兔肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素K3的还原作用和产物的鉴定.doc

兔肝辅酶依赖性视黄醛还原酶在大肠杆菌中的表达及其对维生素K3的还原作用和产物的鉴定作者：肖李锋,刘戈飞,宋旭红,谢健平,张巧霞单位：汕头大学医学院分子生物学中心，广东 汕头 515041【摘要】 目的：检测兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NDRR)对维生素K3的催化活性并对该酶还原K3所生成的产物进行鉴定。方法：构建含6×His标签的兔NDRR的表达菌株，诱导表达并超声裂解后，通过Ni2+亲和层析纯化得到重组兔NDRR。在相对去氧隔绝空气反应体系以及存在高浓度十二烷基磺酸钠的反应条件下，利用高效液相色谱(HPLC)对兔NDRR还原K3的催化活性进行酶动力学研究。利用化学合成，HPLC及荧光光谱扫描对其还原产物进行鉴定。结果：诱导表达后的细菌裂解上清液经一步亲和层析后得到单一酶蛋白，其对K3的比活性分别是原空白菌裂解上清液和经诱导表达后的菌裂解上清液的比活性的18.6和7.3倍。经过HPLC测定，兔NDRR对K3的Km值为30.7，Vmax 0.046μmoL/(min•mg)。利用四氢硼酸钠与K3化学合成的产物进行HPLC分析，其保留时间与酶反应所产生的产物峰保留时间一致，而且反应后短时间内能利用荧光光谱扫描得到K4相应的光谱图。结论：兔NDRR对K3存在还原活性，并生成K4。 【关键词】 兔辅酶依赖性视黄醛还原酶;维生素K3;维生素K4;高效液相色谱Rabbit Liver NADP(H)-Dependent Retinal Reductase Expressed in Escherichia coli: Reduction of Menadione and Product IdentificationXIAO Li-feng, LIU Ge-fei, SONG Xu-hong, XIE Jian-ping, ZHANG Qiao-xia, LI Rui, HUNAG Dong-yangCenter for Molecular Biology, Shantou University Medical College, Shantou 515041, ChinaAbstractObjective: To detect the reduction of rabbit NADP(H)-dependent retinal reductase(NDRR)on menadione， and to identify its reductive production. Methods: Rabbit-NDRR was expressed in BL21-AITM with 6×His-Tag. The recombinant protein was purified by affinity chromatography on Ni2+-NTA-agarose after the transformed cells were sonicatied. The kinetic parameters of rabbit-NDRR were determined by HPLC under anaerobic condition and high-concentration of sodium dodecylsulphate(SDS). The reductive production was identified by chemical synthesis, high performance liquid chromatography(HPLC)as well as fluorescent scanning. Results: The homogeneous enzyme was obtained on a single step by affinity chromatography from the supernatant of transformed cells, and its reductive activity of menadione was 18.6-fold of the supernatant of the empty-transformed cells and 7.3-fold of transformed cells. The Km and Vmax detected by HPLC were 30.7 and 0.046 μmoL/(min•mg)respectively. The retention time of the product menadiol produced by menadione and NaBH4 or reducted by the enzyme was identical, and the fluorescence spectrum of menadiol could be obtained after the chemical reaction of menadione and NaBH4. Conclusion: Rabbit-NDRR can reduct menadione and its reductive product is menadiol.Key Wordsrabbit-NADP(H)-dependent retinal reductase; menadione; menadiol; high performance liquid chromatography 天然维生素K有K1和K2两种形式。前者主要从绿色植物中提取，而后者则主要由细菌合成。两者广泛存在于自然界，而K3和K4则主要由人工合成。从某种意义上说K3是K1、K2的前体，而绝大部分维生素K衍生物是从K3中合成来的。以前认为K3不是生理性物质，但最新发现口服K1、K2在体内可转化为K3并从尿液中排出。所以K3也是存在于人体内的,并可能发挥着某些生理作用。兔辅酶依赖性视黄醛还原酶(NADP(H)-dependent retinal reductase，NDRR)是从兔肝中发现并纯化的一种能催化视黄醇和视黄醛之间相互转换的脱氢还原酶，该酶在体外实验中对视黄醛有很高的底物特异性和亲和性，在体内对类视黄醇类物质的稳态起着重要的调节作用3,4。实验中，我们发现兔NDRR对K3具有较强的还原作用，所以我们将对兔NDRR催化K3的酶动力学活性进行研究，并对其产物进行鉴定。1 材料与方法1.1 材料 K3，NADPH，十二烷基磺酸钠(SDS)(Sigma公司，美国)、高效液相色谱(HPLC)级甲醇(Meker公司，美国)、Ni2+琼脂糖凝胶(Amersham公司，瑞典)、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国)；其他为进口或国产分析纯试剂。1.2 兔NDRR表达菌株的构建及诱导表达 本课题组已在先前的实验中成功的克隆出兔NDRR的全长cDNA序列5，并构建了含有兔NDRR编码区全长序列的原核表达质粒，其载体为pDEST17(含6×His-Tag)6。转化该表达质粒至E.coliBL21-AITM感受态细胞。挑选菌落PCR阳性细菌接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中于37，230r/min培养至对数生长期(OD600≈0.4)，加入诱导剂(L-阿拉伯糖)至终浓度(0.2%)继续培养4h。将菌液4000g，离心10min后收集菌体，用PBS(25mmol/L、pH 7.4)溶液重悬并洗涤2次。再次重悬后加入溶菌酶至100μg/mL，冰上孵育30min后于400W条件下超声裂菌，每超声10s间隔10s，共1520次至菌液不再粘稠。细菌裂解液4，15000g，离心10min后收集上清液，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析并利用紫外分光光度仪进行活性检测。1.3 兔NDRR重组蛋白的纯化 应用Ni2+亲和层析技术对重组兔NDRR进行纯化。取2mL Ni2+琼脂装柱(柱高约1cm)，用1015倍柱体积的磷酸钠缓冲液(30mmol/L)(pH 7.4,含0.5mmol/L NaCl及10mmol/L咪唑)平衡后细菌裂解上清液30mL通过蠕动泵缓慢加入到Ni2+柱中，用10倍柱体积的上述磷酸钠缓冲液平衡。再分别用35倍柱体积的含250mmol/L及500mmol/L咪唑的30mmol/L磷酸钠缓冲液进行洗脱，流速1mL/min。收集各部分流出液，进行蛋白浓度测定，SDS-PAGE分析及酶活性测定。1.4 SDS-PAGE分析，蛋白浓度及活性测定 收取Ni2+柱纯化过程中的部分流出液进行SDS-PAGE分析。实验中选用质量分数12%的分离胶，恒压100V，电泳120min。待电泳结束后，将凝胶用考马斯亮蓝(R250)染色。 按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书配置BCA工作液，以牛血清白蛋白为标准，37水浴30min后，在DU650型可见光-紫外分光光度仪(Beckman公司，美国)562nm条件下进行蛋白浓度分析。 对细菌裂解上清液及Ni2+柱纯化过程中的各部分流出液进行酶活性检测。在1mL的反应体系中以10mmol/L磷酸钠盐为缓冲溶液，分别加入30mmol/L的底物维生素K3(溶于乙醇)5μL及30mmol/L的NADPH(溶于0.4mmol/L的NaOH溶液)7μL。37水浴10min后加入10μL的不同浓度蛋白酶溶液(37水浴预热10min)启动酶催化反应，加入蛋白酶溶液后30s内在可见光-紫外分光光度仪340nm条件下检测NAPDH的消耗。1.5 用HPLC进行酶动力学研究 本实验中我们用HPLC在一个相对去除并隔离空气的条件下进行酶动力学研究。应用C18反应色谱柱，以体积百分比甲醇水甲酸=6534.90.1的混合液为流动相，流速1.0mL/min，检测波长265nm。在1mL的反应体系中以10mmol/L磷酸钠盐溶液为反应缓冲溶液，加入30mmol/L NADPH 7μL和K3，并加入增溶剂SDS至终浓度0.2mol/L，使K3在反应体系中达到较高的溶解度。将上述混合溶液置于3mL惰气保护真空采血管中，于超声滤器中超声20min以尽量去除溶解在溶液中的空气，随即用N↑吹赶管中气体后立即盖紧橡皮盖以密封。再用3mL注射器经橡皮盖插入管中抽去其中的部分N↑使管中形成一定的负压状态。预热纯化的兔NDRR酶蛋白溶液及反应溶液，用20μL加样器接上3mL的注射器针头后取20μL纯化酶蛋白溶液，经橡皮盖插入管中，蛋白酶溶液在负压条件下自动吸入管中，迅速拔除注射器针头，旋转管一周使附壁的酶蛋白溶液加入到反应体系，37水浴2min后，迅速用流动相(超声滤气20min)稀释100倍后取10μL上样。分别测定底物K3在10、25、50、75、100μmol/L时的底物消耗。整个过程避光操作，且要求操作快速一致以减小空气等外界因素对实验的干扰。实验重复6次，利用双倒数法计算兔NDRR对底物K3的动力学常数。1.6 产物鉴定 取21mg四氢硼酸钠(NaBH4)溶解于1mL的KOH溶液(0.1mol/L)，取0.5mL上述溶液加入到0.4mL的K3(溶解于质量分数30的二甲基甲酰胺)溶液中，立即行荧光光谱扫描7。荧光光谱扫描仪激发光狭窄宽度及发射光狭窄宽度均设定为30nm，光谱扫描范围200700nm。取反应后的溶液用HPLC流动相稀释100倍后进行HPLC测定。2 结果2.1 兔NDRR表达菌株的构建及诱导表达 通过菌落PCR产物的琼脂糖电泳分析进行验证，显示在800bp附近出现一明显亮带，与兔NDRR全长DNA序列768bp相一致(图1)。SDS-PAGE分析可见经L-阿拉伯糖诱导4h后，在分子量2535之间诱导后较诱导前出现一明显蛋白带，与兔NDRR分子量29.6ku相符合(图2)。2.2 兔NDRR表达蛋白纯化，蛋白浓度及比活性测定 SDS-PAGE分析结果显示，经500mmol/L高浓度咪唑溶液洗脱后，在分子量约为30ku处得到单一条带，即为目的蛋白兔NDRR(图3)。利用BCA蛋白浓度测定法对各步骤流出液成分进行蛋白浓度的测定(表1)。由于BL21-AI空白菌裂解上清液也存在对K3的还原活性，所以我们无法知道兔NDRR经过Ni2+柱后的纯化倍数，但其比活性分别是原来的空白菌裂解上清液和经诱导表达后的菌裂解上清液的比活性的18.6和7.3倍。表1 重组兔NDRR的纯化（略）2.3 用HPLC进行酶动力学研究及产物鉴定 在相对去除并隔离空气的反应容器及高浓度的SDS条件下，检测兔NDRR对不同浓度底物K3的催化活性，用双倒数法求得该酶对K3的Km值为30.7，Vmax 0.046μmoL/(min•mg)(图4)。 利用HPLC对K4化学合成后的产物进行检测，相对于空白对照(图5A)可见在4min处出现了一产物峰(图5C)，利用同样的合成方法，在200700nm处立即对应后的混合物进行荧光光谱扫描(图6)，而对单独K3和NaBH4溶液进行荧光光谱扫描无波形，证实该荧光波形是生成的K4所产生的，而其在HPLC中的保留时间与兔NDRR对K3反应后出现的一产物峰的保留时间一致(图5B)。3 讨论 醌类的还原有一电子转移途径和两电子转移途径8，前者生成红色半醌，后者生成氢醌，半醌在1位或4位上存在1个羟基，而氢醌在1、4位上都有羟基，两者都很不稳定，在有氧气存在的条件下容易被自动氧化。我们构建了一个去除O2↑并相对隔绝空气的反应体系，将所有的反应液超声滤气，大大的减少了空气中和溶解于溶液中的O2↑对反应的干扰，对K4起一定的保护作用。实验结果表明，在我们构建的反应容器中，从反应开始后出现的深红色退变为淡黄色的时间明显减缓延长(约3h)，而在一般的反应容器中这一过程只需30min，说明我们构建的反应容器能有效的减缓K4的氧化作用。在加入蛋白酶启动反应时，我们用微量加样器接上3mL注射器针头的装置来加样，利用其吸取20μL超纯水并称重，通过称量所取超纯水的重量,证实其准确性跟普通的微量加样器相一致。我们利用反应容器里面的负压状态，将注射器针头内的20μL蛋白溶液吸入反应容器里面，这样更保证了加样的准确性。另外，K3在水溶液中的溶解度相对较小。在利用HPLC对兔NDRR进行酶动力学研究时，我们需要K3能够在反应溶液中达到较高的溶解度。我们发现SDS作为增溶剂在0.2mol/L的浓度下可使K3在水中的溶解度提高约16倍，达21.3mmol/L。而高浓度SDS的存在，在溶液中形成胶束，不仅不会给HPLC带来杂质峰，反而可为兔NDRR的催化反应提供一个良好的环境，这与文献相一致9。 在进行酶动力学研究中我们采用计算底物K3消耗量的方法测定Km，因为产物的生成没有能够象底物K3一样与反应时间和加入反应体系中的酶蛋白量形成较好的线型关系,无法建立稳定的酶反应进程曲线和酶浓度曲线，这可能是因为在酶反应过程中有其他的产物生成,此点可从图5C中看出。 维生素K的种类很多，但是在体内主要是以K1和K2为主，它们是维生素K的主要活性形式，在凝血等方面发挥着重要的生理作用。而K3在体内可与K1和K2互相转化，但具体的转化途径尚有待进一步研究。我们通过实验发现兔NDRR对K3存在还原作用，而其产物在HPLC中的保留时间与化学合成的K4的保留时间相一致(都为4min)。所以K4是兔NDRR对K3中的1，4位2个羰基还原成羟基后生成的还原产物。K3是K1和K2的重要合成来源，虽然我们没有测得兔NDRR对K1和K2存在活性，但在体内K3跟K1一样能转化为K2而发挥作用10,11，而K1与K2又可转化为K3，所以兔NDRR有可能通过调节体内K3而达到对K1和K2的调节，从而发挥相应的生理作用。【参考文献】 1Nelsestuen GL. Enhancement of vitamin-K-dependent protein function by modification of the gamma-carboxyglutamic acid domain: studies of protein C and factor VIIJ. Trends Cardiovasc Med, 1999, 9(6): 162-167.2Thijssen HH, Vervoort LM, Schurgers LJ. et al. Menadione is a metabolite of oral vitamin KJ. Br J Nutr， 2006， 95(2): 260-266.3Huang DY, Ichikawa Y. Purification and characterization of a novel cytosolic NADP(H)-dependent retinol oxidoreductase from rabbit liverJ. Biochim Biophys Acta， 1997， 1 338(1): 47-59.4Du K, Liu GF, Xie JP, et al. A 27.368 kDa retinal reductase in New Zealand white rabbit liver cytosol encoded by the peroxisomal retinol dehydrogenase-reductase cDNA: purification and characterization of the enzymeJ. Biochem Cell Biol， 2007， 85(2): 209-217.5杜昆, 谢建平, 刘戈飞, 等. Cloning and Analysis of NADP(H)-dependent Retinol Dehydrogenase/Reductase Full-length cDNA in Rabbit LiverJ. 汕头大学医学院学报， 2006， 19(3): 129-131，135.6谢建平, 刘戈飞, 宋旭红, 等. Functional Expression, Purification and Activity Identification of Rabbit NADP(H)-Dependent Retinol Dehydrogenase/ReductaseJ. 汕头大学医学院学报， 2007， 20(1): 10-14.7Yashiki Y, Yamashoji S. Extracellular reduction of menadione and ferricyanide in yeast cell suspensionJ. J Ferment Bioeng， 1996， 82: 319-