子宫内膜样腺癌间质细胞和癌细胞TGFβRSmads的表达.doc

子宫内膜样腺癌间质细胞和癌细胞TGFR/Smads的表达作者：王福玲,韩雪川,赵兴波,李明江,李继俊单位：山东大学附属省立医院妇产科， 济南【摘要】目的 探讨子宫内膜间质细胞转化生长因子β受体（TGFβR）、Smad蛋白（Sma and Madrelated protein )信号通路的状态和癌细胞TGFβR/Smads信号通路的关系，及其这一信号通路可能对子宫内膜癌发生发展的影响。方法 采用SP免疫组化方法检测12例子宫肌瘤、18例子宫内膜样腺癌中TGFβR、TGFβR、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达。结果 在正常子宫内膜细胞中均有TGFβR、TGFβR、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7的表达，正常子宫内膜腺体上皮细胞和间质细胞中TGFβR蛋白与Smads蛋白的表达一致，两者成正相关（r=0.86, r=0.78）；子宫内膜癌癌细胞和间质细胞中TGFβR/Smads蛋白的表达不一，子宫内膜癌本身的间质细胞TGFβR/Smads蛋白表达缺陷。结论 正常子宫增生期分泌期内膜细胞存在TGFβR/Smads信号表达，子宫内膜癌本身的间质细胞存在TGFβR/Smads信号缺陷；探讨内膜间质细胞TGFβR/Smads信号通路作用，为内膜癌的基因治疗提供了新的靶点。 【关键词】 子宫内膜肿瘤 间质细胞 转化生长因子β受体 Smadscancer cells and stromal cellsWANG Fuling, HAN Xuechuan, ZHAO Xingbo，LI Mingjiang, LI Jijun(Department of Obstetrics and Gynecology， Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China)To investigate the relationship between the status of the TGFβR/Smads signal pathway in cancer cells and in its stromal cells, and if this may affect the development of endometrioid adenocarcinoma. Methods TGFβR, TGFβR, Smad2, Smad3, Smad4 and Smad7 were determined in hysteromyoma (12 cases) and endometrioid adenocarcinoma (18 cases) by the SP immunohistochemical method. Results TGFβR, TGFβR, Smad2, Smad3, Smad4 and Smad7 were found in hysteromyoma. TGFβR expression which was in positive correlation with Smads expression in normal endometrium cells(r=0.86, r=0.78). TGFβR/Smads expression disagreed in endometrial cancer cells and stromal cells and it was not found in stromal cells of endometrial adenocarcinoma per se. Conclusions TGFβR/Smads signals exist in cells of normal endometrial proliferative /secretory phase but its pathway is defected in tumor stroma. To get the information about TGFβR/Smads signal way in stroma probably provides a neotarget for gene therapy of endometrioid carcinoma.Key words： Endometrial neoplasms； Stromal cell； Transforming growth factorβ receptor； Smads 子宫内膜癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤，其发病机制不清。近年研究提示，转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）/Smads细胞传导通路在妇科恶性肿瘤的发生发展中发挥了重要作用，并认为TGFβ是子宫内膜中的关键性细胞因子，但TGFβ/Smads在子宫内膜癌方面的研究主要是针对 内膜癌细胞的检测和施加因素1，且多局限于对TGFβ/Smads表达的检测2。本研究拟探讨TGFβR/Smads信号通路在正常子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞及其在内膜癌细胞和肿瘤间质中的表达，以及TGFβR/Smads信号通路在两种组织细胞间的表达差异，进一步观察肿瘤间质中TGFβR/Smads 信号通路的状态及其这一信号通路对内膜癌细胞的影响。 1 资料与方法 1.1 研究对象 收集山东大学附属省立医院2006年12月2007年9月手术切除的子宫内膜组织30例，其中子宫内膜癌18例，患者年龄3468岁，平均（55.94±9.23）岁；子宫肌瘤12例（视作正常子宫内膜标本）,患者年龄3261岁，平均（47.67±8.07）岁。1.2 实验方法 标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片，行常规组织学染色，镜检确定诊断并选取腺细胞和间质细胞均存在的部位用于免疫组织化学（SP法）染色(操作步骤参照试剂盒说明)。实验试剂TGFβR、TGFβR和smad7单克隆抗体购自R&D公司，smad2、smad3和smad7单克隆抗体购自abcam公司。SP试剂盒（含二抗）购自北京中杉公司。 已知阳性标本切片(乳腺癌标本)用于阳性对照，PBS缓冲液代替一抗用于阴性对照。1.3 结果判断 细胞浆/核出现棕黄色颗粒为阳性染色，组织学评分即H评分为∑∏（i+1）3,其中i代表染色强度。将其染色强度分为3级：1级为淡黄色颗粒，2级为黄色颗粒，3级为棕黄色颗粒，分别赋值1，2，3分；其中0为阴性，赋值0分；∏为每一染色强度的细胞所占的比例（0100%）。每个样本随机选取5个高倍镜视野，取5个视野的均值作为最终得分。1.4 统计学处理 两组间的比较采用t检验，所有数据采用SPSS11.0统计软件处理。 P<0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 TGFβR、TGFβR和Smads蛋白在癌细胞、腺上皮和间质细胞中的表达 见表1，表2。与正常子宫内膜组的腺细胞和间质细胞中TGFβR阳性表达（图1A）相比较，子宫内膜样腺癌癌细胞中蛋白TGFβR的表达降低，但无统计学差异（P=0.5714）；子宫内膜癌本身的间质细胞中TGFβR表达降低，差异有统计学意义（P=0.0491），见图1B。 子宫内膜细胞中TGFβR的表达（SP法，×100）表2 各指标在子宫内膜癌和正常子宫内膜细胞中的表达差异 正常子宫内膜组的腺细胞和间质细胞中均有TGFβR的表达（图2A）；子宫内膜样腺癌癌细胞中TGFβR蛋白的表达显著增加(P=0.0070)；间质细胞中TGFβR表达虽降低，但与正常子宫内膜相比，差异无统计学意义（P=0.0521），见表2，图2B。与正常子宫内膜相比，子宫内膜癌癌细胞中Smad2和Smad4的表达（图3，图4）增加，而其间质细胞中二者的表达基本缺如（P=0.0278，P=0.0315），见表2。Smad3在癌细胞中的表达升高，在间质细胞中的表达降低（表1，图5），而Smad7在癌细胞和间质细胞中的表达均降低（图6）；与正常子宫内膜腺上皮和其间质细胞相比，无统计学差异（P=0.3421，P=0.0686），见表2。子宫内膜细胞TGFβR的表达（SP法，×100）2.2 TGFβR及Smads蛋白(Smaand Madrelated protein)在腺体上皮细胞和间质细胞表达间的关系 TGFβR/Smads蛋白在正常子宫内膜腺体上皮细胞和间质细胞中均有表达，TGFβ蛋白与Smads蛋白的表达一致，两者成正相关（r=0.86, r=0.78）。子宫内膜癌癌细胞和间质细胞中TGFβR/Smads蛋白的表达不一（表2）。3 讨 论 TGFβ/Smads蛋白等构成一个肿瘤抑制通路，此信号通路中任一环节异常都可引起信号通路的紊乱而使细胞逃避TGFβ介导的生长抑制效应，导致多种肿瘤发生。本研究首先探讨了TGFβR蛋白在子宫内膜细胞中的表达情况。免疫组化结果显示，TGFβR和TGFβR在正常子宫内膜腺上皮和间质细胞中均有表达，且表达成正相关。而子宫内膜样腺癌细胞中这两种受体的表达不同，蛋白TGFβR的表达显著降低，TGFβR蛋白的表达却显著增加。TGFβR和TGFβR在子宫内膜癌本身的间质细胞中表达降低，在子宫内膜癌细胞中也表达不一，与正常子宫内膜腺细胞和间质细胞相比，癌细胞及其间质细胞中TGFβR的表达发生了紊乱。研究显示4，TGFβR表达受抑制是肿瘤细胞逃避TGFβ负调节的常见机制，TGFβR表达的降低与对TGFβ介导的生物学效应的减弱有关。虽然TGFβ可显著抑制正常上皮细胞的增殖，但癌细胞失去了这种生长抑制效应或改变了这种信号通路则可促进癌细胞的增殖，并以自分泌形式进一步促进肿瘤细胞的生长和侵袭5。本研究还探讨了Smads蛋白在子宫内膜细胞中的表达状态。在TGFβ信号由细胞膜到细胞核的传递过程中，Smads蛋白发挥关键作用。Smads蛋白是TGFβ信号转导通路的细胞内信号转导分子，包括3类：RSmad，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8；CoSmad，包括Smad4；ISmad，包括Smad6和Smad76。Smads蛋白作为受体后下游信号传导分子，其失活或突变同样可以导致TGFβ生长抑制作用消失。 TGFβ通过膜受体TGFβR和TGFβR活化前体物质后，结合TGFβR，形成TGFβR复合物并迅速引起TGFβR磷酸化，继而活化/磷酸化RSmad蛋白，使其C末端的丝氨酸残基磷酸化，并与CoSmad蛋白结合形成异源复合物，转位到核，激活靶基因的转录。TGFβ信号通路要发挥正常的生理、病理作用，与Smads，尤其是Smad2、Smad3、Smad4的正常与否密切相关78。与Luo等9采用子宫肌瘤作为正常子宫内膜为研究对象的研究结果一致，本研究结果显示，子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞中均有Smad2、Smad3、Smad4和Smad7的表达，Smads蛋白定位在上皮和间质细胞的胞浆/胞核。Smads蛋白在内膜癌细胞和间质细胞中的表达与在子宫内膜细胞中的表达存在显著差异，除Smad7蛋白外，其他三种蛋白在癌细胞中的表达均升高；而这四种蛋白在肿瘤间质的表达却呈现下降或缺如现象。肿瘤间质作为肿瘤生长的微环境，是影响肿瘤进展的重要因子，决定着肿瘤细胞的转移。对于肿瘤细胞来说，间质细胞的变化将促进肿瘤细胞的侵袭和转移10。TGFβ/Smads蛋白可调节正常子宫内膜腺上皮和间质细胞的生长及子宫内膜癌的生长，间质细胞TGFβ/Smads信号通路的失监控状态是关键环节。本研究重点检测了TGFβR/Smads蛋白在肿瘤间质细胞中的表达情况及其与正常内膜间质细胞中的表达差异，结果显示，TGFβR/Smads蛋白在肿瘤间质中的表达与在癌细胞中的表达相似，即TGFβR/Smads信号通路紊乱，间质细胞中各蛋白的表达均下降，尤以Smad2和Smad4明显，呈基本缺失状态，子宫内膜癌本身的间质细胞存在TGFβR/Smads信号联系缺陷，这可能是子宫内膜癌发生的机制之一。间质细胞作为肿瘤生长的微环境，其信号转导通路TGFβR/Smads的改变，必然在一定程度上影响肿瘤细胞的发生发展。至于间质细胞TGFβR/Smads信号通路和癌细胞TGFβR/Smads信号通路间的关系及其改变这一信号通路对内膜癌细胞的影响，尚待进一步的研究。【参考文献】 1 ZK(#Dowdy S C, Mariani A, Reinholz M M, et al. 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