基因工程的原理和技术43838

1 2基因工程的基本操作程序 专题一基因工程 补充 基因的结构 基因的定义 遗传效应是指能转录为mRNA 继而翻译为蛋白质 或转录为核糖体RNA 转运RNA的功能 什么是遗传效应 基因是有遗传效应的DNA片段 是决定生物性状的基本单位 染色体 蛋白质 DNA 基因 线性排列 脱氧核苷酸 磷酸基 脱氧核糖 含氮碱基 遗传物质的主要载体 具有遗传效应的DNA片段 DNA的基本单位 基因 DNA 染色体 脱氧核苷酸的关系 原核生物的基因结构 编码区 能转录为相应的mRNA进而指导蛋白质的合成 非编码区 不能转录为相应的mRNA但有调控遗传信息表达的核苷酸序列 位于编码区的上游和下游 区分 启动子与起始密码终止子与终止密码 起始密码 终止密码 启动子 终止子 ATC 基因 转录区 TAA 转录 ATC 转录起始点 翻译起始点 转录终止点 RNA起点 RNA终点 真核生物的基因结构 信使RNA 成熟的信使RNA 1 简述基因工程原理及基本操作程序 2 尝试设计某一转基因生物的研制过程 学习目标 基因操作的基本步骤 提取目的基因目的基因与运载体结合 基因表达载体的构建 3 将目的基因导入受体细胞4 目的基因的检测与鉴定 基因工程的操作步骤 目的基因的获取 表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 基因工程的原理 按照人们的愿望 进行严格的设计 通过体外DNA重组和转基因等技术 赋予生物以新的遗传特性 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 如 抗虫基因 抗病基因 人胰岛素基因 人干扰素基因等 温故知新 为什么要有这一步 基因工程的操作步骤 第一步 获取目的基因 1 目的基因 主要是指编码蛋白质的基因 例如 与生物抗逆性相关的基因 与优良品质 生物药物和保健品 毒物降解以及工业用酶相关的基因等 也可以是一些具有调控作用的因子 基因工程的操作步骤 第一步 获取目的基因 2 现代获取方法 从基因文库中获取目的基因 目的基因的序列未知 利用聚合酶链式反应 PCR 技术扩增目的基因 目的基因的序列部分已知 人工合成目的基因 目的基因的序列已知 基因较小 初始目的基因的来源 从生物中直接获取 人工合成 获取目的基因方法 从基因文库中获取目的基因 基因文库 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段 导入受体菌的群体中储存 各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 称为基因文库 某生物体内全部DNA 许多DNA片段 受体菌群体 基因组文库 某种生物某个时期的mRNA cDNA 受体菌群体 部分基因文库 cDNA文库 基因组文库与cDNA文库的比较 小 大 无 无 有 有 可以 部分基因可以 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 如何从基因文库中获取目的基因 就像从图书馆借一本书 要知道书名 作者 出版社或人物情节等信息一样获取目的基因前 要对这个基因的背景有一定程度的了解 如核苷酸序列 基因的功能 位置以及基因的表达产物的特性等 然后通过恰当的技术手段将目的基因从基因文库中调取出来 获取目的基因方法 利用PCR技术扩增目的基因 全称是 多聚酶链式反应 在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 可以在短时间内大量扩增的目的基因 DNA复制的过程涉及DNA双链的方向 通常将DNA的羟基 OH 末端称为3 端 而磷酸基团的末端称为5 端 DNA复制的方向 3 端 5 端 5 端 3 端 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA 只能从3 端延伸DNA链 因此 DNA复制需要引物 当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后 DNA聚合酶就能从引物的3 端开始延伸DNA链 DNA的合成方向总是从子链的5 端端向3 端端延伸 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 复习 DNA复制 DNA复制的过程 1 解旋 利用细胞提供的能量边解旋 边复制2 配对 分别以每条单链为模板 以四种游离的脱氧核苷酸为原料 利用碱基互补配对原则合成两条新的子链3 螺旋 两条子链分别与对应的模板链绕成螺旋型 构成两个新的DNA分子 DNA复制方式 半保留复制 思考 DNA复制需要哪些成分和反应条件 如何在体外设置一个类似的DNA复制环境 DNA双链复制的原理 遵循碱基互补配对原则 含待扩增目的基因片段的DNA模板 根据目的基因双链各一端序列片段合成与两条模板链相结合的两种引物 要有耐热的DNA聚合酶 Taq酶 四种单核苷酸 dCTP dGTP dATP dTTP 基本条件 PCR技术依据的原理 DNA热变性的原理 前提条件 有一段已知目的基因的核苷酸序列 1 DNA变性 加热至90 95 DNA片段受热后氢键断裂 形成单链 2 复性 冷却至55 60 引物结合到互补DNA链 3 延伸 加热至70 75 耐热的DNA聚合酶从引物起始引导互补链的合成 PCR第一轮过程 结果 使目的基因在短时间内成百万倍的扩增 目的基因以指数方式扩增 即2n 获取目的基因方法 DNA合成仪用化学方法直接人工合成 根据已知的氨基酸序列推知DNA序列 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 目的基因 前提条件 基因比较小 核苷酸序列已知设备 DNA合成仪 目的基因的获取 表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 单独的目的基因 DNA片段 是不能稳定遗传的 为了使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可以遗传给下一代 同时使目的基因能正常表达和发挥作用 必须构建表达载体 温故知新 为什么要有这一步 基因工程操作步骤的必要性 第二步 基因表达载体的构建 基因工程的核心 构建目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可以以传给下一代 基因表达载体的组成 目的基因 启动子 终止子 标记基因等 基因表达载体 启动子 位于基因的首端 是RNA聚合酶识别和结合的部位 有了它才能驱动基因转录出mRNA 最终获得所需蛋白质 终止子 位于基因的尾端 使转录在所需要的地方停止下来 标记基因 为了鉴别受体细胞中是否含目的基因 从而筛选出来 如 抗生素抗性基因 目的基因 标记基因 质粒 DNA分子 限制酶处理 两个切口获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 重组质粒 同种 一个切口两个黏性末端 为什么不能将目的基因直接导入受体细胞 通过cDNA文库获得的目的基因有启动子和终止子吗 在构建表达载体 重组DNA分子 过程中需要什么分子工具 只考虑两两结合 可产生几种重组DNA分子 三种 不能稳定存在并表达 cDNA文库的目的基因中没有启动子和终止子 目的基因的获取 表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞 并且维持稳定和表达 才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化 温故知新 为什么要有这一步 基因工程操作步骤的必要性 第三步 将目的基因导入受体细胞 转化 目的基因进入受体细胞内 并在受体细胞中维持稳定和表达的过程 称为转化 常用的受体细胞 动植物细胞和大肠杆菌 枯草杆菌 酵母菌等微生物 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 转化 农杆菌特点 生活在土壤中 能够在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物 受植物体伤口处的细胞分泌的大量酚类化合物的吸引 农杆菌中的Ti质粒上的T DNA可转移至受体细胞 并整合到受体细胞染色体的DNA上 1 将目的基因导入植物细胞 a 农杆菌转化法 采用最多的方法 原理 将目的基因插入到Ti质粒的T DNA上 通过农杆菌转化 使目的基因进入植物细胞 并将其插入到植物细胞染色体的DNA上 使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达 优点及应用 此法比较经济和有效 约80 的转基因植物都是通过这种方法获得 我国科学家独创的一种方法实例 我国的转基因抗虫棉 1 常用于单子叶植物的基因转化 2 缺点 成本较高 基因枪法 花粉管通道法 2 将目的基因导入动物细胞 提纯基因表达载体 受体细胞 显微注射技术 基本操作程序 原因是 受精卵全能性较高 可使外源基因在相应的组织细胞内表达 受精卵 最常用的方法 1 早期基因工程为什么选用原核生物作为受体细胞 原核生物繁殖快 多为单细胞 遗传物质相对较少2 应用最为广泛的受体细胞是大肠杆菌3 方法 3 将目的基因导入微生物细胞 a 用Ca2 处理细胞 以增加细菌细胞壁的通透性 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 这种细胞称为感受态细胞 b 是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合 在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子 完成转化过程 思考4 利用大肠杆菌能生产人的糖蛋白吗 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链 这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成 大肠杆菌是原核生物 不存在这两种细胞器 因此在大肠杆菌生产这种糖蛋白是不可能的 1 将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 2 将目的基因导入动物细胞 显微注射技术 最多 最有效 3 将目的基因导入微生物细胞 Ca2 处理 花粉管通道法 小结 基因工程操作步骤的必要性 目的基因的获取 表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 因为并不是所有受体细胞的DNA都接纳了目的基因 也并不是所有插入的目的基因都能正确表达 因此需要筛选 只有通过检测和鉴定 才能得知目的基因是否能够在受体细胞中稳定存在和正确表达 温故知新 为什么要有这一步 第四步 目的基因的检测和鉴定 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 DNA分子杂交 DNA分子杂交技术 小组交流 阅读教材14页 讨论什么是DNA分子探针 检测时探针通过什么原理来检测目的基因 探针是一小段单链DNA或者RNA片段 约20到500bp 用于检测与其互补的核酸序列 根据重组质粒上目的基因的部分DNA序列 人工合成 或PCR技术合成 与之互补的一小段单链DNA 或RNA 利用带有32P 磷酸的dATP使其标记上放射性同位素 这一小段与目的基因的部分序列互补的核酸分子称为DNA探针 什么是DNA分子探针 DNA分子杂交技术 互补碱基序列的DNA分子 可以通过碱基对之间形成氢键等 形成稳定的双链区 DNA分子杂交的双方是所使用的探针和要检测的核酸 DNA分子杂交的理论基础是 基因探针与目的基因杂交 观察标记有无杂交带 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交 不能 受体细胞必须合成相应的蛋白质或表现出特定的性状 才能说明目的基因完成了表达 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗 若不能表达 要对抗虫基因再进行修饰 第四步 目的基因的检测和鉴定 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 DNA分子杂交 分子杂交 抗原 抗体杂交 分子水平检测 抗原 抗体杂交 从转基因生物中提取蛋白质 用相应的抗体进行抗原 抗体杂交 若有杂交带出现 表明目的基因已形成蛋白质产品 以上检测是分子水平 有时还需进行个体生物学水平的鉴定 如对植物的抗虫抗病特性的鉴定等 第四步 目的基因的检测和鉴定 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 是否赋予个体新的遗传特性 DNA分子杂交 分子杂交 抗原 抗体杂交 分子水平检测 个体水平鉴定 基因工程的基本操作程序 1 目的基因的获取 2 形成重组DNA分子 3 将目的基因导入受体细胞 4 筛选含有目的基因的受体细胞 目的基因表达 1 从基因文库中获取目的基因2 利用PCR技术扩增目的基因3 化学方法人工合成 农杆菌转化法 基因枪法 显微注射法 Ca2 处理法 DNA分子杂交技术 抗原 抗体杂交技术 分子检测外的个体水平鉴定 小结 将目的基因插人土壤农杆菌的质粒 构建表达载体 通过农杆菌的转化导人香蕉受体细胞 成功转化的香蕉细胞通过组织培养形成植株 生态安全问题包括 外源基因扩散到其他物种 外源基因漂移 转基因植株扩散影响生态系统的结构和功能 转基因植株扩散对生物多样性的影响 转基因植物残体或分泌物对环境的影响 如何利用目的基因 通过转基因技术获得抗寒能力提高的香蕉植株 在运用转基因香蕉的过程中 在生态安全方面可能会出现什么问题 列举两点 cDNA 成熟的编码蛋白的mRNA分子 加入逆转录酶 反转录mRNA 合成一条与其互补的DNA单链分子 在DNA聚合酶的作用下 以第一条DNA单链为模板合成第二条单链 知识扩展 基因的结构 真核生物基因结构 原核生物基因结构 真核生物基因控制蛋白质合成的过程 所谓文库 是指一种全体的集合 基因文库则是指某一生物全部基因的集合 构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来 更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径 对于复杂的染色体DNA分子来说 单个基因所占比例十分微小 要想从庞大的基因组中将其分离出来 一般需要先进行扩增 所以需要构建基因文库 在很多情况下目的基因的分离都离不开基因文库 此外基因文库也是复杂基因组作图的重要依据 难点释疑 基因文库 基因组文库与cDNA文库 基因组文库 包含某