（微生物学专业论文）新型重组工程系统的构建和鉴定.pdf

摘要 摘要 重组工程 r e d e t r e c o m b i n a t i o nm e d i a t e dg e n e t i ce n g i n e e r i n g 是指由重组酶 催化的d n a 短片段之间的同源重组而在大肠杆菌中进行基因克隆或改造的一种 技术 重组工程可以在基因片段的任意位点进行准确的敲入 敲除 置换 并且 不受酶切位点的限制 现已逐渐成为常规的克隆手段 重组工程中的重组酶主要是来源自九噬菌体三个基因 其中r e d c t e x o 编码 d n a 5 端至3 端的外切酶 其作用于双链d n a 分子而产生3 端突出的分子 r e a p b e t 编码单链结合蛋白 其结合在d n a 分子的3 突出端 还具有重组酶活性 促进两个单链 同源d n a 分子之间的退火产生重组d n a r e d y g a i n 基因的作 用是抑制大肠杆菌r e c b c d 对外源d n a 的降解 目前主要应用的两种重组工程系统都是基于r e d 基因构建的 第一种系统是 前噬菌体系统 以美国国立癌症研究所d o n a l dc o u r t 实验室构建的大肠杆菌 d y 3 8 0 为代表 是将缺陷九前噬菌体整合至大肠杆菌基因组中构建而成 重组酶 基因由p 1 启动子所诱导 在d y 3 8 0 中 r e d 基因由p l 启动子严格调控 3 0 0 c 时 p l 启动子被温度 敏感性抑制子c i 8 5 7 抑制 4 2 0 c 时抑制解除 因此在d y 3 8 0 中 重组酶的表达 是由3 0 0 c 转移至4 2 0 c 时的温度升高所诱导的 此系统的缺点是菌株需要在3 0 0 c 生长 比在3 7 0 c 下生长要慢 其次 重组酶的表达需要4 2 0 c 水浴进行1 5 分钟 精确的热诱导 第二种是基于质粒的重组酶系统 最常使用的两个质粒是p k d 4 6 氨苄青 霉素抗性 和p s c l 0 1 b a d g b a a 四环素抗性 载体 在这两个质粒中 r e d 基因都是由p b a d 启动子所驱动 p b a d 启动子受l 阿拉伯糖诱导表达的a r a c 基因所激活 质粒的复制子都是温度敏感型复制子 在3 0 0 c 才能行使复制功能 菌株需要在3 0 0 c 培养 为了给重组工程提供更多的酶系统 本论文中我们构建了新的重组工程菌株 和载体 通过将重组酶基因整合至大肠杆菌的基因组中构建了一个新的重组工程 菌株大肠杆菌l s g r l s g r 在3 7 0 c 生长 r e d 基因受l 阿拉伯糖诱导表达 通过将含有p 1 5 a 骨架的中等拷贝载体p a c y c l 8 4 和单拷贝的p e c b a c l 抗性标 记基因替换进行验证其重组功能 这两个载体都是在分子克隆研究中经常用到 的 结果表明以本菌株进行重组工程的操作简便 重组效率高 可成为通用的重 组工程用菌株 新的重组酶质粒系统的构建是通过两种方式 第一种是在p k d 4 6o r f 6 0 a 基 因后面分别克隆o r f 6 3 或o r f 6 3 和o r f 6 1 基因 另一种是通过在r e d 基因中引入定 摘要 点突变的方式 通过对p e c b a c l 上面抗性基因的替换来验证新构建重组系统的 功能 最后证明p l s 5 0 2 的重组效率是p k d 4 6 的2 倍 关键词 重组工程 同源重组 定点突变 基因置换 i i i a b s t r a c t r e c o m b i n e e r i n g r e d e t r e c o m b i n a t i o nm e d i a t e dg e n e t i ce n g i n e e r i n g i sa d n a c l o n i n ga n dm o d i f i c a t i o nt e c h n i q u et h a tm a k e su s eo fr e c o m b i n a t i o nb e t w e e n s h o r to l i g o n u c l e o t i d e si ne s c h e r i c h i ac o l i r e c o m b i n e e r i n gm a k e si n s e r t i o n d e l e t i o n o ra l t e r a t i o no fa n ys e q u e n c ep r e c i s e l ya n di sn o td e p e n d e n to nt h ee x i s t e n c eo f r e s t r i c t i o ns i t e s t th a sr a p i d l y b e c o m i n gag e n r a lc l o n i n gm e t h o d t h er e c o m b i n a t i o nf u n c t i o ni sp r o v i d e db yt h r e er e dg e n e si n 九p h a g e r e d a e x o i sa5 一3 e x o n u c l e a s e c r e a t i n gas i n g l es t r a n d e dp r o t r u d e do v e r h a n g r e a p b e o i st h es i n g l es t r a n db i n d i n gp r o t e i nt h a tb i n d st ot h ep r o t r u d e dd n ae n da n dp r o m o t e s s i n g l es t r a n d e dd n aa n n e a l i n g r e e f g a m p r o t e c t st h ei n c o m i n gd n a f b o mb e i n g d e g r a d e db yh o s t se n d o n u c l e a s e r e c b c d t h e r ea r em a i n l yt w or e c o m b i n e e r i n g s y s t e m sa v a i l a b l ed e p e n d i n go nt h e e x i s t e n c es t a u so fr e dg e n e s t h ef i r s ts y s t e mi sp r o p h a g es y s t e mr e p r e s e n t e db ye c o l id y 3 8 0 d e v e l o p e db yd o n a l dc o u r tg r o u pa tn c i w a sg e n e r a t e db yi n t e g r a t i n g t h ed e f e c t i v e 九p r o p h a g ei n t oaec o l id h10 bt h r o u g hp1i n d u c t i o n i nd y 38 0 t h er e dg e n e sa r eu n d e rt h ec o n t r o lo fp l w h i c hi sr e p r e s s e db yt h e t e m p e r a t u r e s e n s i t i v er e p r e s s o r c i 8 5 7a t3 0 0 c a n dd e r e p r e s s e da t4 2 0 c t h e e x p r e s s i o no fr e dg e n e s i nd l 3 8 0i si n t r o d u c e db yt h et e m p e r a t u r es h i f tf r o m3 2 0 ct o 4 2 0 c t h es h o r t c o m i n go fd y 3 8 0i st h a ti tm u s tb em a i n t a i n e da t3 0 0 cw h i c hg r o w s s l o w e rt h a na t3 7 0 c s t i l l ap r e c i s ea n dh o m o g e n o u sw a t e rb a t hi sn e e d e df o rt h e15 m i n u t e s4 2 0 ch e a ta c t i v a t i o n t h es e c o n ds y s t e mi st h ep l a s m i d b a s e ds y s t e m t w om o s tw i d e l yu s e dp l a s m i d s a r ep k d 4 6 a m p i c i l l i nr e s i s t a n t a n dp s c101 b a d g b a a t e t r a c y c l i n er e s i s t a n t i n w h i c hr e dg e n e sa r ec l o n e du n d e rp b a dw h i c hi st i g h t l yr e g u l a t e db ya r a cg e n e b o t hh a r b o rt h et e m p e r a t u r es e n s i t i v ep s cioi o r i g i nr e p l i c o nw h i c hs h o u l db e m a m t a i n e da t3 0 0 c t op r o v i d em o r et o o l sf o rr e d e tm a n i p u l a t i o n i nt h i sp a p e r w ec o n s t r u c t e d n e w r e c o m b i n e e r i n gs t r a i n sa n dv e c t o r s an e w e c o l ir e d e ts t r a i ne c o l il s g r w a sc o n s t r u c t e db yt h ei n s e r t i o no fr e dg e n e si n t ot h eec o l id h10 bg e n o m e t h e s t r a i ng r o w sa t3 7 0 ca n dr e d g e n e sa r ei n d u c e de x p r e s s i o nw i t hl a r a b i n o s e t h e r e c o m b i n e e r i n gf u c n t i o no ft h es t r a i nw a sd e m o n s t r a t e db ym a r k e rr e p l a c e m e n t e x p e r i m e n t su s i n gm i d d l ec o p yn u m b e rp l 5 ab a c k b o n ev e c t o rp a c y c l8 4a n ds i n g l e i v a b a t r a e t 7 一一 一 c o p yn u m b e ra n db a c v e c t o rp e c b a c1 b o t ha r ec o l n m o r lv e c t o r si nm o l e c u l a r b i o l o g yc l o n i n gs t u d y t h eh i g he f f i c i e n c ys h o w n i nt h es t u d ys u g g e s t st h a tec o l i l s g ra nb eu s e dap o t e n tr e d e ts w a i n t h en e wr e c o m b i n e e r i n gp l a s m i d sw e r ec o n s t r u c t e di nt w ow a y s t h ef i r s ti st h a t t h eo r f 6 3o ro r f 6 3a n do r f 6 1w e r ec l o n e db e h i n do r 6 0 a r e s p e c t i v e l y t h es e c o n d m e t h o di st h a ts i t em u t a t i o n sw e r ei n 仃o d u t e di n t or e dg e n e s t h ef u n c t i o no f t h e s t r a i nw a sd e m o n s t r a t e db ym a r k e rr e p l a c e m e n te x p e r i m e n t su s i n gs i n g l ec o p y r i u m b e ra n db a cv e c t o rp e c b a c l t h ef i n a lc o n s t r u c tp l s 5 0 2c o u l di n c r e a s e r e c o m b i n a t i o ne f f i c i e n c ya b o u t2 f o l d k e yw o r d s r e c o m b i n e e r i n g h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n s i t em u t a t i o n g e n e r e p l a c e m e n t v 学位论文独创性声明 本人郑重声明 1 坚持以 求实 创新 的科学精神从事研究工作 2 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果 3 本论文中除引文外 所有实验 数据和有关材料均是真实的 4 本论文中除引文和致谢的内容外 不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果 5 其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意 研究生签名 日期 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留 使用学位论文的规定 学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版 有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅 有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版 保密的学位论文在 解密后适用本规定 研究生签名 星t e l 期 麴 墨幺 第一章文献综述 第一章文献综述 1 重组 1 1 基因重组 基因重组是所有生物都可能发生的基本的遗传现象 无论在高等生物体内 还是在细菌 病毒中都存在基因重组 不仅在减数分裂过程中会发生基因重组 在高等生物的体细胞中也会发生基因重组 基因重组不仅可以发生在细胞核内的 基因之间 也可以发生在线粒体和叶绿体的基因之间 可以说 只要有d n a 就可 能发生重组 基因重组的特点是d n a 双链间进行物质交换 根据重组的机制和对蛋白质 分子的要求不同 可以将基因重组分为三种类型 即同源重组 位点特异性重组 和异常重组 同源重组的发生依赖于大范围的d n a 同源序列的联会 在重组过 程中 两条染色体或d n a 分子相互交换对等的部分 真核生物的非姊妹染色单 体的交换 细菌以及某些低等真核生物的转化 细菌的转导接合 噬菌体的重组 等都属于这种类型 大肠杆菌的同源重组需要r e c a 蛋白 类似的蛋白质也存在于 其他细菌中 位点特异性重组发生在两个d n a 分子的特异位点上 它的发生依 赖于小范围的d n a 同源序列的联会 重组也只限于这个小范围 两个d n a 分子 并不交换对等的部分 有时是一个d n a 分子整合到另一个d n a 分子中 这种重 组不需要r e c a 蛋白的参与 异常重组发生在顺序不相同的d n a 分子间 在形成 重组分子时往往依赖于d n a 的复制而完成重组过程 l 2 1 例如 在转座过程中 转 座因子从染色体的一个区段转移到另一个区段 或从 条染色体转移到另一条染 色体 这种类型的重组也不需要r e c a 蛋白的参与 1 2 同源重组 同源重组 h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n 在生物细胞中 d n a 或r n a 分子 间或分子内的同源序列能在自然条件下能重新排列 使遗传物质发生交换 同源 重组的频率与d n a 或r n a 序列的同源程度 即序列的相似程度 同源区域大 小以及生物个体的遗传特性密切相关 一般而言 同源程度越高 同源区域越大 重组的频率就越高 同源重组是生物进化的一种重要方式 对于原核细菌 噬菌 体和病毒而言 同源重组现象的发生尤为普遍 3 迅 1 2 1 同源重组的原理 同源重组是个非常复杂的过程 需要一系列的蛋白质催化 如原核生物细胞 内的r e c a r e c b c d r e c f r e c e s b c a b c r e c r 等 以及真核生物细胞内的 第一章文献综述 r a d m m r e l l r a d 5 0 等等 同源重组过程根据交叉分子或h o l i d a y 结构 h o l i d a y j u n c t u r es t r u c t u r e 的形成和拆分分为三个阶段 即前联会体阶段 联会体形成 和h o l i d a y 结构的拆分 同源重组反应严格依赖d n a 分子之间的同源性 1 0 0 重组的d n a 分子之间的重组常见于姐妹染色体之间的同源重组 称为 h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n 而小于1 0 0 同源性的d n a 分子之间或分子之内的 重组 则被称为h e m o l o g u sr e c o m b i n a t i o n 9 后者可被负责碱基错配对的蛋白如 原核细胞内的m u t s 或真核生物细胞内的m s h 2 3 等蛋白质 编辑 同源重组可 以双向交换d n a 分子 也可以单向转移d n a 分子 后者又被称为基因转换 g e n e c o n v e r s i o n 下面简单介绍参与同源重组的主要基因 1 r e c a 基因 大肠杆菌r e c a 基因编码的r e c a 蛋白是一个3 9k d a 的单一多肽链 它作为 一种重要的重组酶参与同源重组 其主要作用包括促进d n a 同源片段的联会以 及d n a 分子间的单链交换 l o 由于r e c a 蛋白具有依赖于单链d n a 的a t p 酶 活性 因此涉及到所有耗能的d n a 反应 如互补单链d n a 区域的退火 线状 单链d n a 和环状双链d n a 间d 环状结构的形成 线状双链d n a 和环状单链 d n a 转变成线状单链d n a 和环状双链d n a 两条线状双链d n a 分子间的单 链交联 即同源重组h o l l i d a y 机制的中间体 等 r e c a 介导的同源重组反应对单链d n a 的结构要求与同源d n a 分子间的联 会机制有关 在中性p h 的条件下 r e c a 能大量结合于单链d n a 每个单体与 单链d n a 上的3 5 个碱基结合 而且这种结合作用呈现高度的协同效应 此外 r e c a 还具有依赖p h 和a t p 等三磷酸核苷酸的双链d n a 结合活性 这种持续 的结合作用使得双链d n a 有效地解离为单链 直到与含有大于5 0 碱基的同源 区域发生联会 并形成h o l l i d a y 中间体h d n a r e c a 介导的链同化反应对于d n a 底物具有较强的选择性 两种不同类型 的反应证明了这一点 只有当双链d n a 的3 端同源并互补于单链环状d n a 分 子时 它们的重组才能形成稳定的h d n a 类似地 在大肠杆菌单链结合蛋白 s s b 蛋白存在的情况下 只有当线状单链d n a 的3 端与环状双链d n a 同源时 h d n a 结构才能产生 这说明单链同化反应只能沿着的固定方向进行 这个方向 对双链d n a 上的互补链来说是3 一5 而对于入侵的单链d n a 来说则是5 一3 r e c a 蛋白要求单链或双链d n a 分子上具有3 同源末端以启动稳定的链同化反 应 r e c a 促进d n a 同源重组反应并形成稳定的重组产物 要求底物具备三个 条件 即d n a 分子间或分子内存在较高的同源序列 至少一种d n a 底物呈单 2 第一章文献综述 链结构 至少一条d n a 链具有自由末端 但值得注意的是 当拓扑异构酶参与 反应时 最后一个条件并不是必需的 对纯化的r e c a 蛋白和完整细胞的研究表 明 有效重组事件的发生至少需要4 0 5 0 个碱基对的同源性 3 0 个同源碱基对 通常不能发生联会作用 2 r e c b c d 基因 r e c a 蛋白质只能催化同源联会和链交换反应 不能控制重组过程中的其他 步骤 如单链d n a 区域的形成 连锁分子的拆分等 根据对大肠杆菌各种重组 突变体的研究发现 除了r e c a 蛋白之外 还需要r e c b r e c c r e c d r e c e r e c f r e c g r e c d r e c k r e c l 和r e c n 等基因的编码产物 大肠杆菌的r e c b r e c c 和r e e d 基因分别编码1 3 0k d a 1 2 0k d a 和6 0k d a 的多肽链 三者构成一个在同源重组中的功能单位r e c b c d 蛋白复合物 它是 一个多功能的酶系 具有依赖于a t p 的单链和双链d n a 外切酶的性质 因此又 称为外切核酸酶v 它能利用水解a t p 释放的能量使线型d n a 解旋 此外还呈 现序列特异性的d n a 单链内切酶活性 体外实验结果表明 如果系统中缺少s s b r e c b c d 能进攻线型双链d n a 的末端 一次解旋1 0 0 0b p 左右的区域 其中一条链被切成4 5 碱基的寡核苷酸 另一条链则成为1 0 0 0 个碱基左右的单链尾巴 r e c b c d 对线型双链d n a 的外切 活性最高 而对于平头末端的双链d n a 来说 螺旋酶活性占主导地位 r e c b c d 只对具有平头末端或者几乎平头结构的线型d n a 分子呈现解旋功能 而对超螺 旋 缺刻 含1 0 到7 7 4 个碱基缺口的环状双链d n a 或含大于3 0 碱基的单链结 构的线型d n a 分子均无活性 由r e c b c d 产生的单链d n a 可能是r e c a 促进 联会反应的主要底物 从理论上讲 r e c a 蛋白介导的同源重组反应可以发生在d n a 链上的任何 同源序列之间 但是实际上某些序列 即重组热点 发生重组的频率要远远高于 其它序列 迄今已知的重组热点主要是c h i 位点 最初是在突变的噬菌体中发现 的 纯化的r e c b c d 酶切割含c h i 位点的d n a 比不含c h i 的d n a 有效得多 在c h i 处重组频率显著增加 而位于c 1 1 i 上游约2 o 2 5k b 处的重组呈指数减弱 r e c b c d 解旋d n a 后 从c h i 位点伸出的单链结构是r e c a 和s s b 蛋白形成d 噜噗的有效底物 大量的实验结果证实 所有r e c b c d 酶介导的重组过程都要 求c h i 或类似c h i 的位点 而c h i 位点只激活r e c b c d 重组途径 对r e c e r e e f 或r e d 途径不起作用 通常 r e c b c 无效突变株比r e c a 突变株的重组水平高 这表明在大肠杆菌 细胞内至少还存在着另一种依赖r e e a 但却独立于r e c b c d 的低水平重组途径 一种能强化这些低水平重组途径并同时使r e c b c 突变株恢复重组能力的突变体 第一章文献综述 被分离出来 经鉴定证实其中的关键基因为s b c 其编码产物实质上是r e c b c 基 因表达的抑制因子 3 r e c e 基因 r e c e 突变株是通过筛选无法与高频转导菌株同源重组产生原养型噬菌体的 r e c b c s b c a 突变株时获得的 r e c e 靠近s b c a 通常表达少量的e x o v l l i e x o v i i i 从3 将双链d n a 中的一条链降解成5 单核苷酸 它对双链末端结构具有明显 的偏爱性 缺刻或缺口d n a 不是良好的底物 外切反应形成的单链d n a 分子 或含3 突出末端的双链d n a 分子 能与其他的双链d n a 片段相连 这是同源 重组过程中的一个重要步骤 e x o v i h 核酸外切酶与r e c b c d 一样 都能作用 于线型双链d n a 分子并产生3 末端结构 但后者是通过解旋d n a 起作用的 4r e e f 基因 与r e c e 突变株相同 r e c f 突变株也是在筛选r e c b c s b c b s b c c 突变菌是获得 的 它位于d n a n 和g v r b 之间 突变区域的d n a 序列分析结果表明 此处含有 一个编码3 5 7 个氨基酸的开放型阅读框架 与d n a n 基因重叠一个碱基 并于g y r b 编码区的前2 8 个碱基处结束 体外实验结果表明 在九一噬菌体强启动子p l 和 p r 的控制下 r e c f 基因低水平表达一个4 0k d a 的多肽 其功能可能是调节r e c a 蛋白的d n a 链传递活性或者调控相关调节基因的表达 卜1 7 1 2 重组工程及其应用研究 重组工程 r e e o m b i n e e r i n g 是近几年兴起的一种新的基于大肠杆菌体内同 源重组的遗传工程技术 可定义为 基于噬茵体端同源序列重组功能的遗传工程 或者基于同源重组的遗传工程 重组工程可有效促进线性d n a 分子和染色体间 的重组 直接在体内对染色体d n a 或载体进行基因敲除 敲入 置换 引入单 碱基突变或基因克隆 1 8 1 9 1 重组工程技术相对于传统d n a 操作技术的优势表现 在几个方面 操作简便 比体外步骤相对简单 不受d n a 片段长短影响 可操作大到几百k b 小到一个k b 的d n a 片段 它不受d n a 序列的影响 没 有限制性酶切位点都可操纵d n a 片段 重组工程技术可精确地在染色体或质粒 的任意位置进行操作 为后基因组研究提供了一个有力的武器 4 第一章文献综述 一 7 始划晰辅嘲嘲d 轴喇良l r1 r 7 r r 叮 r 掣r r r r y r 薯 r 争 3 0 0 乞l 乙 乙乙己五厶l 乙乙乙乙出 r 絮脓9 f 3 鲁硝i n u d e d 罅 o 窭翌夏至瑶鼍旷犷 yi l 越o l o 岁 y r e t i 吁r e d p 一s i 舯kr t r a 螂b p d m q 埘靴l m o0 囝o j 匿 西矿蛮 y 2 夕 j o i n tm o l e c u l ef o r m a t i o n 善 一 d n a r e p l l c a d o n 图1 重组工程示意图 重组工程系统包括基于缺陷型九噬菌体和i 沁噬菌体的重组酶系统 跏噬 菌体重组相关的基因分别为r e c e r e c t 九噬菌体重组相关的基因统称为p e d l i 2 0 圳 包括三个基因 即e x o 6 p f 和g a m 分别编码e x o b e t a 和g a m 三种蛋白 质分子 e x o 蛋白的分子质量为2 4k d a 具有d n a 外切核酸酶活性 以每秒钟 1 0 0 0 个碱基的速度从双链d n a 末端按5 一3 的方向消化单链d n a b e t a 是一 种单链d n a 结合蛋白 结合在由e x o 消化产生的3 单链d n a 末端 促进该单 链d n a 末端与互补链退火和体内重组 e x o 蛋白与单链d n a 分子结合需要至 少3 5 个碱基的区域 g a m 抑制宿主菌的r e c b c d 线性双链d n a 外切酶活性 协助e x o 和b e t a 完成同源重组 2 1 重组工程系统的研究进展 2 1 1r a c 噬菌体编码的r e c e t 重组系统 大肠杆菌体内的重组依靠内院的r e c a 蛋白 r e c b c d 具有核酸外切酶v 的 活性 能降解外源线性d n a 片段 2 2 1 但不能介导线性d n a 分子与染色体间的 重组 必须通过酶切 连接构建带有同源臂的环状质粒才能成功修饰大肠杆菌染 色体或b a c 载体 操作繁琐 重组效率低 所需同源臂长度大约为5 0 0 到1 0 0 0 第一章文献综述 碱基 1 9 9 8 年s t e w a r t 等首先证明 大肠杆菌r e c b cs b c a 菌株中的s b c a 突变 激 活整合在染色体上的r a c 噬菌体重组酶基因r e c e 和r e c t 表达时 线性d n a 可 作为一种打靶分子经体内同源重组直接修饰b a c 载体或大肠杆菌染色体 建立 了e t 克隆或r e c e t 重组系统 4 1 r e c e t 重组系统将r e c e 和r e c t 重组基因置于 大肠杆菌染色体上或构建到质粒上 重组过程不依赖r e c a 仅依赖r e e e 所需 的同源臂短 长度为3 0 5 0b p 就有很高的重组效 重组效率高于r e c a 介导的重 组 e t 克隆使用的基于质粒的酶系统 发展经历了由p b a d 2 4 t r e c e t 质粒到 p b a d e t r 质粒再到p g e t r e e 质粒的改进过程 p b a d 2 4 t r e c e t 是由z h a n gy o u m i n g 等构建的最早的小型基于质粒的重组系 统 4 2 3 只能用于r e c b c s b c a 菌株 该菌株中r e c b c d 蛋白因基因突变不能降解 外源线性d n a 片段 从而使线性d n a 分子和染色体见的重组成为可能 但是 r e c b c 细菌生长状态不好 某些质粒可通过滚环复制导致多联体的产生 2 4 1 而大 部分p 1 b a c p a c 宿主茵的基因型是r e c b c 使该质粒的应用范围受到很大 限制 为解决上述问题 z h a n gy o u m i n g 等又构建了p b a d e t 丫质粒 4 用九噬菌体 的g a m 基因抑制r e c b c d 的功能使得线性d n a 分子和染色体间的重组可在 r e c b c 菌株中进行 该质粒也有一定缺陷 只有r e c e 受阿拉伯糖启动子p b a d 的调控 r e c t 和g a m 基因都是组成型表达 超量的g a m 过渡抑制r e c b c d 会导 致b a c p a c 不稳定 而且在某些条件下对d h l 0 b 毒性太大而会降低重组效率 s t e w a r t 实验室在p b a d 2 4 t r e c e t 基础上构建的p g e t r e e 质粒曾经应用较广 泛的携带e t 系统的重组质粒圆 该质粒中的r e c e r e c t 和g a m 基因都受阿拉 伯糖启动子p b a d 的严格调控 g a m 基因诱导表达后可暂时抑制r e c b c d 核酸 外切酶的活性 减缓外源线性片段的降解速度 降低对细胞的毒性 重组效率较 高 j a m s a i 等以无选择标记的单链寡核苷酸 变形的p c r 产物或以t e t e c o r i i s c e i 作为反选择标记对b a c 载体进行单碱基突变 短片段或长片段基因敲入 基因敲除等修饰都取得成功 重组阳性率大约为1 3 0 2 3 2 5 2 8 效率较低 现 在已经不常使用 2 1 2 来源于九噬菌体的r e d 重组系统 2 0 0 0 年y u 和c o u r t 博士等最先将缺陷型九噬菌体的部分基因整合在大肠杆菌 染色体上 建立了基于r e d 重组酶的高效修饰染色体d n a 和b a c 载体的新型体内 重组系统 2 该系统介导重组效率高于e t 重组系统 r e d 重组系统以两种形式存 在 一种是整合到大肠杆菌染色体上的整合型重组系统 另一种是基于质粒的 6 第一章文献综述 r e d 重组系统 2 1 2 1 不可转移的r e d 重组系统 c o 血用p 1 噬菌体感染大肠杆菌w 3 11 0 构建了携带九噬菌体在口缸到c 皿 7 基因序列的d y 3 3 0 d y 3 3 1 菌株 2 他们的基因型分别是r e c a 和r e c a d y 3 3 1 菌株便于操作真核生物基因组 防止r e e a 介导的真核基因组大量重复序列间的 基因重排 这2 个菌株中重组酶基因e x o b e t a g a m 受温度敏感型抑制基 c 1 8 5 7 的严格调控 3 0 0 c 时c i 8 5 7 作用于p l 启动子 抑制重组酶基因表达 九噬菌体抗转 录终止蛋白n 基因后面的3 个转录终止子还可有效防止r e d 基因在非诱导条件下 的泄露表达 因而r e d 重组功能在阻遏条件下被完全抑制 在r e c a 菌株中不会发 生任何非特异性重组 4 2 0 c 诱导1 5 r a i n 后c 1 8 5 7 失活 重组酶基因表达并介导重 组 位于染色体上的重组系统比较稳定 不会出现类似质粒丢失的现象 而且 r e d 基因处于自然状态下能够协调表达重组效率可高达0 1 为了方便对b a c p a c 的操作 l e e 等构建 d y 3 8 0 菌株 2 9 1 它来源于b a c p a c 的宿主菌d h l 0 b 基因型为r e c a b a c 载体能在该菌株中稳定增殖 并可用 染色体上的r e d 基因对其修饰 d y 3 8 0 的重组效率接近d y 3 3 1 菌株 l e e 等还构建 t d y 3 8 0 来源雕j e l 2 5 0 e l 3 5 0 新菌株 2 9 1 分别以f l p e c 陀基因替换d y 3 8 0 中的t e t 基因 这2 个菌株可用r e d 基因介导同源重组 还可用f l e p 或c r e 进行位点特异性 重组 前者受温度调控 后者由阿拉伯糖诱导 d y 3 3l 和d y 3 8 0 均已成功用于修饰克隆在质粒 p 1 b a c 和p a c 中的外源 d n a a 2 4 3 0 但它们并不是b a c 和p a c 的理想宿主菌 由于某些不明原因 有些 b a c 载体不能转进d y 3 3 1 或d y 3 8 0 细胞中 因而需要一个新的能容易转迸含有 b a c p a c 菌株的系统 2 1 2 2 基于质粒的r e d 重组系统 尽管质粒携带的r e d 重组系统有很多缺陷 如质粒再不加抗性选择时容易丢 失 而维持载体稳定的抗性基因往往会影响基因替换效率 对质粒进行修饰时要 考虑质粒间的不相容性 重组效率低于位于染色体上的r e d 系统等 但是它有 个绝对优势 就是质粒容易在不同菌株间转移 因而应用范围很广 近3 年来许 多实验室已成功地将携带r e d 系统的质粒转移到沙门氏菌 痢疾杆菌等细菌中并 完成体内重组 用重组工程系统还可从这些菌株中直接克隆我们感兴趣的基因 或对染色体进行修饰 为疫苗载体研究提供技术支持 最近构建的可转移r e d 重 组质粒时p b a d 仅p 丫 而优势较大的重组质粒包括p k d 4 6 m i n i 九和 p s c l 0 1 b a d g b a a p b a d 仅p 丫是在p b a d e t 丫的基础上构建的 1 5 1 该质粒中e x o 受p b a d 调控 酏f 和g a m 组成型表达 重组效率为1 3 倍 该系统的缺陷与p b a d e t 相同 7 第一章文献综述 目前国内外应用最多的基于质粒的r e d 系统是由d a t s e n k o 等构建的低拷贝 p k d 4 6 质粒 7 1 该质粒中e x o b e t 和g a m 都受阿拉伯糖启动予的调控解决了 p b a d a d y 的g a m 基因超表达i 口 j 题 而且质粒的温度敏感型复制子使其容易从细 菌中去除 重组效率高于上述质粒和e t 重组系统 p k d 4 6 质粒仅将重组酶基因 构建到质粒中 破坏了基因表达的自然状态和比例p 而基因表达的比例失调 会大大影响重组效率 阿拉伯糖诱导是一个相当缓慢的过程 一般需要3 5 6 0 r a i n 有的实验室甚至诱导数小时 重组酶基因长时间暴露于细胞中使基因突变 的几率增j j 口1 0 倍 大肠杆菌自身的阿拉伯糖启动子在外源阿拉伯糖的诱导下会分 解阿拉伯糖 因此不同细菌中阿拉伯糖诱导的用量和诱导时间很难把握 3 2 j 质粒的拷贝数越低重组效率越高 大肠杆菌染色体上以原噬菌体状态存在的 r e d 系统的重组效率最高 是e t 系统和质粒r e d 系统的5 0 1 0 0 倍 同时为解决 p k d 4 6 1 拘 系列缺陷 2 0 0 3 年c o u r t 等构建了非复制型m i n i 膈状d n a 3 3 j m i n i 九 不仅克隆了r e d 基因 还携带了可能对r e d 协调表达及调控有影响的g a m c i 8 5 7 基 因序列 转进细菌中的w l l f l 九利用a t t p 位点整合到染色体上以单拷贝形式存在 m i n i 九的调控表达同d y 3 31 d y 3 8 0 菌株完全不同 在阻遏条件下r e d 重组功能 被完全抑制 诱导仅1 5m i n 九r e d 介导的重组就达到高峰水平 除了很易转进 宿主茵外 m i n i 九噬菌体d n a 在4 2 0 c 诱导1 5m i n 就可从染色体上切除 切除 m i n i 九的细菌能在3 7o c 存活 利用此特性很容易获得丢失m i n i 九的重组阳性克 隆 m i n i 九可用标准质粒提取试剂盒纯化 电机转化几乎能将m i n i 一九转进任何一 种大肠杆菌中 包括r e c a 突变株d h l0 b 以及d h l0 b 来源的b a c p a c 宿主菌 应 用范围广 因为是一种较好的以高水平瞬时表达噬菌体重组酶基因的重组工程系 统 有很好的应用前景 m i n i 九自身不能复制 而且从染色体上切下的几率只有 5 0 因而提取量不高 1 2 5m 1 只能提取约1 0k t g 的m i n i 九d n a 4 2 0 c 诱导表达 r e d 蛋白的同时熵基因也表达 诱导1 5m i n 就有约5 0 的m i n i 九从染色体上切下 现在还不清楚这对重组效率有什么影响 c o u r t 等用m i n i 九成功地将k a n 抗性基因插入b a c 载体中 用无选择的寡核苷 酸作为打靶分子对克隆在b a c 载体中的人类乳腺癌易感基因b r c a 2 进行单碱基 替换 m i n i 九介导的高效重组足以用p c r 的方法从电转存活细胞中筛选到阳性克 隆 而不在靶序列留下任何对基因功能有影响的选择标记基因 p s c l 0 1 b a d g b a a 是由德i n d r e s d e n 大学y o u m i n gz h a n g 博士等构建的 也 是目前应用比较广泛的r e d 系统t 3 4 1 与p k d 4 6 相同 p s c l 0 1 一b a d 一曲a a 也是在 r e c a 缺陷的大肠杆菌中使用 该质粒中e x o 6 p 厢g a m 也都受阿拉伯糖启动子的 调控 p b a d 启动子受l 阿拉伯糖诱导表达的a r a c 基因所激活 p s c l 0 1 b a d g b a a 质粒的复制子为来源 p s c l 0 1 的温度敏感性复制子 此复制 8 第一章文献综述 子在3 0 0 c 行使复制功能 在3 7 0 c 或更高温度时质粒不再复制而丢失 在r e 堪因 后面克隆有r e c a 基因 可以提高同源重组的效率 r e c a 基因也是d a p b a d 动子 启动表达的 在l 阿拉伯糖诱导下瞬时表达 因而会降低异常重组率 2 2 重组工程的应用 2 2 1 染色体上基因的修饰 敲入 敲除及替换 近几年来有许多研究者应用r e d 介导的重组工程技术对大肠杆菌染色体基 因进行了改造 如敲入 敲除及替换 p c r 合成筛选标记基因两测加上同源臂 的线性打靶序列 同源臂序列靶向性精确地界定了染色体上拟敲除的d n a 区域 或基因敲入位点 可以在不删除任何染色体序列的情况下将外源基因准确插入染 色体中 基因敲入 敲除的染色体长度可达到7 0k b 基因敲除 1 6 1 2 2 2 质粒d n a 的靶向修饰 基于九噬菌体r e d 重组酶的重组工程可以应用于质粒d n a 靶序列的基因敲 除或敲入1 3 9 1 质粒d n a 可以预先存在于受体菌内 也可以随线性打靶序列一同 转化进受体菌 由于g a m 基因表达部分抑制了r e c b c d 酶活性 导致以c o l e l 为复制子的p b r 3 2 2 质粒在宿主中以滚环方式复制 结果将环状质粒单体转变成 多聚体 多聚体形式的质粒不易发生体内同源重组 因此最好采用与线性打靶序 列共转化的方式 另外 多聚体形式往往是重组质粒和母体质粒的混合物 为了 获得纯的转化子 需要进行第2 次转化 采用r e c a 缺陷型的受体菌可以克服以 上问题 成功进行p b r 3 2 2 衍生质粒的靶向修饰 2 1 3 空隙修复 g a p r e p