实验凝集反应备课.ppt

1 免疫学实验课贵阳医学院免疫学教研室 2 1 试管凝集反应 示教 2 ABO血型鉴定 玻片凝集反应 1份 1人 3 乙型肝炎病毒表面抗体检测 ELISA法 1份 1人 实验内容 3 实验二凝集反应 Agglutination 4 实验原理颗粒性抗原 细菌 细胞等 与相应的抗体 或可溶性抗原 抗体吸附于与免疫无关的载体 形成致敏颗粒 与相应抗体 抗原在一定的条件下 形成肉眼可见的凝集小块的反应 称为凝集反应 参与反应的抗原称凝集原 agglutinogen 抗体称为凝集素 agglutinin 5 凝集反应类型 直接凝集反应 directagglutination 颗粒性抗原与相应抗体直接结合 所出现的凝集现象 包括试管凝集反应 玻片凝集反应 间接凝集反应 indirectagglutination 将可溶性抗原 或抗体 吸附在与免疫无关的载体颗粒表面 使此形成致敏颗粒 然后再与相应抗体 或抗原 混合 在适当条件下 发生凝集现象 称为间接凝集反应或被动凝集反应 6 7 操作步骤于试管架上列7支试管 1 每管内分别加入生理盐水0 5ml 2 血清稀释 第一管加入1 10待检血清0 5ml 混匀后取0 5ml 加入第二管内 依此类推 直到第6管 混匀后从第6管中吸出0 5ml弃去 第7管为对照管 0 5ml 0 5ml 0 5ml 0 5ml 0 5ml 0 5ml 一 试管凝集反应 1 201 401 801 1601 3201 640 8 3 每管加伤寒杆菌 H 抗原0 5ml 4 混匀 置52 水浴4h 取出后 置室温过夜 次日读取凝集效价 9 结果观察 不同程度的凝集现象 液体澄清 细菌全部凝集 100 沉于管底形成大片凝集物 液体基本澄清 细菌大部分凝集 75 左右 管底的凝集物稍小 液体半澄清 稍显浑浊 凝集物50 左右 但仍可见明显凝集块 液体浑浊 无凝集块 轻摇试管 有细菌呈线状浮起 10 效价 抗原抗体反应时 发生明显反应的最高血清稀释度 又称滴度 凝集效价 凝集反应时 能使50 或以上的抗原发生凝集的最高血清稀释度 11 二 玻片凝集反应 已知抗血清与未知颗粒性抗原置于清洁玻片上 在一定的条件下 若两者相对应 则会发生凝集 本方法主要用于抗原的定性分析 如菌种鉴定 ABO血型鉴定等 ABO血型系统 12 13 ABO血型鉴定步骤 红细胞悬液的制备 用于血型鉴定及ELISA实验 1 取EP管1支 加入5滴生理盐水2 消毒耳垂或手指皮肤3 用采血针采1 2滴血 加入盛有生理盐水的EP管中混匀4 2000rpm 离心3min 5 取红细胞悬液用于ABO血型鉴定6 取已加有抗A血清与抗B血清载玻片1张 分别加入待测抗原各1滴 并用牙签混匀 7 置室温5分钟左右观察结果 取上清用于ELISA实验 ABO血型鉴定的判断 示意图 15 注意事项 用牙签研磨时 注意防止将抗A血清带到抗B血清中 反之亦然 如果凝集现象不太明显时 可用显微镜观察 16 免疫标记技术 将已知抗体或抗原标记上易示踪物质 如酶 荧光素 放射性同位素 胶体金等 通过检测标记物来反映有无抗原抗体反应 从而测出微量的抗原或抗体 17 实验五酶联免疫吸附试验 EnzymeLinkedImmunosorbsentAssay ELISA 原理 利用标记技术将酶标记到抗体 抗原 上 使待检物中相应的抗原 抗体 与酶标记抗体 抗原 发生特异性反应 在遇到相应的酶底物时 酶分解底物 生成有颜色的产物 根据颜色的深浅 可以判断待检物中有无特异的抗原 抗体 以及量的多少 检测方法有直接法 间接法 双抗体法和抗原竞争法 18 直接ELISA 包被 未知抗原 加入酶标抗体 洗板 加底物 加终止液 包被 已知抗原 加入待检标本 未知抗体 加入酶标第二抗体 抗抗体 洗板 加底物 加终止液 间接ELISA 双抗体夹心法 包被 已知抗体 加入待检标本 未知抗原 加入酶标抗体 洗板 加底物 加终止液 19 乙型肝炎病毒表面抗体的检测 间接ELISA法 测定原理 采用纯化HBsAg包被反应板 加入待检标本 当标本中存在抗 HBs时 该抗体与包被HBsAg结合 再加入酶标羊抗人IgG抗体 最后形成HBsAg 抗HBs 酶标抗抗体复合物 加入底物产生显色反应 20 无菌采血 离心2000rpm 3min 取上清作为待测标本 见玻片凝集实验 每孔加入酶结合物1滴 37 孵育30min 反应板中各加入待测标本1滴 同时设阴性 阳性 空白对照孔 NS 反应板已用纯化HBsAg包被 手工洗板 弃液拍干 重复5次 每孔加入显色剂A液