于9 6 。 本论文的研究表明，硅胶是一种适用于制各e t 亲和吸附剂的优良载体。以 乙烯基咪唑为活性配基，以硅胶为载体制成的亲和吸附剂对e t 具有良好的吸附 选择性和去除能力，且较少受介质的p h 和离子强度的影响。制备简便，性能稳 定，是一种具有良好应用前景的亲和吸附剂。 a b s t r a c t n o ww i t ht h er e s e a r c hd e v e l o p m e n ti nf i e l do fb i o m e d i c i n ea n db i o e n g i n e e r i n g ， m o r ea n dm o r ei n l p o r r t a n c ea r ea t t a c h e dt ot h ec l e a r a n c eo ft r a c eh a z a r d o u ss u b s t a i l c e s p o s s i b l ye x i s ti i lt h ep r o d u c t e n d o t o x i ni sak i n do fp o t e n t i a lc o n t 锄i n a n tb r o a d l y e 虹s t i n ge v e r ) ，、h e r ea n dm a yc a u s es e r i o u sp y r o g e m ca i l ds h o c kr e a c t i o n s s ot 1 1 e r e m o v a lo fe n d o t o x i nf r o ms y s t e me s p e c i a l l yf r o mt h eb i o p r e p a r a t i o n si sb e c o m i n g i n c r e a s i n g l yc m c i a la n dh a l sr e m a i n e da ni m p o 心m tr e s e a r c ha i m a m o n gt h e s em ee t r e m o v a lf r o mm a c r o m o l e c u l a rs u b s t a n c e c o n t a i n i n gs o l u t i o n si sr a t h e rd i m c u l t t i u n o w o n l yal i 砌em e t h o da 1 1 dm a t e r i a lh a sg a i n e dp r a c t i c a la p p l i c a t i o nw h i c h ，h o w e v e r ， s u 船r sf r o ml o wr e m o v a le 历c i e n c ya n dh i g he x p e n s e s ot h es t u d yi nt h i sf i e l di ss t i u v a l u a b l ea n ds i g n m c a t i v e t h et h e s i so ft h i sd i s s e i r t a t i o nc o m e sf r o mam e d x 如n dc o o p e r a t i v ep r o g r a mo f f u d a nu n i v e r s i t ya n dz h o n g s h a nh o s p i t a l a c c o r d i n gt ot h ep r o b l e m so fm ep r e s e n t e ta f | i n i t ) ，a d s o r b e n t ，s o m en o v e la 伍n i t ya d s o r b e n t sf o re tr e m o v a lw e r ed e v e l o p e d i i lt h i sd i s s e r t a t i o ns t a r t i n gw i t hm a t r i xa n dl i g a i l d ，w h i c hw e r ep r o v e nt oh a v eh i g h a d s o 印t i o nc a p a c i t y ，s e l e c t i v i t y a n dc o m p a t i b i l i t ) ，t ob l o o d a n dt h e s t u d yo n p r e p a r a t i o na n de ta d s o 叩t i o np r o p e n i e so ft h e s ea d s o r b e n t sc o u l dp r o v i d er e f e r e n c e f o r t h em r t h e rd e s i g no fe tr e m o v a lm a t e r i a l s a sf o rt h em a t r i x ，t h ep o r o u ss i l i c ag e lw a sm a i n l ys e l e c t e da i l dt h ei n n u e n c eo f i t sp o r es i z ea n ds p e c m cs u r f a c ea r e ao nt l l ep r o p e r t yo ft h er e s u l t a n ta d s o r b e n tw a s s t u d i e d h i sw a su s e da u sl i g a n dh e r e ，a n dw a sg r a r e do nt h ek h 550m o d i f i e ds i l i c a g e lt h r o u g ht h el i n kw i t hg l u t a r a l d e h y d e ( g l u ) t h eg r a r i n gy i e l do ft h em n c t i o n a l g r o u pi ne a c hs t e pw e r es t u d i e db ym e a n so fi r ，t h e n n o g r a v i m e t r i ca n a l y s i s ( t g a ) ， e l e m e n t a la n a l y s i sa n dc h e m i c a lt i t r a t i o nm e t h o d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eg r a r i n g y i e l do fe a c hr e a c t a mo ns i l i c ag e li sa 蜀陀c t e db yt h ep o r es i z ea n ds p e c i f l cs u r f a c e a r e ao ft h es i l i c a g e lm a t r i x ，a n dd u r i n gt h es u c c e s s i o n a lr e a c t i o n st h ep o r es i z e c o n t i n u a l l yd e c r e a s e s s i n c ee th a sal a r g em o l e c u l e ，i ti sb e t t e rt oc h o o s et 1 1 em a t r i x w i t hal a r g e rp o r es i z et oa l l o wt h ed i 伍l s i o no fe ti n t ot h ei n t e m a lp o r ew a l l sa 1 1 dt o b ec a t c h e db yt h el i g a n do ni t a sf o rt h el i g a j l d ，t h r e el i g a n d sw e r ei n v e s t i g a t e di nm i sd i s s e r t a t i o n t h e ya r e ： h i s t i d i n e ( h i s ) ，w h i c hh a sb e e nl a r g e l yr e p o r r t e di nl i t e r a t u r e ；v i n y l i m i d a z o l e ( v i ) ， s e l e c t e dh e r e 厅o mt h ee l i c i t a t i o no ft h ea 街n i t ym e c h a n i s mo fi m i d a z o l eg r o u pi nh i s ； a n dt h ee p o x yg r o u p c o n t a i n i n gc o m p o u n d ，d i s c o v e r e dd u r i n go u re x p e r i m e n t t h e a c t i v es i t eo fh i sa i l dv ia r eb o t hi m i d a z o l eg r o u p ，b u th i sa l s oh a sr e a c t i v ea m i d o a n d c o o hw i t hn e g a t i v ec h a r g e n e 垤a n do b t a i n e d 舶mv ig r a rp o l y m e r i z a t i o n o ns i l i c a g e li s al ( i n do fp o l y m e 订cf 0 肋t 1 1 r o u g hc o m p a r i s o nb e t w e e nt h ee t r e m o v a lp e r f o 咖a n c eo ft h ea m n 时a d s o r b e n tw i t hh i sa n dp v ia sl i g a n dr e s p e c t i v e l y ， am u c hh 迢h e rc 印a c i t y ，e m c i e n c ya n dm u c hb e t t e ra p p l i c a b i l i t yi nt e 肌so fp ha n d i o n i cs t r e n g t lo fp v il i g a n dw a sf o u n d ，w m c hp r o v e sn o to n l yt h eh i g ha m n i t ) ，o ft h e a c t i v ei m i d a z o l eg r o u pt o w a r de t ，b u ta l s ot l l el e a d i n gf h n c t i o no fi o n i ci n t e r a c t i o n b e 觚e e nl i g a n da n de tm o l e c u l e 1 1 1 ee p o x y c o n t a i n i n gc o m p o u n ds u c ha sk h 5 6 0o r g m af o ru s ea l se tl i g a n dh a sn e v e rb e e nr e p o i r c e dy e t i tw a sf o u n dm a to n c et h e e p o x yg r o u pw a so p e n e d ，t h er e s u l t a n ta d s o r b e n tc o u l d n ts h o we tr e m o v a la b i l i t y a n yl o n g e r ，w 1 1 i c hv e r i f i e st h e 如n c t i o no fe p o x yg r o u p t h i sf i n 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t i o no fg l uw i t h a m i d o s i l i c ag e lw a sf o u n dt ob eg r e a t l yi n l l l u e n c e db yt e m p e r a t u r ea n dp hv a l u eo f t h er e a c t i o nm e d i u m a tt e m p e r a t u r el o w e rt h a n5 0 a n di nn e u t r a lp h ，t h eh i 曲e s t c o n t e n to fa c t i v e c h oc o u l db eo b t a i n e d a th i g h e rt e m p e r a t u r e st h a n5 0 a n d m o r eb a s i cc o n d i t i o n s ，s e l f - p o l y m e r i z a t i o no fg l uw i l lo c c u r ，a u l dt h ec o n t e n to f c h 0d e c r e a s e dd e s p i t em eh i g hg r m i n gy i e l do fg l ub yt g a a g a i n ，i nt h eg r a r r e a c t i o no fp v i ，as e r i e so fa d s o r b e n t sw i t hp v ic o n t e n t ( g r a r i n gd e g r e e ) 行o m1 1 t o16 c o u l db eo b t a i n e db yc h a n g i n gt h ec o n d i t i o n s ，w h i c hs h o w e dd i 雎r e n te t v r e m o v a le 街c i e n c y s ot h ec o n t r o lo fr e a c t i o nc o n d i t i o n si si m p o n a n t t h ee tr e m o v a lp r o p e i r t i 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c u l a t e dt o b el0 9 6e u m ga i l d 1 35 t h ea d s o 叩t i o nk i n e t i c s 、v a sw e l la c c o r d e dw i t ht h es e c o n do r d e r e q u a t i o n t h e e q u i l i b r i u me ta d s o 印t i o ne m c i e n c yi n c r e a s e ds l i g h t l yw i t hm et e m p e r a t u r e t h es t u d yo ft h i sd i s s e n a t i o nr e v e a i st i l a ts i l i c ag e li sag o o dm a t r i xf o re t a m n i t ya d s o 印t i o np r e p a r a t i o n ，a n dp v i s i l i c ag e la d s o r b e n ti s p r o m i s i n gi ne t r e n 】o v a l 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：苤遨 日期：2 咀艟坌争 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：型! 遂丝导师签名： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 内毒素的来源与生物学活性 内毒素( e n d o t o x i n ，又称热原质p y r o g e n ) 和外毒素( e x o t o x i n ) 是细茵产生的两 大类毒素物质。外毒素是病原菌在代谢过程中分泌到菌体外的物质。产生外毒素 的细菌主要是一些革兰氏阳性细菌，例如金黄色葡萄球菌、白喉杆菌、破伤风杆 菌等。外毒素的化学成分是蛋白质，其毒性很强、极不稳定，各种细菌产生的外 毒素对组织的毒性作用有高度的选择性，各自引起特殊的临床症状。外毒素对热 和某些化学物质敏感，容易受到破坏。6 0 8 0 下3 0 m i n 或用3 4 的甲醛 溶液处理，其毒性完全消失。外毒素的抗原性较强，能刺激机体产生抗毒素【l 】。 1 8 9 2 1 8 9 5 年，鼬c h a r dp f e i 脏r 【z j 发现，热灭活的霍乱弧菌( h r i oc h o l e r a e ) 溶解物中，含有一种毒性成分，能引起实验动物休克和死亡。为了与霍乱弧菌所 分泌的不耐热外毒素相区别，他将此热稳定的物质称为内毒素。1 9 5 6 年，美国生 物学家b a n g 报道，革兰氏阴性细菌或其抽取物可导致鲎血凝固，而革兰氏阳性 细菌却没有这样的作用。半个多世纪以来，人们研究逐渐发现，内毒素是革兰氏 阴性菌在生长、分裂时释放或死亡时裂解出来的细胞壁外膜上的特有结构。内毒 素分子覆盖在菌体表面，形成一个疏水障碍层，可以保护菌体免受宿主固有的防 卫因子( 如补体、溶菌酶、阳离子蛋白质等) 的伤害。也有极少数革兰氏阴性菌 没有内毒素，但它们携带别的两亲性分子代替内毒素。由于革兰氏阴性菌非常顽 固，在水中只需极少的养分即可存活，因而内毒素广泛存在于饮用水、食品、生 物医药制剂中及接触水溶液的器壁上【3 】；在高等生物体内，内毒素平时为机体门 脉血中的正常存在，栖居在胃肠道下端的革兰氏阴性菌属是生物体内毒素的主要 来源。当细菌受到抗生素或补体膜攻击复合物攻击后会死亡即而释放大量的内毒 素进入血循环而引起一系列病理变化。因而无论在生物体内的体液和细胞成分 中，还是在体外的各种溶液中，内毒素都显示出广泛的生物学活性，位居所有毒 素之冠【4 ，5 1 。 内毒素是一种毒性极强的致炎和热原物质，是内毒素血症及感染性休克的主 要致病介质，会诱发全身炎症反应综合症( s i r s ) 、多器官功能衰竭综合症 ( m o d s ) 、脓毒症等导致各年龄组重要死亡的疾病；当机体内毒素浓度固值 0 0 0 5 n g m 1 时，可诱生内源性热原质如肿瘤坏死因子( t n fa ) 、白细胞介素( i l 一1 ) 、 一氧化氮( n o ) 和b2 干扰素( t f n p 2 ) 等细胞因子的释放，从而刺激体温调节中 枢导致机体发热，还可引起微血管栓塞、血压骤降、糖及脂肪代谢紊乱、骨髓坏 死或导致血管内芽肿甚至血凝，造成致病过程中的“瀑布效应”【6 j 。医院临床在 第一章绪论 使用药品注射剂时若含细菌内毒素 1 e u m l ，则病人会产生寒战、发热、呕吐、 肤色灰白、休克甚至死亡等热原反应，因此国家药典对注射品中细菌内毒素指标 有着严格规定，其限度水平为每单位体重5 e u f 7 】。 1 2 内毒素的结构与理化性质 1 2 1e t 的化学结构 f i g 1 一ls c h e m a t i cv i e wo ft h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo f e n d o t o x i nf o me c o ，fol ll ：b 4a c c o r d l n gt o o h n oa i l dm o r r i s o n h e p ，l g l y c e m - d - m a n n o - h e p t o s e ；g a l ，g a l a c t o s e ；g l c ，g l u c o s e ；k d o ， 2 k e t o 一3 - d e o x y o c t o n i ca c i d ；n g a ，n a c e 哆i g a i a c t o s 锄i n e ；n g c ，n a c e t ) r l g l u c o s 锄i n e 内毒素( e t ) 的化学成分比较复杂，是一个异质多聚体，其本质是脂多糖 ( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) ，包括类脂a ( 1 i p i da ) 、核心多糖、o 特异性抗原多 糖( o a j l t i g e n ) 三个组成部分，其中类脂a 由磷酸葡糖胺双糖主链和与之共价结合 的1 0 1 8 碳的长链脂肪酸组成，即同时含有疏水性的中心及亲水性的边沿，是一 种双性分子，又是酸碱两性分子，其结构示意图见1 1 所示0 1 。不同种属的细 2 第一章绪论 菌，均具有基本一致的类脂a 骨架，是内毒素中最为保守的部分。并且类脂a 具有完整内毒素的特性，是l p s 的活性中心，对人体健康的危害也最大。核心多 糖由连接0 。特异性链的外核部分和连接类脂a 的内核部分组成。外核部分主要 由己糖和庚糖组成，具有较高的糖异源性，某些革兰氏阴性菌核心组分的不同多 发生在该结构部分中的己糖分子上。而内核部分则相对稳定，主要由k d o ( 2 酮 基3 脱氧d 甘露醇型辛酮糖酸) 和庚糖构成。o 特异性链是由4 4 0 个重复齐 聚糖单元组成，每个齐聚糖单元由3 8 个单糖分子构成。o 特异性链具有菌体特 异性，有些内毒素不存在o 特异性链，这并不影响和损害它的生物活性。o - 特 异链的结构是内毒素分子中最易发生变化的部分，如：它的单糖分子可被乙酰化， 糖基化，也可变换重复单元的数目。不同菌种的o 特异链不同，因此它的抗原 具有菌种的特异性。细胞外膜上内毒素种类的活跃改变起到自我保护的作用，可 以适应周围环境的改变【l 。 在通常的p h 条件下，内毒素分子中的糖残基被部分磷酸化( p k l = 1 3 ，啦= 8 2 ， 旷3 1 ) ，磷酸根基团和l o 携带大量负电荷，因此内毒素分子一般在溶液中显 示负电性【1 2 1 。 1 2 2e t 的立体构型( 超分子结构) 内毒素类脂a 部分相对分子质量约为2 0 0 0 ，l p s 亚基( 单体) 分子量约为 1 万到2 万。由于其结构中脂质a 相邻烷基链之间的疏水性作用，使得在水溶液 中内毒素倾向于以高分子聚合物的状态存在，以片状、立方或六方形式形成胶束 ( m i c e l l e s ) 、囊包( v e s i c l e s ) 或聚集成分子量几十万到几百万不等、直径为o 1 p m 数 量级的聚集体，尤其环境中存在的c a 2 + 、m 9 2 + 二价阳离子会被吸引到带负电荷 的脂多糖上和磷酸盐之间形成架桥作用而使聚集体得以稳定。在早期的研究中， 人们对内毒素的超分子结构描述就已相当形象，电镜照片显示内毒素有蛇形、细 丝状或板状等各种形状。用现代的分析手段，如：x 射线衍射、f t i r 、中子散射、 n m r 以及分子模拟可展示出内毒素更加精细的三维结构，s 删a ij p 撕k h 【i 州用 f t i r 的方法研究了阳离子效应对水溶液中e t 聚集态的影响。当c a 2 + 、m g z 十从 环境中被去除时，e t 聚集体即分解成3 0 万1 0 0 万道尔顿的胶粒。利用表面活 性剂( 如t r i t o n x1 1 4 ) 、胆酸( 如脱氧胆酸) 和鳌合剂( 如e d t a ) 可以进一 步将团囊降解，释放出1 万2 万道尔顿的内毒素单体。在分子量小于l 万时， 内毒素不再聚合，丧失生物活性，不再具有致热能力【1 4 j5 1 。以上每一步都是可逆 的，内毒素单体与其聚集态结构之间的转化如图1 2 和1 3 所示【9 ，l0 1 。有些蛋白 质也可以使平衡移动从而使之解聚，并与其形成复合物，但这一过程的结果很难 预测，它依赖于蛋白质的性质( 静电荷，疏水性) 和溶液的性质( 如p h 值，离 子强度) 。 第一章绪论 m o n o m e r s 0 2 0 k d a 踹器裟曼温n s lm r o 1 m ) 或强氧化剂可以破 坏细菌内毒素6 | 。 l p s 在酸性溶液中置室温下，l p s 分子发生部分降解。这一变化主要涉及到 多糖与类脂a 问糖苷键的裂解，加热可促进这一反应。所以强酸溶液在加热条件 下可使l p s 彻底破坏。强碱性因素对l p s 分子的影响较大，此时类脂a 骨架上联 结的4 一磷酸酯键及3 与3 位上脂肪酸酯键易遭到破坏，使分子发生裂解，降解后 的分子便失去了典型的内毒素活性，l p s 被彻底破坏【l7 | 。 菪挎镶 一一一一 第一章绪论 1 3 内毒素的去除方法简介 生物工业中革兰氏阴性细菌被广泛用来生产重组d n a 产品如多肽和蛋白 质，因此内毒素是大多数生物原料和制剂的污染源。一般l o 的湿菌浓度可产生 几万e u m l 的内毒素。各种血液制品和细胞培养基在制备过程中也会或多或少地 被污染。严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内 毒素脂多糖都有热原活性【l8 1 。因而在实际的生物基因工程生产中，如何保证生 物新药热原安全是普遍受关注的问题。在临床上，目前对内毒素诱发的疾病的治 疗主要是针对致病过程中产生“瀑布效应”的三个主要环节：即刺激因素( e t ) ； 炎症介质( 肿瘤坏死因子t n f a ，白细胞介素i l 1 ) ；靶细胞( 白细胞等) 。临 床上使用了强有力的抗生素、血管活性药物和支持疗法，但抗生素不仅抗e t 效