（微生物学专业论文）产邻苯二酚工程菌的构建及发酵条件的优化.pdf

摘要 苯胺用途广 危害大 对它的生物法处理潜力很大 在好氧菌中 苯胺双加氧酶基因簇是降解苯胺的关键基因 编码苯胺降解途径的第 一个酶 负责将苯胺转化成为邻苯二酚 而邻苯二酚是一种重要的化 工产品 用途广泛 需求量大 对其的生物法生产与许多传统方法相 比具有更大的优势 用实验室保存的一株能高效降解苯胺的不动杆菌a n a 5 构建了 x b a i 完全酶切的基因文库 通过菌落原位杂交 结合功能筛选等方法 从中筛选到了阳性克隆 经亚克隆测序拼接得到了完整的苯胺双加氧 酶基因簇 序列分析表明该基因簇包含6 个完整的o r f 有启动子特 征序列 全序列与已报道的不动杆菌y a a 的苯胺双加氧酶基因簇在氨 基酸水平上有较高的同源性 经实验发现 该基因簇在连接于无启动 子的p l a f r 6 载体上时表达效果较好 用此重组质粒构建了基因工程 菌 经发酵条件优化 发现该工程菌在苯胺浓度0 5 m g m l 采用l b 培养基 ec o i ld h 5n 为宿主菌 于3 7 c 培养 接种量为3 的条件 下 邻苯二酚产量在2 0 h 达到0 5 4 6 m g m l 底物分子水平转化率可达 9 2 4 f o r m a t i o no fr e c o m b i n a n ts t r a i n p r o d u c i n gc a t e c h o la n do p t i m i z a t i o n o ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s a b s t r a c t a n i l i n ei saw i d e l yu s e da n dp o i s o n o u sc o m p o u n d a n di t sb i o d e g r a d e h a sah u g ei n d u s t r i a li n t e r e s t i na e r o b i c m i c o o r g a n i s m s a n i l i n e d i o x y g e n a s eg e n ec l u s t e rp l a y sa ne s s e n t i a lr o l ei nd e g r a d e i n ga n i l i n eb y e n c o d i n gt h ef i r s te n z y m ei nt h i sm e t a b o l i s m a n dc a t a l y z e s a n i l i n et o c a t e c h 0 1 c a t e c h o li sa ni m p o r t a n tc o m p o u n da n di su s e dw i d e l yi ni n d u s t r y p r o d u c i n gc a t e c h o lb ym i c r o o r g a n i s mh a sm o r ea d v a n t a g e st h a nb y t r a d i t i o n a lm e t h o r d s a g e n el i b r a r yw a sc o n s t r u c t e dw i t ht h ec h r o m o s o m a ld n a i s o l a t e d f r o ma c i n e t o b a c t e rs p s t r a i na n a 5 t h i ss t r a i ni sa b l et ou t i l i z ea n i l i n ea s t h es o l ec a r b o n n i t r o g e na n de n e r g ys o u r c e ap o s i t i v ec l o n ew a ss e l e c t e d b yc l o n ei n s i t uh y b r i d i z a t i o na n df u n c t i o n a ls c r e e n i n g ac o m p l e t ea n i l i n e d i o x y g e n a s eg e n ec l u s t e rw a so b t a i n e dt h r o u g hs u b c l o n i n ga n dj o i n t i n g s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e d t h a tt h eg e n ec l u s t e rh a ds i xi n t a c to r f s a h e a d o fw h i c ht h e r ew a sap r o m o t e r a n dt h ew h o l es e q u e n c eh a dh i g hs i m i l a r i 哆 w i t ht h a to fa c i n e t o b a c t e rs p 删a ta m i n oa c i dl e v e l t h eg e n ec l u s t e r w a sc l o n e di n t oac o s m i dv e c t o rp l a f r 6w h i c hh a sn op r o m o t e rt of o r m t h rr e c o m b i n a n tp l a s m i dp g x a 6 9 a n dt h i sp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t o e c o l id h 5 q t oc o n s t r u c tar e c o m b i n a n ts t r a i na c 0 3 n er e s u l ts h o w e d t h a tt h eg e n ec l u s t e re x p r e s s e de f f e c t i v e l yi ns t r a i na c 0 3 a f t e ro p t i m i z i n g t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h i sr e c o m b i n a n ts t r a i n f o rp r o d u c i n g c a t e c h l o w e c o n f i r m e dl ba st h ef i n a l m e d i u m p h 7 0 a n i l i n e c o n c e n t r a t i o n0 5 m g m l e c o l id h 5 qa st h eh o s t i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e 3 7 c a m o u n to fi n o c u l u m3 u n d e ra b o v ec o n d i t i o n s t h ey i e l do f c a t e c h o lc o u l dg e tt o0 5 4 6 m g m l a n dt h ec o n v e r t i n gr a t eo fs u b s t r a t ea t m o l e c u l el e v e lc o u l dg e tt o9 2 4 k e yw o r d s a n i l i n e a n i l i n ed i o x y g e n a s eg e n ec l u s t e r c a t e c h o l r e c o m b i n a n ts t r a i n 广西大学司陆掌位论文产邻苯 酚工程菌的构建及发酵条件的优化 1 1 苯胺 1 1 1 苯胺特性 第一章前言 苯胺 a n i l i n e 俗称阿尼林油 分子式c h n 外观为无色或浅黄色透明油状液 体 具有强烈的刺激性气味 熔点 6 3 沸点1 8 4 c 相对密度1 0 2 1 7 2 0 4 c 折光率1 5 8 6 3 闪点7 0 暴露在空气中或日光下易变成棕色 苯胺微溶于水 能与乙醇 乙醚 丙酮 四氯化碳以及苯混溶 也可溶于溶剂汽油 苯胺的化学 性质比较活泼 能与盐酸或硫酸反应生成相应的盐酸盐或硫酸盐 也可发生卤化 乙酰化 重氮化和氧化还原等反应 1 1 苯胺是一种重要的化工原料 广泛应用于国防 印染 塑料 油漆 农药和 医药工业等 同时也是严重污染环境和危害人体健康的有害物质 是一种 三致 物质1 2 3 1 可以被皮肽吸收或经食道吞咽或经呼吸道吸入 由于苯胺对生态生物的 高度毒性 已经被列入 中国环境优先污染物黑名单 中 在工业排水中要求严 格控制 目前 国内每年生产苯胺8 0 0 0 0t 以上 其下游产品有1 5 0 余种 全世界 每年排入环境中的苯胺约为3 0 0 0 0t1 1 随着化工工业的发展 苯胺的需求呈明显 上升趋势 由此进入环境的量也会越来越多 对环境的毒害也会越来越大 如何 减少苯胺对环境的污染 已经逐渐引起了人们的注意 因此 对苯胺的特性 作 用机理 降解基冈 微7 l 物筛选及基因工稆的研究受到广泛的关注1 4 5 j 1 t 2 苯胺的生物处理 目i 国内外对苯胺废水的处理主要有物理 化学 生物等方法 但基本处于 研究的起步阶段 由于苯胺废水的毒性强 生物降解性差 现有的生化处理系统难以有效去除 产邻苯 酚工程菌的构建a 裳醇条件的优化 污染 但利用微生物的代谢活性处理环境中的有机污染物由于投资少 占地少也 不需要特殊设备而倍受青睐 尤其是随着高效苯胺降解茵的筛选分离 生物法处 理苯胺废水显示出越来越大的潜力 g h e e w a h a s h 和a p a n n a c h h a t r e 利用序批式反应器工艺中活性污泥测定 废水中高浓度苯胺对消化作用的抑制作用 结果表明以苯胺为唯一碳源 借助微 生物的有效硝化可以将3 5 0 m g l 的苯胺浓度降解到4 m g l 以下 此时苯胺不会对 起硝化作用的微生物的生长产生抑制1 6 o n e i l lej 和k n a p pj s 等分析了不 同影响条件下 如p h n a c i 浓度 苯胺浓度 硝酸盐 硫酸盐等 细菌菌群对工 业废水中苯胺的降解情况 为实现大规模处理含苯胺废水提供可行性依掘 7 古杏 红等采用厌氧水解一生物接触氧化法处理苯胺类化工废水 并在生物接触氧化池 中引入苯胺特效降解菌一s t rn i t r o 结果表明该工艺厌氧段能增强系统耐冲击 负荷能力 并能有效提高废水的可生化性 s t rn i n 的菌能有效去除废水中的苯 胺 出水达到一级排放标准l g l 1 1 3 降解苯胺的微生物 微生物在环境有机化学污染物的转化和降解方面起主导作用 9 1 2 1 近几十年的 研究表明 许多微生物参与了此类有机毒物的具有重要环保意义的生物降解反应 目前 国内外的研究者对苯胺降解菌已经丌展了大量的研究工作 从长期受污染 的土壤或活性污泥中分离鉴定出藻类 真菌及多种细菌等 研究进展见表i i 许多科学家对苯胺降解菌的功能特性和遗传机理进行了大量而深入的研究 揭示了微生物降解苯胺的生化机理与及代谢途径中编码各类酶所需要的基因及其 表达系统 11 4 微生物降解苯胺的生化机理 苯胺降解基因通常成簇排列 一些位于质粒上 一些位于染色体上 在好氧 条件下苯胺的微生物降解可以通过两种代谢途径 即邻位 o r t h o 2 5 3 0 扎4 2 1 和间位 m e t a 1 2 2 4 9 5 1 1 代谢途径 分别由邻苯二酚1 2 双加氧酶或邻苯二酚2 3 双加氧酶 催化 这两种途径的前两步反应是相同的 都是由苯胺双加氧酶催化苯胺氧化成 邻苯二酚 邻苯二酚以后的反应则不同 当苯胺通过邻位代谢途径时 在两个羟 2 广西大掌硕士学位论文 产邻 幕 酚工程菌的构建a 发酵条件的优化 表1 1 已报道的苯胺降解微生物 t a b l el it h er e p o r t e dm i c r o o r g a n i s m so f d e g r a d i n ga n i l i n e 研究者 降解曲株 刘志培 杨惠芳 周培璜d e l f t i a a c i d o v o r a n sa n 3 菌株 k o n o p k a a d k n i 曲 a n d r f t u r c o w y n d h a m r c h y u n g y e e lk a h n g a n dj e r o m ej k u k o r m c c l u r e n c w a a n dv e n a b l e se ta 1 f u j i i t t a k e o m a n dm a c d a y e l a l a o k i k o h t s u k a k a n ds h i n k e r e ta 1 k i m s i l e e m s h a n d c h o i j s e l a l a o k i k s h i n k e r a n dn i s h i r a h e m t i a z i g s a t a r i i m a n dm a z a h e r i o n e m i c h a e l l c h r i s t e l h a n dg u n t h r e d a o k i k k o d a m a a n dn s h i n k e r e la b o o n n b m n s b a c h ei l a n d t o p e m e t a l 3 p s e u d o m o n a ss t r a i n k l 假单孢菌k 1 菌株 1 5 1 a c i n e c t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s 乙酸钙不动杆曲 1 p s e u d o m o n a s p u t i d au c c 2 2 恶臭假单胞菌i j c c 2 2 菌株1 1 1 1 a c i n e c t o b a c t e rs p s t r a i ny a a 不动杆菌y 从菌株瞄 i f r a t e u r i as p e c i e s a n a 1 8 弗拉特氏卤a n a 1 8 囟株口 o i a c i n e t o b a c t e rt w o 卵ik 2 4 鲁氏不动杆卤k 2 4 曲株 3 1 3 5 1 r h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s a n 一1 3 红串红球菌a n 1 3 菌株 3 6 3 7 f u s a r i u ms p 镰刀霉 r h i z o p u ss p 根犁3 8 1 s c e c e n e d e s m u so b l i q r n u s 斜生栅藻 3 9 1 p s e u d o m o n a ss p e c i e sa w 2 假单胞卤a w 2 k 1 4 0 4 1 1 ct e s t o s t e r o n i1 2 na c i d o v o r a n sc a 2 8 na c i d o v o r a n sb n 3 1 d a c t d o v o r a n sl m e l 柚dn 韶锄朋彻格b 8 c 4 2 4 5 j r 西大掌硕士掌位论文产邻苯 酚工程菌的构建及裳酵条件的优化 基之间切割邻苯二酚 再经多步反应产生三羧酸循环的中间代谢物琥珀酸和乙酰 辅酶a 当苯胺通过间位代谢途径时 在其中一个羟基的旁侧切割儿茶酚 最后 产生丙酮酸和乙醛 进入t c a 循环 d e l f t i aa c i d o v o r a n s a n 3 菌株 不动杆菌y a a 菌株 恶臭假单胞菌u c c 2 2 菌株及假单胞菌a w 2 菌株的苯胺双加氧酶属于诱导酶 主要是通过间位代谢途 径降解苯胺 在降解过程中显现出黄色 表明苯胺氧化代谢产物中间体2 羟基己 二烯半醛酸的生成 5 2 1 如图1 一l 所示 而鲁氏不动杆菌k 2 4 菌株和弗拉特氏菌 a n a 1 8 菌株是已报道的通过邻位途径代谢的苯敝降解菌 如图l 一2 所示 4 h y d r o x y 2 o x o v a l e r a t ea c i d c a t e c h o l q c 鲁o o h睇 c 嘞 o d l a l d o l m a c e l 掣 y d 8 毒 t c a p u v a t e 图1 1d e 肌k a c i d o v o r a n s a n 3 菌株降解苯胺的间位 m e t a 代谢途径 f i g i im e t a b o l i s mm e t ap a t h w a yo f m i c r o b i a ld e g r a d a t i o no f a n i l i n e w i t hd e l f t i aa c i d o v o r a n s a n 3 幽q t a i a l 2 b r o h 臼 a m h n e c a t e c h o l o 竺一 二 乒 一 肛k e t o a d l p a t e 3 k e t o a d i p a t ee n o l l a c t o n e 3 k e t o a d i p y i c o a c a f s u c c i n a t ea n da e e t y lc o a 图1 2a c i n e t o b a c t e rl w o f f i ik 2 4 菌株降解苯胺的邻位 d r 抽曲代谢途径 f i g i 2m e t a b o l i s mo r t h o p a t h w a yo f m i c r o b i a ld e g r a d a t i o no f a n i l i n e w i t ha c i n e t o b a c t e rl w o f f i ik 2 4 4 一署 6 m b 吾 出 c 一 曲 一 广西大掌硕士掌位论文 产邻苯 酚工程菌的构建及袅酵条件的优化 1 1 5 苯胺降解相关基因 簇 及其遗传调控 在好氧菌中 苯胺双加氧酶基冈簇 t d ng e n ec iu s t er t d n 足降解苯胺的关 键基因 编码苯胺降解途径的第一个酶 负责将苯胺转化成为邻苯二酚 已在pp u t i d au c c 2 2 菌株 2 a c i n e c t o b a c t e rs p y a a 菌株1 2 2 矧及f r a t e u r h 7 a n a 1 8 菌株p o h 9 克隆到苯胺双加氧酶基因簇并做功能分析 通过缺失定位 核酸序列分析和多肽分析发现 这三种菌株中六个基因t d n q t a l a 2 b r a t d a i a 2 a 3 a 4 a 5 r 1 1 颐序位于同一操纵元上 前血个为编码多组分的苯胺双加氧酶 基因 t d n q t a t d a i a 2 与苯胺的氨基转换及氨的释放有关 t d n a l a 2 a t d a 3 a 4 编码 苯胺双加氧酶基因的大小两个亚基 t d n b a t d a 5 编码苯胺双加氧酶基因的还原酶 组分 推断出的苯胺转化首先是由t d n a l 和t d n a 2 将分子氧两原子结合到苯胺苯 环的1 和2 号位形成二酚 氨基转移到t d n q 在氨基酸水平上与谷氨酰胺合成酶 有3 0 的同源性 然后t d n t 可进一步将氨基转化为一种未知底物或者释放氨 1 2 l 3 0 4 s 0 5 1 0 k b 图1 3f r a t e u r i as p e c i e s a n a 1 8 菌株的苯胺双加氧酶基因簇的结构 3 0 f i g 1 3s t r u c t u r eo f a n i l i n ed i o x y g e n a s eg e n eo f f r a t e u r i as p e c i e s a n a 1 8 已报道的苯胺双加氧酶基因编码的氨基酸序列同源性比较见表l 一2 其中 f r a t e u r i as p e c i e s a n a 1 8 与p p u t i d a u c c 2 2 二者的同源性达到6 2 以上 另外两 种菌的t d n q 启动子的 3 5 区 一1 0 区及反向重复序列具有很高的相似性 这些 都表明二者的t d n 基因簇极有可能源于同一祖先 2 2 2 3 3 们 1 9 8 8 年 h e n n i k o f f sa n d h u a g h n g we l a l 第一次报道原核l y s r 蛋白作为转 录调控蛋白1 5 3 1 如大肠杆菌的l y s r i l v y c y s b 蛋白 5 3 6 7 1 根瘤菌的n o d 蛋白1 6 8 琊1 t f d r 蛋白盼7 6 期 沙门氏菌的m e t r 蛋白 7 s y r m 蛋白 9 2 9 7 1 l e u o 蛋白唧 10 3 a m p r 蛋白 1 呻 嘲及a n t o 蛋白 5 3 1 等都属于l y s r 蛋白家族 l y s r 家族是n 末端含 有螺旋一转角一螺旋 h e l i x t u m h e l i x 修饰的d n a 结合蛋白 其氨基酸序列具 广西大掌硕士学位论文 产邻苯 酚工程菌的构建及芸 酵条件的优化 表1 2 f r a t e u r i as p e c i e s a n a 1 8 菌株的苯胺双加氧酶基因编码的氨基酸序列同源性比较 3 0 l t a b l e1 2i d e n t i t yo f a m i n oa c i ds e q u e n c e sd e d u c e df r o m a n i l i n ed i o x y g e n a s eg e n eo f f r a t e u r i as p e c i e s a n a 1 8 l d e n t i t y g e n e p r o d u c to ff u n c t i o ns t r a i n 有同源性 一般受某种特定的环境因子或诱导分子诱导而激活 而且它们一般能 以阻遏或激活的方式调节靶基因的表达1 5 3 6 8 j 0 7 1 l y s r 蛋白通常结合到靶基囚的启 动子区域 但m e t r 蛋白还可以结合到靶m e t f 基因下游区域以调控表达 9 1 1 芳香化合物的代谢途径由特异的识别诱导分子与代谢操纵子的启动子一操纵 予区互作的调控蛋白控制 根据氨基酸序列同源性分析 t d n r a t d r 蛋白可列入 原核l y s r 转录调控蛋白家族 因此 t d n r a t d r 蛋白可能是一个能结合d n a 的 转录激活因子 但在户p u t i d au c c 2 2 菌株和f r a t e u r i aa n a 一1 8 菌株的t d n q 启动 子内并未找到己报道的t 1 i n t a 反向重复序列作为l v s r 转录凋控的结合靶点 冈 此t d n r a t d r 在转录水平上对t d n q t a l a 2 b a t d a l a 2 a 3 a 4 a 5 的凋肖饥 j i i i 要进 一步阐明 2 1 3 0 5 3 i 苯甲酸降解菌a c i n e c t o b a c t e rs p a d p i 的调控蛋白b e n m 在顺 顺一粘糠酸或苯 甲酸的诱导下激活b e n 基因簇 苯甲酸双加氧酶基因 的表达1 1 0 s l 而f r a t e u r i a a n a 1 8 菌株的t d n 基因在顺一粘糠酸的诱导下并没有表达 只是在苯胺的存在下 结合了诱导分子苯胺才被激活表达 可见调控蛋白t d n r 与b e n m 在对顺 顺一粘 6 1 西大掌硕士掌位论文产嘲 苯 酚工程苗的构建压兰 醇条件的优化 糠酸的反应应答机制不同 t d n 基因的转录调控机制需要进一步验证p 不同芳香化合物代谢酶氨基酸和代谢基因簇基因排列的相似性 说明几种基 因簇 修饰的邻位丌环基因 问位丌环基因 多组分艿香环双加氖酶基因等 可 能被整合成一个模块 也可以加上其他的外围酶基因 在不同的代谢途径的进化 中 不同韵基因发生了重排 重排的可能机制包括基因转移 突变漂移 遗传重 组和转座 微生物群体中的遗传互作受以下的机制影响 质粒的结合 转导和转 化 在自然环境中细菌内存在质粒是一种常见的现象 土著微生物中可以发生以 质粒为鼓体的遗传信息的交流 很多自主转移的质粒携带有艿香化合物或别的有 机物的降解基因 他们能将这些基因转移到其他的微生物是无可争议的 对细菌进化来说 基因转移除垂直传递外 横向的或叫侧向的基因转移 h o r i z o n t a lt r a n s f e r 也十分繁岁1 睁1 2 1 一些致病细菌可以同时具有几种抗生素的抵 抗因子 就是由于基因的频繁交换造成的 已有报道表明 细菌适应外来有机污 染物而产生在降解代谢机制的进化 许多分界代谢基因与插入序列或转座子相连 降解性质粒中的降解基因在转座子 i s 因子 的转位作用下易于发生基因重排 通过种间遗传信息转移 导致在微生物群体中许多菌株快速传播 这种快速传播 有利于新的降解途径的产生 1 1 2 1 13 1 编码一种转位酶 t n p a 的i s 因子通过t n p a 识别反向重复序列在细菌种群之 自j 发生转位作用 参与抗生素抗性基因 致病性 基因 抗毒基因及参与分解代谢途径基因的扩散与转移过程中发挥作用 h 4 j 5 1 已 报道的参与基因横向转移的转座子 i s 因子 如表1 3 所示 降解质粒和转座子携带基因在微生物界传递 这对遗传的多变性和适应性是 至关重要的 n a k a t s u c n gj s i n g h r e t a 在1 9 9 1 年报道了a l c a l i g e n e ss p b r 6 0 菌株质粒p b r c 6 0 的复合转座子t n 5 2 7 1 参与氯代苯甲酸的代谢过程 t n 5 2 7 1 是 由两个同样的3 2 0 1 碱基大小的插入序列i s l 0 7 1 连接在抗性基因片断的两侧构成的 1 1 1 7 将此菌株引入湖水微观系统 暴露于微摩尔浓度的3 一氯苯甲酸 4 一氯苯甲 酸及2 4 一二氯连苯或3 一氯连苯中 经过1 0 0 天的驯化 在氯化苯甲酸的选择 压力及群落适应下 i s l 0 7 1 选择性的跳到其他宿主 携带t n 5 2 7 1 的细菌菌群数显 著增多 表明供体菌a l c a l i g e n e ss p b r 6 0 及整个菌群菌落在横向基因转换中发挥 关键作用 明 k a l l a s t u a 和h o r a kr 的研究结果表明 苯酚降解基因的转录调控还 与i s l 4 1 1 插入序列有关 插入序列i s l 4 1 1 位于假单胞菌p p u t i d a 质粒d n a 的苯 酚降解基因p h e b a 的下游 序列分析结果表明 i s l 4 1 1 属于i s 成分中一个新的成 7 广西大掌司睦掌位论文 产邻苯 酚工程菌的构建及裳醇条件的优化 表1 3 参与基因横向转移的转座子 i s 因子 f i g i 3 t h er e p o r t e d t r a n s p o s o n s o se l e m e n t i n v o l v e d i n g e n eh o r i z o n t a l t r a n s f e r 转序子 i s 囚子 横向转移纂网 上物来源 参与文献 第一类转座子 t n 5 2 7 1 i s l 0 7 1 氯代苯甲酸 c b a a b c t n s 2 8 0 i s l 0 6 6 氯代苯 t c b a b t n 5 5 4 2 i s l 0 6 6 苯 b e d d c i c 2 b a l 第二类转座子 1 n 5 0 1 n 3 9 2 6 t n l 7 2 l t n 2 1 t n 2 4 2 4 1 n 5 0 4 l 1 n 4 6 5 l 1 n 4 6 5 2 t n 4 6 5 3 t n 4 6 5 5 t n 4 6 5 6 朱分类 1 n 4 3 7 l i s l 0 7 1 i s l 0 7 1 i s l 2 4 7 h 窖 h f t d h 正s u f s m f a t c m f h f 甲苯 x y o 无 甲苯 硼 荼 n a b 甲苯 x y l a l c a l i g e n e ss p b r 6 0 p s e u d o m o n a ss p p 5 1 p s e u d o m o n o ss p y e r s 加胁e n t e r o c o l i t i c a s a l m o n e l l ae n t e r i e as u b s p k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e p l a s m i dn r 7 9 只p u t i d am t 一2 p p u t i d a p a w 8 5 户p u t i d am t 2 p p u t i d a g 7 户p u t i d am t 5 3 1 1 6 1 2 3 1 1 2 1 2 3 1 2 4 1 2 3 1 2 5 1 2 6 1 2 9 1 3 0 1 3 l 1 3 2 1 3 7 1 3 8 1 4 4 1 4 5 1 4 6 1 4 7 1 4 8 1 4 9 1 5 0 1 5 1 1 s 2 1 5 3 氯代二苯 b p h c b a a b c d a e u t r o p h u s a 5 1 5 4 1 5 5 二苯 水扬酸 b p t d s a l p p u t i d ak f 7 1 5 1 5 6 1 5 7 对甲苯磺酸盐 b s a m b c d r p s b a o c o m a m o n a s t e s t o s t e r o n i t 2 1 5 8 4 一羧基二苯乙醚 p o b a 尸p s e u d o a l c a l i g e n e sp o b 3 1 0 1 5 9 单溴乙酸盐 皿jx a n t h o b a c t e r a u t o t r o p h i c u sg j l 0 1 6 0 员 近宋被命名为i s l 3 家族成员 发现i s l 4 1 1 是由于当i s l 4 1 1 左端外向启动子 存在时 缺失启动子的p h e b a 基因的插入激活而造成的 i j 近来研究表明 很多降解性基因及操纵子旁侧连接i s 因子 1 3 i s l 0 7 1 编码 一种参与转位作用的转位酶 t n p a 在苯胺降解细菌只p u t i d au c c 2 2 f r a t e u r i a a n a 1 8 ct e s t o s t e r o n i1 2 d a c i d o v o r a n sc a 2 8 及d a c i d o v o r a n sb 8 e 中检测到 了t n p a 基因 且位于t d n q 旁侧 同时在a c i n e c t o b a c t e rs p y a a 的a t d 基因簇下游 8 广西大掌硕士学位论文 产邻苯 酚工程菌的构建及裳酵条件的优化 发现转座子t n l 0 0 0 同源性序列 这些研究表明 在细菌的进化过程中借助转座子 i s 因子 可实现横向的基因转移 苯胺降解基因就是借助这种横向转移中在细 菌之l 日 传播 2 1 2 2 4 5 1 1 2 邻苯二酚 1 2 1 邻苯二酚的特性 邻苯二酚 c a t e c h o i 1 2b e n z a o e d i o l 以下简称c a t 又名儿茶酚 焦性儿茶酚 多以衍生物的形式存在于自然界中 为无色结晶 常呈片状或棱形结晶 熔点1 0 5 沸点2 4 5 c 是一种可溶于水 乙醇 乙醚 苯 甲苯 氯仿 易溶于丙酮 吡啶 碱溶液中 能升华 可随水蒸汽一同挥发 是一种强还原剂 易被氧化成 邻苯醌 故在空气中见光易变色 1 2 2 邻苯二酚的应用 邻苯二酚是一种重要的精细化学品 是橡胶 医药 农药 染料 感光材料 香料等行业的基本有机原料或中间体 主要用作照相显影剂 抗氧化剂 皮毛染 色的显色剂 1 医药方面 邻苯二酚是重要的医药中间体 由邻苯二酚环合而得胡椒醛 再 经氧化缩合等一系列步骤可制得黄连素 黄连素是重要的抗菌药物 广泛用于治 疗肠胃炎 细菌性痢疾等 用邻苯二酚和氯乙酰等反应 可合成胃上腺素 一般 用于支气管哮喘 过敏性休克和其它过敏性反应 也用于某些心动停止的急救 此外 邻苯二酚还可合成去肾上腺柔 盐酸异丙肾上腺亲 旋多巴 心得平等 多种药物 农药方面 邻苯二酚是呋喃丹 2 3 氢一2 2 二甲基 7 苯并呋喃基甲基氨基 甲酸酯 和残杀威 2 一异丙氧基苯 n 一甲基氨基甲酸酯 的重要中间体 呋喃丹是氨 基甲酸酯类广谱内吸杀虫 杀螨 杀线虫剂 可用于多种作物防治土壤内及地面 上的3 0 0 多种害虫和线虫 并有缩短作物生长期 促进作物生长发育从而提高作 9 g 西大掌硕士学位论文产郐苯 酚工程菌的构建及发酵条件的优化 物产量的作用 用于棉花和苷蔗 具有卓越的杀虫效果 这也是邻苯二酚改进生 产方法 扩大产量的一种推动力 残杀威是氨基甲酸酯类杀虫剂 具有较强的触 杀作用 对稻飞虱 叶蝉科害虫具有特效 香料方面 邻苯二酚是香料工业的重要原料 它的衍生物或由它合成的一些 化工产品如邻苯二酚单甲醚 香兰素 胡椒醛 黄樟素等都是重要的原料 其它 邻苯二酚还可用于制备阻聚剂4 一叔丁基邻苯二酚 邻苯二酚和甲醛 乙醛或丙酮等能合成树脂 它还可用于制造抗氧剂 显影剂 橡胶助剂 电镀添 加剂 特种墨水 光稳定剂 染料 染发剂等 1 2 3 邻苯二酚的合成方法 1 8 3 9 年r e i n s e h 由儿茶酸经蒸馏首次制得邻苯二酚 因此邻苯二酚又名儿茶 酚 目前 邻苯二酚的来源有三个 一是从焦油中分离 二是从废磺化液中抽提 三是合成法 前两种方法由于来源有限 分离设备庞大 产量较小 不能满足市 场需要 因此 第三种方法合成法就显得颇为重要了 而合成法包括化学合成法 和微生物合成法 1 2 3 1 化学合成法 目前c a t 工业生产主要通过化学合成 主要是r h o n ep o u l e n c 法 u b e 法 b r i c h i m a 法 e n i c h e m 法 6 1 2 3 1 1r h o n ep o u l e n c 法 法国r h o n ep o u l e n e 公司丌发了以h c l 0 4 为催化剂 h 3 p o 为助催化剂生产苯二酚的方法 即将苯酚和少量的h c l 0 4 h 3 p 0 4 在3 个1 8 m 3 的阶式串联反应器中 于9 0 c 用7 0 的h 2 0 2 进行羟化 所得的反应液先在洗涤塔 中加入少量的二异丙醚 用4 5 2 的水将h c l 0 4 和h 3 p 0 4 沈去 随后的物料根掘其 沸点不同 依次进入脱水塔 初步浓缩塔 焦油分离塔 浓缩塔和分馏塔中 在 常压和减压下进行分馏 在分离塔中先蒸 f 邻苯二酚 随后蓐出对苯二酚 此工艺的最大缺点足苯酚的单程转化率太低 仅5 大量朱反应的苯酚高分 离回收 循环使用 其次 所用的催化剂h c l 0 4 不但腐蚀设备 而且较难沈涤 除去 此外 使用7 0 的h 2 0 2 存在安全隐患 1 2 3 1 2u b e 法 此法为日本宇部兴产公司对苯酚羟基化n 元酚生产工艺的研 究与开发 主要是在羟基化反应中加入了少量甲基异丁基酮 该酮与h 2 0 2 形成了 1 0 3 西大掌硕士掌位论文 产邻苯 酚工程菌的构建反裳辞条件的优化 过酮化合物 并在固体酸如n a h s 0 4 白土等作用下分解放出活性氧与苯酚进行羟 基化 其工艺特点是产品收率较高 但其原料苯酚的规格要求过高 工艺较复杂 二元酚的选择性比较低 1 2 3 1 3b r i c h i m a 法 意大利b f i c h i m a 公司独立开发了自己的苯酚羟化制二元 酚的工艺 b r i c h i m a 法用重会属化合物即钴盐或二茂铁作催化剂 用6 0 的h 2 0 2 在4 0 进行苯酚的羟化反应 反应按自由基链式反应机理进行 完成羟化需2 h 1 2 3 1 4e n i c h e m 法 2 0 世纪8 0 年代仞 意大利e n i c h e m s p a 的t a r a m a s s o 等 人成功地合成了含硅的t i t a n o s i o l i c a l i t e ll 型分子筛 命名为t s l 其突出功能足 对有h 2 0 2 参加的有机物择形氧化有明显的促进作用 首先将其用于苯酚羟基化制 二元酚的工艺中 可将苯酚的转化率由1 0 9 6 提高到2 5 3 0 9 6 而且在羟化过程中 生成的高沸物较少 这样 苯酚在过程中的循环量可减少约6 0 苯酚的转化率高 则二元酚的总收率低 反之 苯酚的转化率降低 则二元酚的总收率高 但钛硅分子筛的合成工艺复杂 晶化周期长且模板剂价格昂贵 因而催化剂 的成本较高 需克服催化剂回收的困难 1 2 3 2 微生物合成法 由于化学合成存在副产物较多 难得高纯度的c a t 且工艺复杂 污染严重 催化剂昂贵及分离困难等问题 所以经济效益不高 近年来一些发达团家和地区 开始寻求经济有效合成c a t 的途径 微生物资源有三大特点 有潜在用途或价值的遗传资源丰富 代谢种类繁多 多样性未知处多 繁殖快 易变异 个体小 便于工业大规模自动化生产 利用 生物技术合成c a t 是一全新概念 国际上研究领域涉及微生物菌种分离鉴定 不 同双加氧酶的基因克隆 连续批次发酵等方面 clw a n g 等报道 p s e u d o m o n a s s p b a0 5 1 l 菌株能转化苯甲酸钠为c a t 在3 0 通风培养f c a t 的产量达到2 1 l 分子水平的底物转化宰达到5 0 生物技术合成邻芩二酚 的特点表现为 反应条件温和 原料充足廉价 环境污染小 产品分离纯化简便 据中国化工网报道 密歇根州立大学的研究人员提出 用基因重组得到的大 肠杆菌中 可以葡萄糖为原料生产邻苯二酚 在未改性的大肠杆菌中 葡萄糖转 化为氨基酸 其中间产物含有d h s 和莽草酸 研究人员培育出了可使反应停留在 d h s 或邻苯二酚阶段的改性大肠杆菌 与传统的以有毒的苯或甲苯为原料的合成 广西大掌硕士掌位论文 产邻苯 酚工程菌的构建及戋酵条件的优化 方法相比 该方法以无毒的可再生物质葡萄糖为起始原料 是一种对环境有利的 生物催化合成方法 目前该技术中使用的葡萄糖主要是淀粉合成的 若以农业废 料和废纸中的纤维素为原料将更有商业前景 1 1 2 4 邻苯二酚的生产现状 目前世界上主要的邻苯二酚生产企业有法国罗纳一普朗克公司 日本宇部兴产 公司及意大利埃尼 布列希玛 公司 且均采用苯酚羟基化法 总生产能力约为3 3 万妇 其中法国罗纳一普朗克公司为1 9 力 妇 其中有6 0 0 0 t a 装置在美国 日本 宇部兴产公司8 0 0 0 t a 意大利埃尼公司6 0 0 0 t a 年总产量约为2 8 万t 我国邻苯二酚工业始于2 0 世纪7 0 年代 多年来生产能力一直徘徊在数百吨 产量甚微 需求主要依赖进口 但国外3 家公司均不对外转让技术 严重影响了 其下游产品的发展 近些年通过不断的科技攻关 在邻苯二酚的生产技术方面 国内取得了不少突破性进展 生产工艺 生产方法同趋成熟和完善 但是 由于 国内生产规模的限制 生产成本较高 产品质量水平不高 每年需大量的进口 使得邻苯二酚的下游企业受邻苯二酚的供应量和价格的影响产生动荡 严重制约 了邻苯二酚应用领域的开拓和发展 邻苯二酚的应用领域由于受产量和价格的局 限 短期内不会有太大突破 但是仍旧会保持较好的增长态势 我固邻苯二酚下 游产品尘产与市场潜力巨大 为我国邻苯二酚工业发展提供巨大发展空问 1 3 本工作的意义 生物法合成邻苯二酚与传统的化学合成法及提取法相比有很多优点 但目前 固内外报道的 上物法合成邻苯二酚多采用野 e 菌或野 l 菌突变体 1 3 枷 产物在产 生的过程中一部分被菌体所消耗 底物转化率不高 若能直接以降解途径中转化 底物为邻苯二酚的基因 通常为降解途径中的第一个基因 构建工程菌 以廉价 原料供菌体生长需要 则生成的邻苯二酚无菌体消耗损失 可提高底物的转化率 及利用率 提高经济效益 并为后续的分离提取等工作带来方便 而本工作正是 从一株能以苯胺为唯一碳源和氮源的菌株中克隆苯胺降解途径中的第一个基因一 产部 蕃 酚工程菌的构建a 裳酵条件的优化 一苯胺双加氧酶基因 并以此构建工程菌产生邻苯二酚 可收到一举两得的效果 1 4 本课题的前期进展 在本课题的前期工作中 毕洪凯等 从长期受苯胺污染的废水排放口的活性 污泥中筛选到一株能以苯胺为唯一碳源和氮源的菌株a n a 5 经菌落形态观察 生 理生化特征结合1 6 sr d n a 序列同源性比较 该菌归属a n c i n e t o b a c t e rs p 通过设 计苯胺双加氧酶基因特异引物 p c r 扩增出两段与a c i n e t o b a c t e rs p s t r a i n y a a p l a s m i d p y a ld n a a c c e s s i o nn u m b e r d 8 6 0 8 0 苯胺双加氧酶基因分别有9 3 和 9 8 的同源性片断 以此作为探针 利用粘粒p l a f r 3 作为载体 构建了菌株a n a 5 的基因组粘粒文库 经菌落原位杂交及s o u t h e r nb l o