子痫前期患者胎盘瘦素对血清瘦素水平及缺氧对胎盘瘦素合成的影响.doc

子痫前期患者胎盘瘦素对血清瘦素水平及缺氧对胎盘瘦素合成的影响【关键词】 先兆子痫Contribution of placental leptin to the serum levels in preeclampsia and effect of hypoxia on synthesis of placental leptinHUANG Liang, LI DongHong, YIN GuoWu, ZHAO HongXi, JIANG Feng, YAO YuanQing.Department of Obstetrics & Gynecology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, China. 【Abstract】 AIM： To investigate the contribution of placental leptin to the serum levels and the effect of hypoxia on synthesis of placental leptin. METHODS： Fifteen preeclamptic women and 20 normotensive pregnant women were recruited in present study. Leptin concentrations in peripheral venous blood samples and uterine venous blood samples were measured by radioimmunoassay. Eight cases of normal human term placental villi were cultured either in normaxia (210 mL/L O2) or in hypoxia (20 mL/L O2) followed by determining leptin in the culture medium by radioimmunoassay. RESULTS: Leptin concentrations were significantly higher in preeclamptic women than in normotensive pregnant women, both in the peripheral vein (23291287 g/L vs 1387557 g/L, P005) and uterine vein (1644862 g/L vs 11214.20 g/L, P005). Leptin concentration were significantly higher in the peripheral vein than in uterine vein, both in the preeclamptic (P005) and in normotensive pregnant women (P005). Concentrations of leptin in the culture medium were significantly increased in hypoxia than in normoxia (P005). CONCLUSION: The pathogenesis of preeclampsia may be associated with an increase of maternal serum leptin and placenta leptin, and hypoxia in placenta may be an important factor that results in preeclamptic placenta to produce more leptin. Placenta is not the principal source of the serum leptin in the preeclamptic women or normotensive pregnant women. 【Keywords】 preeclampsia; leptin;hypoxia【摘要】 目的： 探讨妊娠期高血压疾病子痫前期患者胎盘与血清瘦素水平的关系及缺氧对胎盘绒毛合成瘦素的影响.方法： 应用RIA法测定孕妇肘前静脉及胎盘附着部位子宫静脉血血清瘦素水平，其中妊娠期高血压疾病子痫前期患者(研究组)15例，正常妊娠妇女（对照组）20例；并在缺氧（20 mL/LO2）及常氧（210 mL/LO2）环境下培养8例正常足月胎盘绒毛，通过RIA法检测胎盘绒毛培养液中瘦素的含量.结果： 研究组外周血瘦素水平为23291287 g/L，对照组为1387557 g/L，两组比较差异有统计学意义（P005）；研究组子宫静脉血瘦素水平为1644862 g/L，对照组为1121420 g/L,两组比较有统计学意义（P005）研究组和对照组外周血瘦素水平均高于子宫静脉血（P005）.在缺氧条件下胎盘绒毛培养上清中瘦素的含量高于常氧条件下（P005）.结论: 妊娠期高血压疾病患者胎盘及血清中瘦素的水平升高，可能与妊娠期高血压疾病发病有关，而且胎盘缺氧可能是胎盘瘦素合成增加的重要因素之一.胎盘只是正常妊娠孕妇及妊娠期高血压疾病患者血中瘦素增加的来源之一.【关键词】 先兆子痫;瘦素;缺氧0引言妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病，是孕产妇和围生儿发病率及死亡率的主要原因.瘦素是一种神经内分泌激素，主要由脂肪组织分泌，在调节饮食、体重、能量代谢过程中发挥重要作用.近年来发现胎盘滋养细胞产生瘦素1，正常妊娠妇女血清瘦素水平较未孕妇女升高，而妊娠期高血压疾病患者血清瘦素水平则进一步升高2,妊娠期高血压疾病患者血清瘦素升高的来源仍然不明确.我们通过测定妊娠期高血压疾病子痫前期患者外周血及胎盘附着部位子宫静脉血瘦素水平，探讨子痫前期患者血中瘦素水平变化及胎盘在这一变化中的可能作用；并通过缺氧培养胎盘绒毛组织，体外模拟妊娠期高血压疾病胎盘环境，研究缺氧对胎盘绒毛合成瘦素的影响，探讨妊娠期高血压疾病胎盘瘦素合成的影响因素.1材料和方法11材料111血清标本取自200309/200406在唐都医院及陕西省纺织医院妇产科未临产即行剖宫产之孕妇.所有孕妇均月经规律，末次月经明确；无高血压、糖尿病、心脏病及肾病史，无服药史及吸烟史，孕周3540 wk.其中15例子痫前期患者纳入研究组，子痫前期诊断标准参考文献3.对照组20例，均为选择性剖宫产健康孕妇.两组孕妇的孕周、年龄及体质量指数比较，差异均无统计学意义.112胎盘绒毛取自200404/200406第四军医大学唐都医院及陕西省纺织医院妇产科行选择性剖宫产之健康孕妇8例.均为足月妊娠，孕周3740 wk，未临产，无高血压、糖尿病、心脏病及肾病史，无服药史及吸烟史.113主要试剂及仪器混合气体20 mL/L O2，50 mL/L CO2，930 mL/L N2（北京环新北环气体有限公司）；DMEM培养液（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（南京建成生物研究所）；瘦素及HCG放免测定试剂盒（北京北方生物技术研究所）；MIC101密闭培养箱（美国billupsrothenberg公司）.12方法121血清标本采集均于手术开始前抽取肘静脉血，剖宫产术中切开子宫肌层前抽取胎盘附着部位子宫表面静脉血.血样约2 mL，于室温下自然凝固，3000 r/min离心10 min，取血清置-70 保存待测.122胎盘绒毛的培养及缺氧处理当胎盘娩出后避开钙化点取35个胎盘小叶，无菌生理盐水彻底漂洗，减去蜕膜组织并分离去除较大的血管，在PBS液中将绒毛组织剪成515 mg的小块，PBS冲洗数次，每5块的绒毛组织接种到12孔细胞培养板之一孔中，每孔加含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液少许(以仅能覆盖绒毛为准)，在37,50 mL/L CO2空气条件下培养.6 h后再加入约2 mL培养液.继续培养至24 h后换液，每孔加入15 mL培养液.然后分为两组： 常氧组及缺氧组.缺氧组培养板置于直径为31 cm的MIC101密闭培养箱，打开培养箱进、出气口，以20 L/min的流速将混合气体（20 mL/L O2，50 mL/L CO2,930 mL/L N2)持续充入MIC101密闭培养箱，4 min后停止充气，同时关闭密闭培养箱的进、出气口，然后将密闭培养箱置于37培养箱中.进行缺氧培养.绒毛培养及缺氧处理参照Benyo DF等4的方法，充气的速度和时间参照培养箱说明书，并取培养液送血气检查氧分压达到Hung TH等5的要求.常氧组则在37，50 mL/L和CO2空气条件下培养.两组均分别培养4，8，12和24 h，并于各个时间点收取上清液，3000 r/min离心10 min，保存于-20 待测，同时称绒毛组织湿重.123瘦素测定采用放射免疫法测定.瘦素放免测定试剂盒批内变异系数5，批间变异系数10.操作按照试剂盒说明书，测定使用XH6010放射免疫计数器.124绒毛组织活性测定采用放射免疫法测定培养液中HCG代表其分泌功能.用比色法测定培养液中LDH代表其组织破坏情况.统计学处理： 数据以xs表示,血清瘦素水平比较用t检验.缺氧和常氧条件下的绒毛培养上清液瘦素、hCG及LDH水平比较用配对t检验，使用SPSS115软件进行分析.P005认为差异有统计学意义.2结果21子痫前期患者和正常产妇血清瘦素测定研究组外周静脉血瘦素水平高于对照组（233129 g/L vs 13956 g/L,P005）.研究组子宫静脉血瘦素水平高于对照组(16486 g/L vs 11242 g/L,P005).研究组和对照组外周静脉血瘦素水平均高于子宫静脉血（P005）.22常氧及缺氧条件下每克绒毛合成瘦素的量测定8例培养液中瘦素浓度,计算15 mL培养液中总量.并测定各孔绒毛湿重，换算为每克绒毛合成瘦素的量，单位为ng/g,结果见Tab 1.缺氧条件下，每克绒毛合成瘦素的量显著增高（P005）.表1常氧及缺氧条件下绒毛分泌瘦素的比较略23常氧及缺氧条件下胎盘绒毛分泌hCG及LDH的含量常氧及缺氧条件下各个时间点每克绒毛产生hCG及LDH的量比较无统计学差异（Tab 2,Tab 3），表明绒毛耐受缺氧.表2常氧及缺氧条件下绒毛分泌LDH的比较略3讨论近年来关于妊娠期高血压疾病患者外周血中瘦素水平增加的报道已很多.Dotsch等6发现妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中瘦素mRNA表达增加，我们观察到，妊娠期高血压疾病子痫前期患者外周血瘦素水平较正常孕妇明显升高，胎盘附着部位子宫静脉血瘦素水平也较正常孕妇明显升高，证明妊娠期高血压疾病子痫前患者胎盘瘦素的合成增加.妊娠期高血压疾病的病因学说之一是胎盘浅着床，导致滋养细胞缺血缺氧3.因此很多学者通过缺氧培养滋养细胞或胎盘绒毛来模拟妊娠期高血压疾病胎盘环境， Grosfeld等7及Mise等8均发现缺氧状态下绒癌细胞系BeWo细胞分泌瘦素增加， Grosfeld等9进一步发现，在BeWo细胞中瘦素基因的表达受低氧诱导因子1的调控.我们发现缺氧状态下体外培养的胎盘绒毛分泌瘦素增加，与国外报道一致，证明胎盘缺氧是胎盘瘦素合成增加的重要因素之一.具体的中间机制除了低氧诱导因子1之外，其他缺氧后产生的毒性因子也可能使胎盘瘦素合成增加.妊娠期人体内产生瘦素的组织主要有脂肪和胎盘，Mise等8发现妊娠期高血压疾病患者胎盘瘦素mRNA水平与血浆瘦素水平成正比，而且正常妊娠孕妇及妊娠期高血压疾病患者产后随着胎盘的排出，血浆瘦素水平急剧下降，据此认为胎盘是正常妊娠孕妇及妊娠期高血压疾病患者血浆中瘦素增加的最主要来源.而Masuzaki等1则认为这些并不能排除妊娠期脂肪合成和分泌瘦素增加的可能.实际上，妊娠期脂肪沉积平均约增加3345 g3，而且妊娠期胎盘分泌的激素绒毛膜促性腺激素、雌激素也促进脂肪细胞产生瘦素10.所以正常妊娠孕妇和妊娠期高血压疾病患者脂肪产生的瘦素也增加，其血浆中瘦素的升高不仅是因为胎盘产生瘦素，还因为脂肪产生的瘦素也增加了.妊娠期高血压疾病患者因为胎盘缺氧瘦素合成增加；妊娠期高血压疾病患者体内还存在较正常妊娠孕妇严重的高胰岛素血症，胰岛素可以促进滋养细胞及脂肪细胞合成瘦素11；另外，妊娠期高血压疾病患者血中细胞因子TNF及IL6水平也较正常妊娠孕妇更高，这些细胞因子也促进滋养细胞及脂肪细胞合成瘦素12.所有这些均使妊娠期高血压疾病患者血浆瘦素水平进一步升高.产后瘦素水平的下降不仅是因为胎盘排出，也因为促进脂肪细胞产生瘦素的激素及细胞因子水平也下降，导致脂肪细胞产生瘦素减少.Linnemann等13通过一种体外双闭环灌流胎盘的方法证明胎盘产生的瘦素只占血浆瘦素的14，并指出单独胎盘和脂肪或两者合并都不能完全解释妊娠期血浆瘦素的明显升高及产后的急剧下降.我们观察到，正常妊娠孕妇及妊娠期高血压疾病患者胎盘附着部位子宫静脉血瘦素水平均低于外周血，说明胎盘只是正常妊娠孕妇及妊娠期高血压疾病患者血中瘦素的来源之一，而不是最主要的来源.关于正常妊娠孕妇及妊娠期高血压疾病患者血清瘦素的来源还需要进一步的研究.【参考文献】1 Masuzaki H,Ogawa Y,Sagawa N,et al. Nonadipose tissue production of leptin:Leptin as novel placentaderived hormone in humans J. Nat Med,1997;3(9): 1029-1033.2 McCarthy JF, Misra DN, Roberts JM, et al. Maternal plasma leptin is increased in preeclampsia and positively correlates with fetal cord concentration J. Am J Obstet Gynecol，1999; 180(3): 731-736.3 乐杰. 妇产科学M. 第6版. 北京: 人民卫生出版社, 2004：97-106.4 Benyo DF, Miles TM, Conrad KP, et al. Hypoxia stimulates cytokine production by villous explants from the human placenta J. J Clin Endocrinol Metab，1997; 82(5): 1582-1588.5 Hung TH, CharnockJones DS, Skepper JN, et al. Secretion of tumor necrosis factoralpha from human placental tissues induced by hypoxiareoxygenation causes endothelial cell activation in vitro: A potential mediator of the inflammatory response in preeclampsia J. Am J Pathol，2004; 164(3): 1049-1061. 6 Dotsch J, Nusken KD, Knerr I, et al. Leptin and neuropeptide Y gene expression in human placenta: Ontogeny and evidence for similarityes to hypothalamic regulation J. J Clin Endocrinol Metab，1999; 84(8):2755-2758.7 Grosfeld A, Turban S, Andre J, et al. Transcriptional effect of hypoxia on placental leptin J. FEBS Lett, 2001;502(3):122-126.8 Mise H, Sagawa N, Matsumoto T, et al. Augmented placental production of leptin in preeclampsia: Possible involvement of placental hypoxia J. J Clin Endocrinol Metab，1998; 83(9): 3225-3229.9 Grosfeld A, Andre J, Mouzon SH, et al. Hypoxiainducible factor 1 transactivates the human