（植物学专业论文）云芝产漆酶的发酵条件、分离纯化及特性研究.pdf

摘要 漆酶 l a c c a s ee c l 1 0 3 2 是一种含铜的多酚氧化酶 1 8 8 3 年首次从漆树漆液中被发 现 随后发现广泛存在于自然界中 已发现植物 真菌 昆虫以及细菌能产生这类酶 其 中最重要的生产者是担子菌中的自腐菌 漆酶可催化酚类化合物和芳香胺的氧化 而且在 还原介体物质存在下 漆酶的底物范围可进一步地扩大 1 0 0 多年来 漆酶一直是生物学 化学和环境科学等领域十分活跃的研究热点 其中最受重视的是漆酶在木质素降解中的重 要效用 随着研究的深入 漆酶在含酚废水的处理 环境中酚类毒物的降解 饮料加工 食用药用菌生产 饲料工业 医药卫生等方面的应用日渐普及 漆酶的研究涉及生物 化 学 物理 医学 食品 环境等多个学科 所以对漆酶进行深入系统研究不仅具有极大的 理论价值 而且也会产生巨大的社会和经济效益 本文主要从以下几个方面进行概述和研 究 1 主要概述了木质素降解酶系中漆酶的研究进展 对木质素降解微生物 酶类进行了分 类说明 尤其对漆酶的生化特性 分子结构 反应机理及其分子生物学研究现状进行了系 统的综述 最后对漆酶的应用进行全面阐述 2 首先确认云芝漆酶为分泌型胞外酶 考察了产酶与生物量之间的关系 确定产酶高峰 期 然后对不同的碳源 氮源 初始口h 接种量 装液量 表面活性剂 诱导剂与云芝 发酵产酶量进行单因素比较 继而设计正交试验 确定最佳的发酵产酶条件 同时考察备 因素主效应与产酶的显著差异 试验结果表明 葡萄糖7 5 9 l 酵母粉6 9 i 吐温 8 0o 2 v v q l s 0 4 5 h 2 0 浓度o 0 5 衄o l 愈创木酚2 g l 初始p h 4 5 2 5 0 m l 三角 瓶中装液体培养基1 0 0 蚰时 为最佳发酵培养条件 酶活力显著提高 初始p h 对产酶的 影响达到极显著水平 酵母粉 吐温 8 0 对产酶的影响均达到显著水平 3 主要研究了云芝漆酶的分离 纯化及鉴定 首先确认粗酶液至少含有两型漆酶同工酶 l a c a l a c b 粗酶液在8 0 州乜 2 s m 盐析后 经d 队es e p h a m s ef a s tf 1 0 w 层析柱 s e p h a d e x g 1 0 0 柱层析两步层析 得到电泳纯组分l a c a h c b 得率分别为1 0 4 2 1 3 9 1 分子量分别为6 5 k d 5 9 k d 对两个组分利用特异反应 原子吸收光谱 蛋白 质n 端序列的测定进行鉴定 结果证实这两种组分应属于漆酶家族 肽指纹图谱的分析结 果也支持这一结论 4 主要研究了p h 值 金属离子 温度对云芝漆酶l a c a 和l a c b 反应速率和稳定性的影 响 以及酶底物的浓度效应和j i 值 实验结果表明 c i l c 0 2 对h c a 和l a c b 有激 活作用 而a g 十则有抑制作用 l a c a l a c b 反应最适p h 为4 o 和4 8 l a c a 在p h 3 6 4 8 l a c b 在p h 4 o 5 2 表现较好的稳定性 k a 和h c b 的最适反应温度分别为5 0 和4 0 b c a 和l a c b 的j 锄值分别为o 3 2 1 0 m o l l o 1 3 9 1 0 m o l l 5 主要是云芝漆酶与纤维素酶 木聚糖酶的协同作用对提高木质纤维索利用效率的研究 及云芝发酵粗酶液 漆酶l a c a 和l a c b 对不同分子结构类型的多种染料脱色的探讨 漆 酶的应用提高木质纤维素降解率 发酵租酶液具有广谱脱色作用 尤其对孔雀石绿 r b 亮蓝的脱色率都超过了8 5 脱色较为彻底 漆酶l a c a 和l 丑c b 对三苯甲烷类染料亮绿 孔雀石绿脱色率都超过了9 0 而两种漆酶之间在脱色程度上表现出一定的差异 关键词 漆酶 发酵条件 正交试验 分离纯化 离予交换层析 凝胶过滤层析 肽指 纹图谱 砌 脱色 a l b s t r a c t l a c c a s e e c l 1 0 3 2 i sc o p p e r c o n t a i n i gp o l y p h e n o l o x i d a s e sf o u n di i lt h el a c q u e r t r e e s e c r e t i o nf o rt h ef i r s tt i m ei n1 8 8 3 a f t e r w a r d si tw a sf o u n di np l a n t f u n g i i n s e c ta n d b a c t e r i u m a m o n gt h 锄t h em o s ti m p o n 卸tp f o d u c e fi s6 甜汹m 掣c 啦i 1 1t l l ef 1 1 l l g l l s al a r g cn u m b e ro f p h e n o ic h e m i c a lc o m p o u d sa n do x j d i z e 缸謦卸t 蛐i n ec a l lb ec a t a l y s e db y 丑c c a s e t h e p r c s e n c eo fr e d u c t i v em e d i a t o r t h es u b s t r a t em g ec a nb ec x p a n d e df i l n h e r f o r0 v e r1 0 0y e a r s l a c c a s ei sa l 眦y sr e s e a r c h e df b c u s eo ft t l ef i e l d so f b i o i o g y c h e m i s 仃ya n de n v i r o 枷e n t a l s c i e n c e e t c a m o n gt h 锄w h a tp a ym o s ta n e n t i o ni st h ei m p o n 卸tu t i l i t yo fl i g i n o l y t i c d e g r a d a t i o n w i t l lt h ed e v e l o p m e n to fs t u d y l a c c a s ei sa p p l i e dw i d e l yd a yb yd a yi nt h e t r e a m l e mo fp h e n 0 1w a s t ew a t e r e n v i m 衄e n t a lp h e n 0 1d e g r a d a t i o n b e v e m g ep m c e s s i n g m e p r o d u d n go fe d i b 王ea n dm e d i c a lf i l n g i l s f b d d 钉i n d u s 枉y m e d i c i n ea n ds a n i t a t i o n e t c 强e r e s e a r c ho fk l c 联堪ei v o l v e ss u c hf i e l d sa sb i o l o 凸c h e m i s 缸弘p h y s i c s m e d i c a ls c i e n c e f o o d 姐d 如v i m n m e m e t c s ot l l ed e e p c n n i i l gs y s t e m a t i cr e s e a r c h0 fl a c c a s en o to n l yh a sg r e a t t h e o r yv a l u eb u ta l w mp m d u c ee n o n n o u ss o c i e t y 柚de c o n o d 血cb e n e f i t s t h et c x ts 啪su p s e v e r a lf o l l o w i n gr e s p e c t sm a i n l ya n dr e s e 盯c h e s s e c h o o n e t h a t 也eb 嬲eo fl i 盟0 1 y 廿cd e g r a d a 廿o ne n z y m e sw a sr e s e a r c h e dc u 玎e n t s i t u a t i o na n dl i g n o l i cm i c 0 饿g a n i s u m sa n de n z y m e sw e f cm a i n l ys n 蛐撕z e d c s p e c i a l l yt h e s y s t e m a t i cs u e yt om o l e c u l ec h a r a c t e r i s t i c t h em c c h a n i s mo ft h es t m d u r e r e s p o n s ea n d m o l e c u l eb i 0 1 0 舀c a ls t u d yc u r f c n ts i t u a t i o no fl a c c a s ew a se x p a t i a t c d t h ew h o l e 印p l i c a t i o no f l a c c a s ew a se x p l a i n e d 矗n a l l y s e c n o nt w o f 打s n yt h a tia c c 器eo frv 已 s i c d j d i sc x t m c e l l u l 甜w a sc 0 n f i m e d t h e nr c l a t i o n o fp r o d u c i n ge n z y m ea n dd r y w e i 曲to fi 鼬c a s cb yd i 如r c n tt i m ew a sd e t c n n i n e d a n dw h e ni t p r o d u c e dt h el a c c a s ei i lp e a kw a sd e t e 咖i n e dt 0 0 t h e ne f l e c t o fd 拄f e r e mc a r b o ns o u f c e n i t r o g e ns o u r c c i n i t i a lp h i n o c 证a t i n ga m o u n t m e 锄0 u n to ff c 加q c n t a b l ec u n u r em e d i u m s l l r f a c e a c t i v ed e t e r g e n t r e v u l s a n to nl 丑c c 硒ep r o 血c t i o n 肋mzv e 坩f c 如 w e r es t u d i e d a i l d a i l a l y z i n gt h es i n g l ef a c t o rh n e a r l y t h e no r t h o g o n a lc x 呻佃e n tb 髂 d o nt h e8 b o v ew a s d e s i 驴e d f m a l l yt h eo p t i m a lf e c i n e n t a t i o nc o n d i t i o n s 妇k c a s e 弘o d u c t i o nw a sc o n 矗面e d a l l dt h er e m a r k a b l ed i 脑e n c co ft h em a j n 硪e c to fe v e f yf a 哟rs y n c h r o n o u s l yw a si n v e s t 培a t e d t 1 l et e s u ho ft h et e s ts h o w e d g l u c o s c7 5 9 l y e a s tp o w d e r6 9 l 1 w e e n 8 00 2 v 厂v c u s 0 4 5 h 2 0o 0 5 m m 0 1 l g i l a i a c o lo 2 g i n i t i a lp h 4 5 2 5 0 m lt r i a n g u l a rb o t t l ew h i c h l v w a sp u tf e 珊e n t a b l ec u l t u r cm e d i 砌a tt h e1 0 0 n l lf o r b e i n gt h eb e s tt of e r m c n t n d i t i o no f t r a i n i 岛t h el a c c a s ea c t i v i t i e sr a i s e dn o t a b l y h l 城a lp hh a dt h em o s tr e m a r k a b l el e v e l 蛆d n i t r o g e ns o u r c ey e 猫tp o w d e r t w e e n 8 0h a dt h er e l n a r k a b l el e v e lt ot l l ei n n u c n c co fp r o d u c j n g t h el a c c a s eo fzv e 船缸d 如r s e c t i o t h m e s t i i d i e so ni s o l a t i o n p 1 1 r i f i c a t i o na n di d e n t i f y i n go fh c c a s ew e r em a i n l y i n v e s t i g a t e d f i r s t l yf 锄e n t e dc o m p o l l i l d sc x i s t e dm ot y p e sb c c a s ei s o e n z y m e sk c aa n d l a c ba tt h el e a s tw a sc o n f i 蚰e d t h e mw e f cp u r i f i e db yt h es t e p so fa m m o n i u ms u l f a t e p r e c i p i t a t i o na t8 0 s a t l l r a t i o n i s d b 墟s e p h a r o s ef 稿tf 1 0 wi o ne x c h a n g ec l l r o m a t o g r a p h ya i l d s e p h a d e x g 1 0 0c h 删n a t o 掣印h y t h e ne l e c t r o p h o r e s i sp u r ec o m p o n e n tp a nl a c aa n dl a c b w e r eg o t t e n t h ep u r i t i e sw e r ei n c r e a s e dw i t ha no v e r a y i e l do f1 0 4 2 f o rl 丑c aa i l d1 3 9 1 7 f o th c br e s p e c t i v e l y n em o l e c u l 盯w e i 班s0 fl a c aa n dk c ba r e6 5 k d aa n d5 9 k d ai s d e t c m i n e d b ys d sg e le l e c t r o p h o r e s i s s d s p a g e r c s p e c t i v e l y h a v i n g i d e n t i f i e dt w o c o m p o n c n tp a n sb ym ep e c l l l i a rs u b s t r a 土cr e s p o n s et o t l l ea t o ma b s o r b ss p e 咖m t h es u e yo f t h ep r o t e i nn e n d 衄y t h er e s u l t ss h o w c dt h e mb c i n gp a no fl a c c 勰ef 觚l y t h e 髓a l y s i sr c s u l t o ft h cp 印t i d cm a p p i i l g 缅g e r p r i i i ts u p p o n c dt h i sc o n d u s i 蚰t 0 0 s e c t i o nf o u r t 1 l ee c to fp h m e t a li o a n dr c s p o n s et e m p c m t u r eo nz 坩坶f c 0 研l a c aa n d l a c ba c t i v i t ya l l ds t a b i l i t yw 勰s t u d i e di nt h es e c t i 0 m e 哪h i l e t h es u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n e f f e c to ft 王l i sl a c aa n dl a c bw a sa l s os t u d i c da i i dk mw a sm e a s u r e d t h er e s u l t ss h o w e d c u c 0 2 h a da c t i v a t i o n b u t a 矿h a d i n h i b i t 王0 no na c t i v i t y o f l a c a 柚dl a c b t h e o p t i m u mp h o fl 丑瞳w a s4 0a l l dl a c bw 船4 8 k a w a ss t a b l e 胁mp h 3 6t o4 8a i l dl a c bw a sf r o m p h 4 叭o5 2 t h e0 p t i m u mt e m p 啪t u r eo fl a c aw a s5 0 a n dl a c b w a s4 0 t h ej 砌o f l 丑c a w a sm e a s u r e do 3 2 术1 0 3 m o l l a n dl a c bw 髂0 1 3 9 木1 0 3 m o l l s e c t i 仙丘v e n i ss e c t i o n1 帆st h a tf 咖c n t e d m p o 岫d so fz v e 糟f c d w c r ee l l h a n c e d d e 铲a d a t i o nr a t et 0c e l l u l o s eu n d e rc e l l u l a s ea n dx y l a n a s e a n dt h a tf e m e n t e d m p o l l i l d so f z v p 昭泐如 w e f ea p p l i e di l ld e c o l o r i z i n gt h cd i 茌c r e mm o l c c u l 甜s t m c f u r em a n y1 i d so ft y p e d y e s t u f f sw 醛m a i l l l yr e s c a r c h i td 锄o n s 仃a t e dt h a tf 酊m t e dc o m p o u n d sw a sw i d es p c c t r i l m d e c o l o u r e df i l c t i o n e s p e c i a l l yt l l ed e c o l o r i i i gf a t eo f m a l a c h i t e r bb r ig h tb l u ew e r co v e r8 5 d e c 0 1 0 u 血gc o m p m t i v ec o m p l e t e ly m e a n w h j l es e p a r a t i n gp u r i f i c a t i o nb c a 锄dh c b 丘o m z 坩船f c d 三d w e r ea p p l i e di nd e c o l o r i z i n gd y e s t u f e st o o t h er c s u l to fs t u d yi n d i c a t e dt h a tm a l a c h i t e 伊e e na i l db 啦灿笋e e no ft h r c eb e n z e n cm e t h 孤ed y e s t u 船 i t sd e c o l o u r i n gr a t e h a de x c e e d e d v 9 0 d e c o l o u r e df u n d i o nc o i n p l e t e l ye v e nm o r e a i l dd c c o l o u r i n gd e g r e eo fl a c aa n dl a c bw a s d e m o n s t r a t c ds u r ed i f i b r e n c e 即o r d l a c c a s e f e 咖e n t a t i o nc o n d i t i o n s 0 r n l o g o n a le x p e r i m e n t p u r i f i c a t i o n l o n e x c h a n g ec h r o m a t o 簪a p h y g e lf i l 仃a t i o nc h r o m a t o 黟a p h y p e p t i d em 印p i n gf i n g e r p r i n t k m d e c o l o u r i z a t i o n l a c m n p l i p a b t s p a h b o d c o d d t t b s a n p 4 0 1 i i s s d s 1 4 c c a s e 缩略语表 漆酶 m a n g a n e s ep e r o x i d a s e木素过氧化物酶 l i g n i np e r o x i d a s e 2 2 a z i n o b i s 锰过氧化物酶 2 2 连氮一双 3 一乙基苯并 3 一e t h y l b e l l z t l l i a z 0 1 i n e 6 s u l f o n a t e 噻唑一6 一磺酸铵 p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y 出o c a r b o n s 多环芳族化合物 b i o l o g i c a lo x y g e nd e m a n d 生化需氧量 c h e m i c a lo x y g c nd e m a n d 化学需氧量 d i t h i o t l l r i o t o l二硫苏糖醇 b o v i n es e m ma l b u m i n 牛血清白蛋白 0 c t y lp h e n o x y p o l y e t h o x y e t h a i l o l 钧 环氧乙烷缩和物 t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a i l e 三羟甲基氨基甲烷 s o j i u md o d e c y ls u j f b n a e十二烷基磺酸钠 p e g 2 0 0 0 0 p 0 1 y g l y c 0 1 e s r a p t e m e d d e a e s p s s 聚乙二醇 e 1 e c t r o ns p i nr e s o n 锄c e 电子自旋共振 a m m o n i u m p e r s u l f a t c 过硫酸铵 n n n n t e t r a m e t h y l e n e d i a i 矗i n e n n 虬n 一四甲基乙二铵 d i e t l l y l a m i n o e t h y l s t a t i s t i c a lp a c k a g ef o r t h es o d a ls c i e n c e 二乙基氨基乙基 科学统计软件包 p m f p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t 肽指纹图谱 第一章文献综述 第一章文献综述 摘要 主要概述了木质素降解酶系中漆酶的研究进展 对术质素降解微生物 木质素降 解酶系进行了分类说明 尤其对漆酶的生化特性 分了结构 反应机理及其分子生物学研 究现状进行了系统的综述 最后对漆酶的应用进行全面阐述 关键词 木质素 木质素降解酶 术质素降解微生物 漆酶 应用 l 木质素与木质素降解 1 1 木质素概述 绿色植物占地球陆地生物量的9 5 以上 其化学物质组成主要是木质素 纤维素和半 纤维素 它们占植物干重的比率分别为1 5 一2 0 4 5 和2 0 农作物秸杆是这类生物 资源的重要组成部分 全世界年产量为2 0 多亿吨 而我国约为5 亿吨 但是 要充分 有 效地利用这类资源却相当困难 这是因为秸秆产量随季节变化较大 且量大 低值 体积 大 不便运输 大多数动物都不能消化其木质纤维素 自然降解过程又极其缓慢 导致大 部分秸秆以堆积 荒烧等形式直接倾入环境空间 造成极大的环境污染和能源浪费 存在 于木材和秸秆中的非水溶性木质素和纤维素很难被酸和酶水解 主要是因纤维素的结晶 度 聚合度高以及环绕着纤维素与半纤维素缔合的术质素鞘所致 木质素与半纤维素以共 价键形式结合 将纤维素分子包埋在其中 形成一种天然屏障 使微生物不易与纤维素分 子接触 而木质索的非水溶性 化学结构的复杂性 导致了这类物质的难降解性 实际上 要彻底降解纤维索 必须首先解决木质素的降解问题 因此 秸秆利用的研究热点已经从 过去的对纤维素降解的研究转向了对木质素降解的研究 实际上木质索降解是地球上碳素 循环的限速过程 也是植物纤维素材料有效利用的关键0 3 木质素简称术素 是由多个苯丙烷结构单元通过醚键和碳碳键联结而成复杂的 无定 形的 具有三维空间结构的异质多晶天然高分子聚合物 根据苯雨烷的侧链取代基不同 它又可分为松柏醇 香豆紊 芥子醇 研究发现 木质素结构单元之间的连接方式较多且 f l 1 i i 弋 孓 j 橙帕醉 n m g ia h 1 叩一 t o 1 1 蒋旺赣 不一致 并且提取木质素的标本不同 不一致 并且提取木质素的标本不同 g la b q ia l 1 其组成与结构也不相同 天然结构中 单元间主要 其组成与结构也不相同 天然结构中 单元间主要 1 7 i r r 一 j 第一章文献综述 连接方式是口 o 4 和n o 4 约占5 0 左右 其它有代表性键型是0 o 4 b 1 d 5 等 不同的植物种类 植物不同的生长阶段 其本质索的含量和成分是不同的 由于重复单元 i 白j 缺乏规律性和有序性 迄今为止 木质素是天然高聚物中最难搞清楚的 个生物大分子 其原因有两个 一是木质素的结构单元之间除醚键外还有碳碳键 连接非常稳定 不易水 解 二是不可能把整个木质素分子以其完整状态分离出来 因此 木质素这一名称不是代 表单一的物质 而是植物中具有某些共同性质的一类物质 近年来 对于木质素结构的研 究取得了较大的进展 但尚未完全清楚 图卜1 一段木质素的结构 1 2 术质素降解酶系的种类及其特性 木质素降解酶系是非常复杂的体系 目前对它的研究较多 认为最重要的木质素降解 酶有3 种 木质素过氧化物酶 l i 弘i np c m x i d a s e l j p 锰过氧化物酶 m a n g a n e s e p e r o x i d a s e m n p 和漆酶 l a c c a s e 除此之外 还有芳醇氧化酶 加y a l c o h o l o x i d a s e a a o 乙二醛氧化酶 g v o x a l o x i d a s e g u x 葡萄糖氧化酶 酚氧化酶 过氧化氢酶等 都参与 了木质素的降解或对其降解产生一定的影响 1 对于该酶系的研究还在进行 漆酶最早是 从漆树的分泌物中分离出来的 后来发现很多真菌也产生这种酶 漆酶园有多种用途 一 直是木质素降解酶系中一个研究热点 漆酶在木质素降解过程中的作用机制至今还不完全 清楚 它可以在酚类或芳胺类等多种底物的氧化中起催化作用 p 和m n p 都是带有糖基的 2 第一章文献综述 胞外血红素蛋白 又称血红素过氧化物酶 它们在反应中从苯酚或非酚类的苯环上夺取一 个电子而使后者形成一个阳离子基团 从而导致木质素分子中主要键的断裂 l j p 的作用主 要是氧化苯酚使之成为苯氧残基 m i l p 主要从m n 2 和h 2 0 2 的氧化中得到m n m n 3 氧化苯 酚使之成为苯氧残基 但每种酶在木质素降解中的具体作用及它们之间的协同关系尚不甚 清楚 e r i k s s o n 推测了木质素 纤维素 半纤维素的整个代谢过程 3 见图1 2 木素 聚合术素 c 仍 单体 二囊体 寡曩雏 也 曩化反应 p 胁l i b c 活性氧 中介辘 翮 还原反应 醴还原 醛还原蘸 馥还胄f 酶 图1 2 木材中木质素降解途径的推测 1 3 木质素降解微生物 在自然界中 能降解木质素并产生相应酶类的生物只占少数 木质素的完全降解是真 菌 细菌和其它微生物群落共同作用的结果 其中真菌起着主要作用 真菌借助孢予和菌 丝的作用 扩散到木质材料中 甚至进入细胞内进而分泌特殊的酶攻击术质纤维的细胞壁 木质素的特殊结构是制约木质素生物降解的最主要的原因 这就决定了它必须不同于别的 生物多聚体的降解酶体系 即其必须是胞外的 非专一的 并且是非水溶的 1 3 1 细菌 一些细菌如a e 砌m 硼口5 f j 口v 曲口c 耙r 跏脚 洳厅t 幻m d n 甜 a 8 r d 州d n 口s d c 口耐括可以 降解木质索 这些细菌从木质素的甲基苯丙烷骨架和甲氧基上释放c 0 2 从而修饰或部分 修饰木质素 另外蓝细菌对造纸废水中木质素的降解作用也有报道 a 1 3 2 木腐真菌 根据木质素降解的特点 木腐真菌可分为软腐真菌 褐腐真菌和白腐真菌三类 1 3 2 1 软腐真菌 一些属于子囊菌纲的霉菌和半知菌纲的真菌可以降解软木中所有的 包括木质素在内 的主要成分 它们被命名为软腐真菌 木质素降解是软腐真菌降解的一个特征 p r e 淞s 啦 s 第一章文献综述 一c n 矧 口c 匆的删口 缸r 小 c h 4 e 幻m 泐印f 删确 啪 勋跚 泐淞d 缸 i f 和一些土壤上生长 的真菌 2 3 都表现出木质素降解能力 1 3 2 2 褐腐真菌 褐腐真菌基本上包括担子菌纲的几个种 如工e n d 蜘加6 p 口 p d 胁c d b 和g f d 8 0 p 砂 z 胁m 加挺口肌 这一类真菌主要降解纡维素和半纤维素 但在控制实验条件的情况下 这些 真菌有降解硬木 软木和草中木质素的能力 1 3 2 3 白腐真菌 白腐真菌被认为是最具潜力 可能也是最广泛的木质素降解菌 包括担子菌纲的几百 个种和子囊菌纲的少数几个种 如 k 万e 阳c e 把c i l 那唧d r f 小 zv e 船f c d 如h 弛 阳掷d s 姚口n 坫 p 0 血5 6 口c i 妇 g 4 m 如堋n m c 豇缸m 等 这些真菌能够有效降解木质素 同时降解 木材中主要成分生成c 0 2 和h 2 0 大多数木质素生物降解的研究都是以白腐真菌作为典型 代表的 1 3 3 酵母 尽管有些酵母锄如拥增髓i 盘粥 勋8 咖幻麒蛔阳班函括 鼢删 c 肠g 跏n 妇9 2 利用木质素单 体形式降解物作为唯一碳源和能源 但先前却没有酵母利用多聚体形式降解木质素的报 导 因而 人们一直认为酵母不能有效地降解木质素 最近 e l c n a 等人报导类酵母 d 打f 曲聊l 脚e 6 口砌f f 能够有效降解木质素 该种微生物通过cq cb 侧链裂解 cd 氧化 芳环裂解和还原反应来完成对木质素的降解 2 漆酶的性质 2 1 漆酶的分类 漆酶是含铜多酚氧化酶 从来源上讲主要分为漆树漆酶和真菌漆酶两大类 动物漆酶 报道的甚少 漆酶一般以单蛋白体的形式存在 其分子量一般在5 2 k d a 到l l o k d a 之间 也有些分子量大于1 1 0 k d a 不同来源的漆酶具有不同程度的糖基化 糖基化程度在l o 4 5 之间 般情况下真菌漆酶的糖基含量要低于植物漆酶 2 2 漆酶理化性质和结构特点 2 2 1 漆酶的分子特征 漆酶是一种含铜的糖蛋白 肽链一般由5 0 0 个左右氨基酸组成 糖配基占整个分子的 l o 4 5 糖组成包括氨基己糖 葡萄糖 甘露糖 半乳糖 岩藻糖和阿拉伯糖等 由 于分子中糖基的差异 漆酶的分子量会随来源不同有着很大的差异 甚至来源相同的漆酶 4 第一章文献综述 分子量也会不完全相同 2 2 2 漆酶的生化特性 漆酶能催化许多化合物的氧化反应 底物比较广泛 包括许多与对二酚结构类似的化 合物 如氨基苯酚 邻 对苯二酚 多酚 多胺 木质素和芳基二胺等 一些漆酶能高效 地氧化抗坏血酸 另外一些真菌漆酶还能催化木质素和甲氧基酚酸的脱甲基反应 必须注 意的是过氧化物酶和其他一些多酚氧化酶也可以催化类似的反应 但这些酶不会利用分子 氧作为第二底物 因此测定催化反应中氧吸收速率可以作为漆酶活性的可靠证据 漆酶的 抑制剂大多是铜离予螯合剂 有卤化物 半胱氨酸 e d l a 和s d s 等 离子强度的不同也 会影响酶的活力 不同来源濠酶的最适p h 也不同 2 2 3 漆酶的结构特性 由于漆酶的糖基化程度高 长期以来 直难以得到x 衍射分析用的漆酶单晶 它的 三维空间结构也难以清楚 直到后来 d u c f o sv a l e l l e 等人首先将c 0 p r 讯淞c 讯b 陀船产生的 漆酶利用酶法去除了糖基 然后以聚乙二醇为沉淀剂 利用悬滴法把它制作成小片晶体 经过x 射线衍射分析 发现它们属于空间群p 2 2 2 单位晶胞参数为a 4 5 4 n m b 2 8 5 7 姗 c 1 4 3 1 n m 1 71 图1 3 漆酶三维结构 漆酶中的铜离子在催化氧化反应中起决定作用 根据磁学和光谱性质可将漆酶中的四 个铜离子分为三类 i 型c u 2 和i i 型c u 2 各一个 是单电子受体 呈顺磁性 可以用 e s r 检测 i 型c u 2 两个 是双电子受体 反磁性 e s r 检测不出来 i 型c u 2 能与包 括水在内的溶剂作用 各种铜离子鳌合剂能将其除去导致酶的活性大大减少 在x 一射线 5 第一章文献综述 研究漆酶蛋白晶体结构时常用汞取代i 型c u 2 上 i 型c u 2 的电子顺磁共振光谱 e l e c t r o n i c p a r 眦a 盟e tr e s o n a i l c ee p r 在可见区显示4 条电子转移条带 其中由c y s c u l 产生的条 带最强 6 1 4 n m 5 8 0 0 m o l 1 l 2 c m 1 是漆酶产生蓝色的主要原因 并且有非常狭 窄的超精细裂分 a 4 3 1 0 3 c m 1 c u 2 和4 个配体形成扭曲四面体几何构型 i i 型 c u 2 非蓝色 没有特征吸收光谱 是由两分子的咪唑和一分子的水配位形成松散的扭曲四 面体几何构型 所以很容易除去 有氧条件下则不易除去 e p r 光谱有非常宽的超精细 裂分 a 2 0 6 1 0 3 c m 1 无氧条件下 如果有还原剂而没有二乙基二硫氨基甲酸酯 d d c e d t a 等不能把铜离子螯合除去 i 型c u 2 4 是偶合的离子对 c u 2 一c u 2 在 九3 3 0n m 处有宽的吸收峰 铜离子虽然是漆酶催化反应的活性中心 但其催化性能还受 周围氨基酸配体的影响 因氨基酸配体的不同 漆酶豹氧化能力是不同的 一般来说 漆 树漆酶和真菌漆酶并无本质上的不同 漆树漆酶的底物也是真菌漆酶的底物 前者的催化 活性较后者低 其原因是漆树漆酶中的i 型c i u 2 被深埋在酶蛋白的多肽链内 因而显示 出较低的酶活性 2 3 漆酶催化反应机理 漆酶是单电子氧化还原酶 催化不同类型底物氧化反应 机理主要表现在以下两方面 2 3 1 底物自由基中间体的生成 漆酶催化邻 对苯二酚 胺 类底物 如氢醌 氧化时 首先是底物向漆酶转移一个电子 生成半醌一氧自由基中间体 用e s r 监测反应 能观察到明显的自由基信号 其次是不均衡 的非酶反应 二分子半醌生成一分子对苯醌和一分子氢醌 有0 2 存在时 还原态漆酶被氧 化 0 2 还原成水 其中e c u e c u 分别表示漆酶的氧化态和还原态 氧自由基中间体 一 r l o 弋矿 0 1 e c u 一l i o 庐 一 u 2 h o 弋门 一 气网 h o 弋矿弋 h e c u 4 l o2 e c u h 2 f 童 还可以转变成碳自由基中间体 它们可以自身结合和相互结合 产物中除醌外还有聚合物 c o 和c c 偶联产物 2 2 3 2 四个铜离子的协同作用 漆酶催化底物氧化时 i 型c u 2 和i i 型c u 2 首先分别从底物接受一个电子 由二价变为 一价 然后通过分子内的电子转移 i 型c u 和i i 型c u 将电子传递给 型c u 2 它们由一 价变成二价 型c u 2 由二价变成 价 当i 型c h 2 和i i 型c u 2 分别再次从底物接受一个 电子变成一价时 四个铜离子都是一价 这时漆酶呈还原态 2 2 在有0 2 存在下 还原态漆酶被氧化 0 2 从i 型c u 和i 型c u 2 迅速接受三个电子 生成 光活性氧中间体 c u 2 0 3 并失去一分子水 i 型c u 和 型c u 2 4 由一价变成二价 分别在 第一章文献综述 6 1 4 n m 和 3 3 0 肌处出现特征吸收峰 i i 型c u 再氧化很慢 氧中间体一直与i i i 型c 2 相 连 具有顺磁性 它的e s r 信号与i 型c u 2 和i i 型c u 2 不同 表现出类似于负氧自由基不寻 常的性质 当它从i 型c u 接受第四个电子还原为水时才脱离 型c u 2 这时四个铜离子都 是二价 漆酶呈氧化态 这样 通过四个铜离子的协同作用传递电子 同时发生价态变化 实现漆酶对底物的催化氧化 如下式所示 僦拟 f 鹕 意 1 扩 r 爸嚣 f p s 蠢 鑫岛n 伊靠麓 u 2 n 付u o 户 i j fr 哼 c 宙 f n f 钒化愁 漆酶分子中的四个铜离子可以用氰化钾除去 形成的脱辅基无催化活性漆酶 其水溶液非 蓝色 i 型c u 2 和i i 型c u 2 能分别选择性地除去 得到部分脱辅基漆酶 i i 型c u 2 失去活性 i 型c u 2 4 也失去活性 用h 矿 取代i 型c u 漆酶活性大大降低 全部或部分脱辅基漆酶 可以用 价铜离子 c u 重建 使之恢复天然漆酶的活性 2 3 漆酶的分子生物学研究 2 3 1 漆酶基因的克隆及表达 2 3 1 1 漆酶基因的克隆 随着分子克隆技术的发展 越来越多的漆酶基因被克隆 许多来源的基因都是以家族 形式存在于染色体上的 这些来源不同的基因表现出较高的同源性 1 9 8 8 年f m h m a i l 首次 利用快速扩增c d n a 技术从白腐菌p 钯h r d 船蝴靠g 中克隆到酶p o x l 基因 g i a r d i i l a 克隆了 一个7 5 0 b pc d n a 片段 该片段对应于p o x l 基因的3 末端 进一步克隆了该基因5 末端 9 0 0 b pc d n a 2 个产物合并为一个完整的漆酶基因 后来 他们用同样的方法合成了完整 的p o x 2 c d 峨序列 这2 个基因是非等位的 陆续已有约2 0 种该酶基因得到克隆 一些基因 在不同受体菌中还得到了表达 但是 并不是所有的产漆酶菌株都能克隆到相应的基因 d s o u z a 等从9 属1 1 个木腐菌的基因组中扩增漆酶特异性序列产物 结果得到8 个预期产物 1 个褐腐菌得到较少的产物 虽然知道r m 蚓白卅蹦缸r f 淞和弛 d m s d sf e n m s 产生漆酶 但 是却没有得到任何扩增产物 不过 根据s o u t l l c mb l o t t i n g 杂交结果 可以证明这两个菌种 中确实存在漆酶基因m 1 2 3 1 2 漆酶基因结构和组织分析 真菌漆酶的基因外显子序列长度一般介于1 5 0 0 2 0 0 0 b p 相应的氨基酸残基数约为 7 第一章文献综述 5 0 0 个 整体的序列同源性并不高 但是不同酶蛋白中结合铜原子区域的保守性相当高 基因中含有相当多的内含子 其中一些也高度保守 表一为已经克隆的部分漆酶基因经比 较发现 白腐菌f w f c d f 口r c d r 泐砌汹m 5 和p 劬妇m d 面陋中的内含子虽然序列同源性不 高 表一 已克隆的部分漆酶基因 但它们在铜结合区域的保守性相当高 而且不同来源的漆酶基因内含子的位置大多也是 保守的 这两方面可以作为分析酶的同源性和菌株间的亲缘关系依据之一 深入研究z v e 坩f 如瑚的l a c l 基因 发现其启动密码上游有1 个约1 3 0 b p 的t a t a 框和6 0 9 0 b p 的可能和 8 第一章文献综述 启动有关的富含嘧啶区域 与酶的表达密切相关 研究较多较深入的是一种核桃疫病病原 真菌d y p 矗 醒c 盯妞p 4 r 口s f 比4 漆酶基因k i c l 的表达调控机制 它的转录受两种拮抗途径所调 控 一条是依赖于钙离子 肌苷三磷酸 钙调节蛋白 另一条是对低水平蛋白合成抑制剂 环丝氨酸敏感的负调控途径 p i n g 等人进一步鉴定了该基因中1 个1 1 1 b p 的启动元件