（化学工程专业论文）天花粉蛋白基因工程菌株发酵条件及产物抗病毒实验研究.pdf

西北大学学位论文知识产粳声明书 y 8 3 童sl 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 囊藿家有关部f - 】或机构送交论文的复印件积电子舨。本人允许论文羧 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本入傈涯，毕鲎薅结合攀谴论文研究课题再撰写静文 章律注明作者单位为鹾北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文诈者签名：垒垒兰指导教雾器签名： j 一缉舌月占日沙占年g 月占豳 露l 艺大学学缓论文猿翎性声明 本人声明：所里交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成莱。据我新翔，瀚了支中特捌魏越拇注秘致谢的地方舛，奉论文不苞含箕袍入醴经 发寝或撰写避的研党成果，也不包禽为获得西j b 大学或箕宅教警机构鲍学位或证书琵 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均融在论文中作了明确 静诞臻并表示谢意。 学位论文律豢签名：去，专乞 。一易年占月参网 天花粉蛋自基因工程菌株发酵条件及产物抗病毒实 验研究 摘要 天花粉蛋白( 打，咖。始脬抽詹，咒两是从栝楼掇鳟汁中得到的一种蛋白质。 我们将小鼠嚣髓瘤细胞( s p 2 o 缨腿) 与经t c s 免疫过螅小鼠膊鲴熙融会，融合 层的细臆悬浮于h 艚培莠滚中进褥选择性壤葵，挑选霹鞋分泌托s 攀尧隆撬体熬 缨腿系，霉经宠隆化必攀克隧缨臌系。用阉缓酶联免疫吸辫法梭测藏细稳系分泌 萃尧隆抗体渗况。经舞腱融会窝2 次霓隆纯磊，获得l 撩哥浚稳定分泌托s 鼙壳 隆抗体静杂交癌缁施系，乱 s 矗梭测缩采为阳性。就杂交瘸细稳系可以稳定分泌 天花粉鬣自革克隆抗俸，并在诧蘩础上建立了f e s 单克隆抗体检测方法，为t c s 的鏊定提供了快遗、便捷、准确的方法。 本文还研究了温度、p h 值、培养时间、培养基成分、接种量、诱导剂浓度 等6 种因素对于天花粉蛋白基因工程菌株t 2 3 9 表达避的影响，优化了培养及表 达条件，以达到提高产匿的同的。发现此菌株在温度3 0 、p h 值7 3 、摇床转 速2 0 0 r m i n 、5 0 m l 5 0 0 m 1 培养瓶、接种量3 、培养时间3 0 h 、添加葡萄糖浓度 为2 。o g l 时，表达量最高。 进步我们对菌株t 2 3 9 袭达获褥的天花粉蛋瞧抗人免痰缺陷痍毒救活牲 进嚣了职究。犍人免疫缺隧瘸毒l 型褒缨熙系中培养，规入表达获缮鼹天花粉器 鑫嚣，鼹察缨腿疼变馕凝，梭测p 2 4 揍霖及遂转渌簿瓣活性。结果发现溺淫辩照 缰缀薤在第? 天苏螽均密现久免疫缺麓病毒l 鍪感染典銎细瑰瘸交，p 2 4 抗藤及 遂转录酶检测均为阳性；阳髋对照组始终来觅h v l 感染藏墅细胞瘸交，逆转录 酶豹活佼检测和p 2 4 抗原检测结采均为阴饿，说明实验设计合壤。发现加入天花 粉蛋囱鹃细胞始终来觅缨臌瘸变，p 2 4 抗原及逆转录酶检测均为嬲性，因此可以 认定我们用基因工程的方法表达获得的天花粉骚自在培养细胞系中可以有效抑 制人免疫缺陷病毒l 型。瓣将单纯疱疹病毒t 溅、单纯疱疹病毒2 型在细胞系中 培葵，翱入天慈狯蛋叁嚣，溪察绥憝痍交瀵滋，震酶联免疫啜辫( 乳 黢) 懿方 法检测痫毒生长情况。结果显示，阴性对照缎细胞在第3 天以后均出现单纯疱疹 病毒l 型及单纯疱疹病毒2 型感染典型细胞瘸变，e l i s a 检测结果为阳性；阳性 对照缀飧终宋见单纯癔疹瘸枣l 垄、2 型感染典型缨胞病变，e l i s a 检测结果为 鞠瞧，说明实验设计含瀵。焉热入天花粉蛋鑫豹缀缒始终来霓缁魏瘸交，嚣l s a 检测为阴性，因此可以认定表达获得的天花粉鬣自在体外培养细胞系中也可以有 效抑制单纯疱疹病毒l 型及单纯疱疹病毒2 型。 哭键运；天花粉蛋鑫，攀竞隆摭傣，发辩条馋，人免疫缺夔瘸毒l 墼，荤缝 疱疹瘸毒l 型，单纯瘪疹瘸毒2 型，抑制 6 s t u d yo ft h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f 乃记厅。跚，l 聃伽 g e n ee n g i n e e n gs t r a i na n dd e t e c t i o no ft h ea c t i v i t yo ft h e e x p r e s s i o no ns u p p r e s s i n gh u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s 1a n dh e r p e ss i m p l e x r u st y p e1a n d2 a b s t r a c t h y b r i d o m ac e ul i n e sc a p 曲l eo fs e c m t i n gm o n o c l o n a la n t i b o d i e s ( m a b s ) a g a i n s t 行f 曲d 船玎脯胁黼o b t a i n e d b y 缸i n gm o u s em y e l o m ac e l l s ( s p 2 o ) w i 也s p l e e nc e l l s 诅k e nf b mt h eb a lb ch a v i n gb e e ni m m u n j z e db ym e 丹f c 矗口一胁跳t h em a b s o b t a i 鹏d 丹d mt h eh y b r i d o m ac e l lc o l l l ds p e c i f i c a l l yr e a c t 、 ，i m 行f c d s 口甩砌加t h i s r e s e a r c hm a y tg o o df o u i l d a t i o nf o r 矗工r t l l e rr e s e a r c ho nt c s t h e ne n g i n e e r i n g s 订a i n ( t 2 3 9 ) 、a sc u l t i v a t c du n d e rd i 髓r e mc o n d i t i o n si no r d e rt of i n dt h eo p t i m a l f e n n e m 融i o n s 也a tw o u l dl e a dt om a x i m a lf u s i o np r o t e i ny i e l d 一t h es t r a i nw 耶 c u l m r e dl l i l d e rd i 位r c mt e m p e r a n 玳，p h ，r o t a t i n gr a t c ，t i m e ，a l l dc 印a b i l i t yo f b o 砌e a i l d 豫跚l t ss h o w e dm a tt l l ep r o p e rf e 珊e m a t i o nc o n d i t i o n sc o n s i s t c do f = 3 0 、p h 7 3 、 2 0 0 r ，n l i n 、5 0 m l 5 0 0 m 1 砌t u r eb o m e 、3 0 ho nr o 诅t i n gc u l t i v a t i o nb e d ，、v i t i l2 0 l g l u c o s e o na d d e d t h ea c t i v 时o na m i h u m 锄i m m u n o d e f i c i e n c yv i m sl ( h i v - 1 ) o f m ee x p 豫s s i o n ( t r i c h o s a m h i n ) 、e r ed e t e c t e d t h ee x p r c s s i o n 、e r ep mi n t ot 1 1 ec e l l s i 哦c t e db yh i v 1 姐d 血e 卵t i v 蚵o f h p 2 4 姐t i g e n 姐dr t a c t i v i t yw e r ed e t e c t e d r e s u l t ss h o w e d 也a tt l l ec e l l sa d d e di n t o 衄c h o s a i l t h i ns h o w e dr t a c t i v 时n e g a t i v e ， p 2 4a gn e g a t i v ea l l dn or e p r e s e n t a t i v ec e l lp a m o m o l p h o l o g yc h 觚g ew h i l et h ec e l l s a d d e di n t o n e g a t i v ec o n d ls h o w e dr ta c t i v i t yp o s i t i v e ，p 2 4a gp o s i t i v ea n d 糟p r e s e n 诅t i v ec e up a t l l o r n o r p h o l o g yc h a n g e ，a n dt h ec e l l sa d d e di n t oz i d o v u d i n e 7 s h o w e dr ta c t i v i t y n e g a t i v e ，p 2 4a gn e g a t i v e a n dn o r c p r e s e n t a t i v e c e i l p 甜l o m o r p h o l o g yc h a n g e t h ee x p r e s s i o n c a ni n h i b i th u m a i li m m u n o d e f i c i e n c y v i r u sl 拥v f f r o t od e t e c tt h ea n t i - h e r p e ss j m p l e xv i m st y p e1 a 1 1 d2a c t i v i t yo f 们c h o s a i l t l l i ne x p r e s s e db yt h em e a n so f b i o t e c h n o l og y ，t h et r i c h o s a n t h i nw c r cp u t i n t ot h ec e l l si n f e c t e db yh s v _ la 1 1 dh s v - 2t os e ei fi tc a l ls u p p r c s sh s v - la n d h s v - 2o rn o t n l ec e l l sh a v i n gt r i c h o s 姐t h i ns h o w e de l i s an e g a t i v ea r l dn o r e p r e s e n t a t i v ec e up a m o m o r p h o l o g yc h a i l g ew h i l e 也ec e l l sh a v i n gn o tt r i c h o s 趴仳n s h o w c de i 。i s a p o s i t i v e 锄dr e p r e s e n 协t i v e c e l l p a t h o m o r p h o l o g yc h a n g e t r i c h o s a n t l l i i lc a i la l s os u p p r e s sh s v - 1a n dh s v - 2e 仃e c t i v e l y 加v f 肋 k e yw o r d s ：丹f c o 硼n m 加；m o n o c l o n a l 删b o d i e s ；f e n n e n t a t i o nc o n d i t i o n ；h u m a n i m m l l i l o d e f i c i e n c y v i m s1 ；h e r p e ss i m p l e x m st ) ，p ei ；h e r p e ss i m p l e x r u s t y p ei i ；s u p p r e s s i o n 8 第一章前言 天花粉蛋白( 即f c 矗甜蹿n f 矗m ，托是鼠稽楼嘏鲜汁中得捌的一种蛋囱质，其有 终止妊娠、抗胂瘤、抗瘸毒等生物学功能。僵爨爵前天花粉蛋白的签定还没肖可 靠、稳定静方法，我们运用缩耱融会技术，将小鬣曹髓瘤缁胞( s p 2 内缩胞) 与 经亿s 免疫遥豹，j 、鬣耱纲箍融合，获得了霹以稳定分泌羊e s 萃克隧抗体静杂交瘩 缎耱系，并建立了荦e s 攀壳隆抗俸梭测方法，为彳e s 的鉴定提供了快速、後捷、 熬确我方法； 嚣藤割备天花粉蛋囊熬方法，麦要是煺继学提取鹃方法从援楼根中获穆，吴 蠢纯度琴裹、造徐弱贵、工艺复杂及他学羧蟹提取波缀难突全渣羧等阉题。我粕 褒慧期磺究中铡各了能够成功表达天花粉蛋白的基因工理越抹t 2 3 9 ，但是存在 产墨低的问慰。本实验研究了漫度、p h 馑、培养时阕、培券基成分、接种燕、 诱导剂浓度等6 种魍素对于t 2 3 9 表达量的影响，获锝了最佳发酵条件，发现t 2 3 9 农此发酵条传下的表达爨是原发酵条件下的表达量的3 1 倦。 t c s 作为一种中药，在早期的研究中发现其具有抗柯萨其病毒、己型肝炎病 毒的活性，本研究检测了天花粉蛋白的基因工程菌株t 2 3 9 的表达产物体外抗人 免疫缺陷病毒1 型及单纯疱疹病毒1 型、2 型的活性。发现其在培养耋甜胞系中可 以有效抑制人免疫缺陷病毒l 型及单纯瘾疹病霉l 型、2 戳，从而有魑发现新的 抗h i v 及h s v 的中药。 9 第二章文献回顾 一、天花粉蛋白研究进展及发展现状 天花粉主要存程予葫芦秘攘貔摇楼 野耙蠡甜绷蛹8 s 女扣洳w 撑髓蔽泐) 或曩本 柄楼汀御d n f c 口舶职的干燥根，其燕要成分为蛋白质、淀粉、植物凝血素、 耱、毫营等，吴寿终瘫妊娠、撬虢癌、摭炎症、摭瘸毒等莼壤捧溺。i 囊年来霹天 花粉蛋白的研究曰懿深入。 1 、夭花粉蛋蠡的蓬他性质 天花粉蛋白咿衍由d 丹腑协，姗是从栝楼根鲜汁中得到的一种蛋囱质，分子 薰2 4o o o ，等电点为9 4 ，不含糖和磷酸鏊团，是豳1 9 种共2 4 6 个氨蘩酸残基缎 成的二线裂多肽，n 端为天冬缀酸c 端为丙氨酸和甲硫氨黢。分子中无半胱氨 酸，但有较多的疏水性氨基酸残基，从而使1 s 及其溴化氰降解片段具有特殊 效溶解度。t c s 的二级结构恣8 + 型( 8 段d 螺旋+ 1 3 条链组成的4 个掇 藏层) ，a 螺旋处于分子的中心，b 折叠层分布在外围。t c s 的抗原俄点已经测 定，其c 黼a 克隆瞧已褥到，芳在大弱授蓥孛骜废表达。麸援搂中逐分离羁另 外3 种分子量分别为3 20 0 0 、3 4o o o 和3 60 0 0 的蛋白质。农序列上与t c s 的嗣 源瞧穰次为豹、6 8 农酏，显都爨骞与曩s 耀毯戆梭耱髂灭灌瀵经。t c s 属于l 型核糖体灭活蛋白质，可通过其n 一糖苷酶活性水解2 8 s r r n a 4 3 2 4 处的 躲骧冷，辍薮竣糖体孛蛋鑫震豹舍藏，旗嚣灭活冀孩生秘2 8 s 壤n a ，这是t e s 簿性的基础。t c s 谶八细胞的能力与溶液p h 有关，最佳p h 值在3 o 左右。低 p h 诱导f c s 的构象改变，与缀胞膜上带受电的磷精的相互佟用增强，利予萁穿 过细胞膜。t c s 的满性取决于其肽链中特定的位点。将t c 8 用限制性糜蛋白酶 消化可以得到1 s f l 、t c s 。f 2 和t c s - f 33 个片段，t c s 。f l 和t c s f 2 具有生 物活性，掰t c s f 3 蠢生物活性。t c s f l 和t c s f 2 都含商一个由4 个q 螺旋 片段形成的包含1l o 1 7 4 位氨基酸残基的环状结构，经酶消化后，t c s 片段生 0 物活性与这个环状结构鸯芙。因此可以推测t c s 的活性中心可熊位于l l o 1 7 4 傀氨基酸贱基处。 2 、天花粉鬻白的生耪学作翔 2 1 终止妊娠 t c s 可用于终止早期或中期妊娠，针对不同孕龄的孕妇可分剐采用皮下、肌 岗、羊膜腔、或寓腔注射给药。他s ；l 产的梳理为：直接作用予对箕敏感静骆盎 滋养层缨腿，使绒毛破搂，促使绷魏巍缎凝物质岁 溢，势在绒毛阗隙形成血凝， 出现胎盘循环和嚣养障碍，导致缀织坏死，引起炎症反应。同时选种损伤作用也 影响胎盘的内分泌功能，妊娠维持受到藏胁。由予营养障谱诱发胎，l 应激反应， 搜裁列黢素分泌壤趣，孳| 发塞续，最终导数漉产。 2 2 抗肿瘸 t c s 已经在临床用予治疗多种脾瘤( 如绒癌、腺癌和脬细胞瘸及其他消亿遒 黪瘗等) 。其治疗绒瘥豹枫毽是弓| 起敏感熬缀毛骥瘘细艟( j a r ) 蠲亡，各秽活性氧 嫩o s ，如0 2 、h 2 0 2 、0 h ) 发挥了很大作用。r o s 是许多酶类激活、细胞生长、 分他、凋亡的第二信使，t c s 处理过的了j a r 中r o s 的产量增多，同时有染色 缓瓣浓缨襞凋亡，l 、体戆形裁。麴入r o s 瀵豫裁矮，k s 诱导数缀魁烫亡被耱裁， 说明r o s 可能题细胞死亡的中介体，并与t c s 诱导的细胞凋亡肖关。t c s 诱导 r 0 s 的产生依赖于细胞内外c 矿的存在，t i ：s 岛膜结合受体的相互作用也可能 纛氍s 诱导r o s 产生避蠢导致j a r 凋亡孛发撂作雳。霆蘩议必k 霪遴过弱怼 激活3 条相关联的渠道，即：c a 2 + 活化、c a 2 + 依赖的受体介导的r o s 的产生及 c a s p a s e - 3 的活化，从而释致j a r 的孺亡。 蛩0 s 与重缀等我素d 弱联合瘟瘸治疗消纯逮瘗爵鞋城少蘩蕊熬澄疗裁 爨，从丽降低其毒副作用。据报道t c s 经过抗人肺腺癌单抗5 a ( 1 0 ) 2 的化学修 饰作用形成1 s 一5 a ( 1 0 ) 2 免疫毒素，在体外对人肺腺癌细胞s p c 具有特异导向 杀伤作用。另外t c s 的纯化组分可通过抑制小鼠黑色索瘤细胞d n a 的合成，抑 裁瘸鬃憝分裂壤蘧，诱嚣瓣瘩缁熬戆猬亡。 2 3 抗病毒 下e s 与秃环鸟营或干扰素谤丽 乍焉可增强其抗乙黧翳炎瘸毒和橱萨期病毒 的作用。对于篡他病毒的活性抑制作用也是网前研究的热点问题。 2 4 彩响巍疫系统 t c s 对免疫系统具商增强和抑制两方面作用。t c s 具有免疫原性，肌肉注 射盾可刺激机体产生程魔不等的特弹性i g e 和i g g 抗体。用化学方法产象t c s 片段，将这些片段与多秘抗t c s 抗体共同孵肖。结果，对应于缀基酸卜一7 2 和 1 5 3 2 4 6 处的片段对同单克隆抗体有免痰活性，说明它们属于同一个j 宄原表 霞，势怠均呈瑗出缀强弱摭漂性。零e s 同露魄是一秽兔疫按裁裁，辩终滚焚疫畜 明显抑制作用。无毒剂纛的t c s 可抑制t _ 淋巴细胞的活化、增髓和分化，但并 不戆季霉翎垂然蓉爨绥魏斟k ) 匏活稼。苫c s 诱发夔受疫繇反应是邋避免疫途经嚣 非其细胞毒性而产生的。t c s 还可以通过干扰t c f 卜一c d 3 信号传导途径发挥免 疫繇制作震。l 己1 0 与彳e s 均能硝显捧裁撬藤疆至绥脆( a p c ) 上b 卜1 分子懿 表达，经它们处理过的a p c 上检测不到b 7 一l m r n a ，说明t c s 可干扰b 7 一c d 2 8 共刺激，彩晌举细胞活化。实验谣鹱，t c sw 抑青t 绷脆蹭殪及i l 2 的产生。 但是对b 细胞满化和抗体分泌必需的c d 4 0 c d 4 0 l 途径则无抑制作用，说明t c s 并不抑制b 细胞的活忧。 2 。5 毒副住用 临床应用时，使用t c s6 8 h 后可能出现发热、热痛、咽痛、关节痛、颈项 活动不利等副搀用，发热舄慰会俜肖矗细飕数丹高，个别病人还蹬现荨麻疹、腿 痛、肾毒性和神经系统的剐反应，还有报道发生血管性水肿、脑水肿、休克、出 囊等不受爱巍。阉嚣c s 毒强豹受疫嚣毪，琴| 起静急瞧过敏爱愆在其； 产戆貉 1 2 床应用中也有报道。降低t c s 的免疫原性，并增强体内活性是降低其毒性的主 要途径。t c s 表面的精氨酸2 9 ( r 2 9 ) 与赖氨酸1 7 3 ( k 1 7 3 ) 的密码在诱变p c r 引物 的作用下改变为半胱氨酸，c y s t c s 可在大肠杆菌中可高度表达。将葡聚糖与 半胱氨酸残基连接形成葡聚糖一t c s 复合物，在小鼠实验中此复合物保留了t c s 5 0 的致流产活性，而且体内滞留时间增加了2 6 倍；豚鼠的急性过敏反应的发 生率大大降低，i g g 和i g e 的产生量也减少。同时由于葡聚糖一t c s 复合物分子 远大于t c s ，所以肾清除率减慢，血浆半衰期延长。用聚乙二醇( p e g ) 与特异位 点突变的t c s ( k 1 7 3 c ) 连接形成p e c 也0 l c _ l ( 1 7 3 复合物，同样可以降低t c s 的免 疫原性，且其生物活性不变。这可能是由于p e g 掩盖了t c s 的抗原位点，使宿 主免疫系统不能识别t c s ，也可能是p e g 干扰了抗原提呈过程。免疫原性降低 的程度部分地与连接的p e g 分子的大小及数目有关，通常t c s 连接的p e g 的 分子越大、数目越多，降低的程度就越大。免疫原性降低的程度也依于p e g 连 接的位点，k 1 7 3 位呈现了强的免疫原性，p e g 与此处相连可大大降低t c s 的免 疫原性。 二、单克隆抗体技术研究进展及发展现状 1 9 7 5 年8 月7 日，英国剑桥大学分子生物学研究室的k o h l e r 和m 儿s t e i n 发表了“分泌预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”这一著名论文 ( n a t u r e ，2 5 6 ：4 9 5 ，1 9 7 5 ) ，从而创立了一项具有划时代意义的新技术利用b 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d i e s ，m c a b ) 。这一技术 的创立和迅速推广，为所有需要制备和使用抗体的研究领域提供了全新的手段和 制剂，促进了细胞生物学、免疫学、遗传学、微生物学、生物化学及基础与临床 医学等众多学科的发展。它和遗传工程技术一样，被认为是具有巨大生命力和发 展前途的新技术k o h l e r 和m i l s t e i n 也由于这一杰出贡献而荣获1 9 8 4 年诺贝 尔医学和，土理学奖。 1 、杂交瘤技术的概念麓分类 杂交痃技术熬基戡是本毽纪6 0 年代建立的缨溅杂交技本。缨瑰杂交瓣含义 包括细胞的自家融合戏在诱导物的作用下，使种内域种间的细胞融合成一个新的 缁魏( 杂交缍戆) ，融合爱豹缫蘧其有黻紊鹣缨怼辕，经有丝分裂残必强夺荤孩 子细胞，其核内含有双亲细胞的染色体。因而可表现出双亲细胞所具脊的全部或 鄢分特毪。 若一种肿瘤细胞与另一种体细胞，如淋巴细胞融合，所形成的杂交细胞称为 杂交瘤细臆，简称杂交瘤。其染色体来源于双亲细胞，因此溉其有髀瘤细胞无限 域殖的能力。也具有淋巴细胞的一些特性，如分泌抗体等。 目前成用的淋巴细胞杂交瘸技术主瑟包括两种，一是b 淋巴细胞杂交技术， 都用骨髓瘸细胞与8 漤巴细胞遴行融合，其产物为抗体分子；二是t 薅誊巴细胞杂 交瘤技术，即用t 细胞肿瘤细胞与t 淋巴细胞进行融合，其产物为具有不同生物 学淫蛀戆t 纲憨杂交癯缨照秘器秘漤巴戮予。逶誉入翻骶说瓣杂交癌技零或骐e 熊 技术都是指b 淋巴细胞杂交瘤技术，即m c a b 的制备和应用技术。 2 、孽尧隆抗体豹概念疑特性 2 1 b 的概念 1 9 5 7 簪。器u r n e t 跌近谯遗黉学懿煮疫寒解释抗体翡产塞税隶l ，掇滋了著名 的“细胞系选择学说”，其中一个重要论点是认为姆个b 淋熙细胞都肖种独特 的受俸，必能与一种结构稆适疲的抗覆决定簇结含，由i 逝激滔的这一缁胞系( 党 隆) 只产生针对这一抗原决定簇的、结构与功能完全相同的抗体( 这实际上就是 m c a b ) 。虽然这一论点被后来的一系刊研究所证实，但是长期以来入 f j 所说( 及 所用) 的特异性免疫赢清抗体，不论是从人还是动物获褥的，也不论是童动获搿 还是被动获得的，实际上都楚幽许多种贝有不同特性的抗体所组成的混合抗体。 4 蘩j 鲡凝使蹩筑纯静篥稀瘸毒接释，j 、躐得到豹免疫巍清，氇禽宥特异性不同( 抗病 毒的不同成份或抗原决定簇) 、亲期力不同( 高低霹相差万僚) 、抗体类别及贬类 不同( i g g l 、i g g 2 a 、i g g 2 b 、i g g 3 及i 酬) ，以及其他功能特性( 如中和活性、 盘凝挪翻滔性等) 魄不同静多种抗体，这是因为人们无法将伟内已爱抗原刺激豹 各釉不同的b 漤巴耋鼹胞克爨区分开来，即使在体癸裁垮它们分戏单缎照，瞧无法 让它们持续生长并分泌抗体，因此用常规方法制备的免疫m 清抗体只能是由许多 8 淋巴细胞克隆所产生酌j # 沟质性抗体，魂称多克酝抗体( p c a b ) 。 1 9 7 5 零，k o h l e r 秘鹾i l s t e i n 农愿缨藏杂交援零进磐熬免疫学耢突孛，将已 造威于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞妇绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融会，发 现融台形成的杂交瘸缅胞其有双亲细胞盼特征，既象骨髓瘤细胞一样在体外培养 中无限蟪快速避貔，又持续蜷分泌特雾性捷俸，透过完骚扰霹傻杂交瘸缨夔 成为纯一的单克隆系，由此单克隆系就能获得结构岛各种特性完全相同的离纯度 抗体。 2 。2 鼙。怂懿生妥穗轰 与p c a b 相比，m c a b 主器具有以下三个显著特点： 2 2 1 高度均质性：如前所述，m c a b 怒由起始于一个b 淋巴细胞的单克隆 系凝分泌瓣，嚣魏楚一耪每令获俸分子戆缝掇( 惫摇氮薹酸撵捌蹶黟莘羹空耀镌墼) 都相同的均质抗体，而不是可随每个免疫动物的不同，甚至随同一动物的不同次 采擞而不同的非均质性抗体。 2 。2 。2 裹度特髯性；耩c 黯哭专一逡赞辩撬嚣分子上蕈个抗覆决定簇莛爱应， 一般不发生交叉反应。 2 2 3 来源稳定，可大量生产；当得到稳定分泌m c a b 的杂交瘸细胞系后， 胃程滚氮孛长期保存，需要对取密复苏，羲冒在髂磐培葬审裁备醋c 怒，巍可将 杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔内，然后从荷瘦小鼠的腹水中收获大爨m c a b 。 表l a b 与p c a b 的特点比较 p c a bm c a b 培养上清液腹水 抗体产生缁魏 多究隆缝 擎克酝瞧 对免疫原纯度的要求用不纯抗原免疫时，所得可用相对不纯的抗原获得 莸髂不楚 缝藐镕 供应量有黻基本上无限 褰效撬体( 鸭鞭1 ) o 。l l0 0 l o 鹋、0 5 0l 5 无关i g ( m g 1 ) l 1 5原则上没有o 5 1 其缝盘潺鬃白存在没有或最有少囊存在 小牛m 清 均质性不均一，为多不同特性不均一，抗体特性及结构完 同结构抗全的混合物全相同 特异性 较高，能与抗原上多个决高，只针对抗原的某决定 定簇结合簇 交叉反应能岛带有共同抗原决定一般无交叉反应 簇懿莸骧超爱应 稳定性较好相对较麓( 对p h 变化敏感， 对熬不稳定，撬缝过程中 易变性) 熏复缝及据毽纯 从不霜动物、不嗣挞次黪各援纂零一榉，套易标毽 得抗体均不一样，难以标 化 准他 沉淀反应 有，( 困与抗原多价结含大多秃( 因与抗原结合后 易形成网状结构)只产生二聚体，不能直接 形成抗原抗体沉淀物) 用于常规免疫学检验 可用 需选择( 或组合) 应用 3 、运用细胞融金技术制备单竟隆抗体的方法 3 1 绷胞融台 鲴魅融套裁跫爨令或两令鞋上熬绥灏会蒡或令缨艇斡过程。人钠缀旱裁发 现了细胞融合现象，例如早在l 8 3 8 年，m i i l l e r 就曾描述过脊椎动物肿瘤细胞可 融会形藏多孩甥憝：l 毽g i 曲馥l ( 1 8 7 3 ) 在必筏黢疮震圈缝织孛瞧溪察弱融合熬多援 细胞，但遮些现象一赢未能得到确切的解释和重视。自组织培养技术建立以后， 发现俸筹培养静箍魏也能融合成多孩誊纲麓。鞠年代入稍簸注意到，麻疹病毒 和腮腺炎瘸毒等能引起细胞融合。1 9 6 1 年，b a r s k i 的研究进一步肯定了组织培 养中体纲臆的融合瑰象。o k a d a 首创用铀台病毒诱导细施融食韵方法，在体外使 小鼠艾氏腹水痘细胞得以融合，建立了细胞融合技术。1 9 6 5 年，h a r r i s 用仙台瘸 毒在体外使培养的人h e l a 绷胞与小鼠艾氏腹水瘸细胞融产生许多多核体细 腿，其中密盼为同核体细胞( 阅秘蛔胞闻的融合) ，蠢的为异核体细胞( 异静细胞 间的融合) ，即杂交细胞，这种杂交细胞具有两种亲本细胞的某些特毂，继而骨 髓癯缨腿悉靛建立，隽产生醚c a b 豹杂交癯融合爨供了理想戆条终。 细胞融合过程先是细胞膜和细胞质的融合，然后通过有艘分裂细胞核合而为 一，形成凝熬杂秘缡魏。在遴鬻壤凌下，薅缝庭匏鑫发整熬会是辍少舞豹，毽淹 备自存在糟完整的细胞膜。但在某些特殊诱导物( 促融剂) 的作用下，细胞膜发生 一定变纯，藏胃使嚣个或多个缀庭发垒融合。在缎施融合投寒孛，藩巍应焉爨多 的促融剂炽仙台病毒但由予其存在不少缺点，现在已基本不用了，而p e g 则 成为磊 i 苕瘟用，矮广静键融剩。就缅魏融台方法来说，西静国内辨绝大多数蜜 骏室仍采用p e g 法。 3 2 镧养细穗的制备 在杂交瘸细胞的培养过程中，由于大囊骨髓瘸细胞和膊细胞在h a t 培养波 中相继死亡，此时单个或少数分散的细胞多半不翁存活，通常必须加入其他活细 胞方辘使之繁殖，这种被加入的活细胞就称为饲养细胞( f e e d 酶gc e l l ) 。饲养细 胞促j 蓬e 萁他细胞增殖的机耀尚不十分明了：一般认为可能是这类细胞在培养液中 释放一种( 或几种) 非种属特异性的生长刺激因子，为其他细胞( 如杂交瘸细胞) 提 揆瑟簧豹宝长条尊；逡霹戆是鸯了瀵是羲堂杂交建缍隗怼缀鬟整澄熬蔹羧毪；鬣 为脊的新生杂交瘤细胞不耐稀释，采用小鼠腹腔巨噬细胞作饲养绷胞时，还能起 到消除死亡细胞的作用。因此，在细胞融合、杂交瘤细胞选择性培养及克隆化等 过程审，均器加入饲养缨臆。可用作饲养细腿的童要有小鼠腹腔愿噬细胞、小鼠 舞缨稳、枣甄或大鬣麓艨缳戆等。这些绥戆瓷组织绩养条转下零蹇都不能繁殖， 尤其通用于液体培养的杂窥瘪细胞。其中又以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较 为方便，又有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用，因此使用最为酱遍。 3 3 暾l 雏选择牲壤葵 h a = r 选择性培养液怒在一般细脆培养波中加入次黄嘌呤( ) 、氮基喋岭( a ) 和胸腺嘧啶核苷( t ) ，它是根据细胞内嘌噙梭苷酸和嘧啶核苷黻的生物合成途 径设计的、甩于分离杂交纲胞的特殊培养液。 一敷| l 串瘥缨蕤熬渊a 奎黪会藤毒秀象途径，一条爰生魏合泼戆萋要途经， 即由氨蒸酸及其他小分子化含物合成核营酸。进而合成d n a 。猩此合成途径中， 叶酸衍生物是必不可少的媒介物，因为它参岛嘌呤环和胸腺嘧啶甲基的生物合 成。搦一条途径是应急途径豉称牵 救途径，它怒利用外源性的核耱黢的“前体”， 懿次焚嘌冷帮擒糠癌踺竣蓊，在稳应酶貔谨识下合藏核营酸，磬辫要魏酶裁是次 黄嗓呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶( i ) ，p o x a n t h i n e g u a n i n ep h o s p h o 抽o s y l n 铋s f e r a s e ，h g 砌盯) 和胸腺嘧睫核苷激酶( 脚m i d i n ek i n a s e ，t k ) ，若缺乏其中 一耪瓣，该途径便瞧不熊遴行。 壬 a 丁培养滚中豹氨蒸臻岭是一种辞酸撼抗物，它可疆断缁臌内d n a 生物 合成的燕要途径，但该培养液同时提供了核瞥酸的“前体”次黄嘌呤和胸腺 l 寒 嗉嚏核萤。目前杂交癯技术中常用的小瓢置髓癯缨魃系，如x 6 3 a 9 8 、n s 1 翻 s p 2 ，o 均砖用毒性药物8 氦杂鸟嘌呤选择出来的缺乏h g p r t 的细胞株。当细胞 融合后，将缨魔混会糖置于薹董a 王培养液孛进行培莽对，其中粒髓瘗缨毵及其秘 艇融合形成的同核体细胞的d n a 合成的主要途径被氨基喋呤阻断，同时又因缺 泛 g p r 羊，不l 穰翅蘩莠滚审懿次黄漂泠，显然窍可鞠焉黪藏缓啶菝营， 佩不能完成的d n a 台成过程，因此它们在h a t 培养液中便不能增趟丽很快死 亡；毒鬣麟缍麓及冀耀互融合形残懿同棱俸缨麓鬣有 g p r t ，毽秧纛在组织港 弊液中增麓的能力，般在5 7 天内也会死亡：唯商杂交瘤细胞由于具有两种亲 代缩稳的浆色体( 基蠲组) ，飙蕊既可产生原来薜绷胞所有酌h g p r t ( 和，或t k ) ， 又从骨髓瘸细胞中获褥了在组织培养中生长繁殖的特性，因此能在h a t 培养波 巾选择性存活下来，并不断增殖。 3 。4 融食细胞选择性培养的方法 3 a 1 将融合后的细胞悬浮于h a ：r 培养液中，鬻3 7 、含5 8 c 0 2 的培养 瓣内培养。攫据情况每2 3 天更换培养波一次，抉液酵吸去l 垃2 玛壤莠渡，掇 入等量新鲜培养液。所用的培养液应按培养的时间不同而有所不同：谯融合后7 必肉用臻蟮培养波：筹卜l 霹天震 嚣蝰莽滚；蘩1 4 天l 美鼹露营逶黥宠全莲养 液。 嚣嚣多数天主张强簸台当必，嚣聚会屠立帮麓壬 a t 培养滚透季亍臻莽；毽也 脊人主张在融合当天只加h t 培养液，第2 天才补加氨基喋呤；还有人在融合后 宠爱普逶酌完全戆跷较结果，还是戮融仓当天帮馒瘸 a t 臻养液为赂，不仅撩 作简便，而且杂交瘤细胞出现也早。我们多次实验证明，在使用h a t 培养液后 褥用h 了培养液过渡一璃，可以往杂交瘸缅脆更浃魄繁殖，筹突然换以普通的完 龛培养液，不仅杂交瘸细胞生长较慢，麟且有时还可能导致杂交瘤细胞的死亡。 遮可能是鳓为氨基喋呤阻断了细胞内核背酸合成豹主要途较，在停用氨基喋呤 后，培养液或细胞内仍含有残留的氨基喋呤起作用，因此应继续补加h t ，为杂 交瘤细胞继续提供通过应急途径合成d n a 所必需的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷。 3 3 2 观察细胞生长情况 根据所使用的骨髓瘤细胞等条件的不同，融合后细胞生长的情况也会有些差 别。用倒置显徽镜观察，一次成功的融合实验其细胞生长情况大致如下。 融合当天( 第l 天) ：可见瘤细胞透亮，形态多样，相互之间有粘连、重叠， 并可见到巨细胞或哑铃状的细胞。 融合后第2 3 天：瘤细胞数量锐减，有大量的破碎细胞，残留的瘤细胞折光 性差，或呈现暗黑、皱缩；可见少数形态良好，透亮的细胞，但不能判定它们是 残存的瘤细胞还是早期的融合细胞。 融合后4 5 天：瘤细胞几乎全部消失，在巨噬细胞周围聚集着许多大小不等 的细胞碎片，可见形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮，呈葡萄串状分布的融合细胞小集 落克隆，细胞数多少不等，而且细胞数增加很快。 融合后第6 7 天：细胞克隆继续长大，如检测方法敏感，此时即可取部分克 隆的培养上清液检测相应的特异性抗体。 融合后第8 9 天：细胞克隆继续长大，大者可达1 ，3 1 2 培养孔的面积，此 时即可对所有克隆生长孔的培养上清进行检测。 对检测出特异性抗体阳性孔的细胞，应及时转种并进行克隆化。对检测阴性 的孔，如考虑是因细胞克隆尚小，分泌抗体较少的缘故，可隔2 日荐检测一次， 如仍为阴性，则可弃去。 4 、单克隆抗体的筛选与检测 检测杂交瘤细胞系是否分泌特异性m c a b ，是关系到制备m c a b 成败的一个 关键问题。在细胞融合前，必须首先建立至少一种可靠的检测方法，否则，面对 一天天不断长大的细胞克隆，就会手足无措。为了尽快地筛选出阳性克隆，必须 2 0 采麓微耋、快速、特异、敏感、简倭、并适鼍：一次稔测大撬标本的方法，尤其在 进霉予亚克隆畦，篾馒更为重要。 由于制餐抗体时所用抗原的特性各异，因此很雉以种通用的方法来检测不 同的m c a b 。下面以酶免疫测定法为主，推荐一些不同的方法，以供选用。 霹。 免痰酸技术 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显包反应的高效催化作 用有机结合丽成的免疫学技术。由予它特异性强，灵敏度离，现已广泛用予筛选 蠢鉴定m c a b 。 4 1 1 闻接e l i s a 用已知的可溶能抗原( 如蛋白质等) 或颗粒性抗原( 如细胞和细胞等) 包被 载体，热入德潮瓣觚e a b 榉燕，著赴冬撬暴榛对应，慰与糖袭菝覆缝合； 洗涤后再加入酶标记的第= 抗体，则形成固相化的抗原抗体酶标第二抗体复合 物。依据底物显色殿应的强度，可对待测m c a b 榈进行定性藏定量分析。该法中 瑟惩戆酶稼第二菝体霹戳是瘸子检溅各耱嚣深瞧醚c 硒静，毽露鬟麓标s 懿代 替酶标第二抗体。 4 1 2 抗体捕捉e l l s a 零法孛爨要一耱与产生m c a b 懿动耪不嚣魏特孬往多雯疆抗体。蓄先羯藐鬣 的抗体将待测的m c a b 样品捕捉在圆相载体上，再加摭原、酶标多克隆抗体及底 物鼠色。该法具有特异性强、敏感性高、受外界因素干扰小等特点，是目前常用 各耱e l i s a 法孛魄鞍理怒懿一释。 4 1 。3b a e l i s a b a e l i s a 是在常规e l i s a 原耀的基础上，借助生物豢( b i o t i n ) 与亲和素 ( a v i d 强) 阉豹离度放大佟褥丽建立静一静稔测系统。亲和豢由4 个驻萃位魉成， 对生物素有 s 常高鲍亲和力，生物絮报易与摄自质共价结台。因此，结合了瓣鲍 亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子发生反应，即起到了多极放大作 用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈现色，从而达到检测未知m c a b 分子的目的。 4 2 免疫斑点实验 免疫斑点试验( d o ti m m u n o b i n d h 增a s s a y ，d i b a ) 是以硝酸纤维素膜或醋酸 纤维素膜为固相支持物，进行抗原抗体反应的免疫学检测方法。纤维素膜具有很 强的静电吸附力，在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。因而，将 抗原吸附于纤维素膜后，就可利用膜作为固相进行抗原抗体反应。当加入抗体后， 就可与膜上的抗原结合，然后再加入带有标记物的抗抗体，使标记物通过抗体抗 体和相应抗体的结合而间接地交联于纤维素膜上。加入标记物相应的不溶性底物 后，两者作用即可形成不溶性产物，呈现斑点状着氧化物酶( h r p ) 免疫斑点试 验、碱性磷酸酶( a p ) 免疫斑点试验及免疫金银斑点试验等。其中最常用的是 h r p 免疫斑点试验。 4 3a p 从p 免疫组化染色法 以抗鼠抗体为桥梁将鼠源性识别抗原的第一抗体与鼠源性的抗a p m c a b a p 复合物相连接，使之成为a 乎a b l a b 2 抗a p a p 的复合物。还可通过 二抗将a p a a p 复合物重复叠加起来，从而使多个a p 标记于第一抗体所识别的 抗原部位，从而提高其敏感性。m ! u 一技术既可用于对吸附于纤维素膜上可溶 性抗原的免疫斑点试验，也可用于对玻片上细胞性抗原的免疫组化色。 4 4 免疫荧光技术 免疫荧光技术是重要的免疫标记技术之一，在m c a b 的筛选与鉴定上具有重 要的应用价值。 5 、克隆化技术 克隆化( c l o i l i n g ) 是指使单个细胞通过无性繁殖而获得该细胞团体的整个培 养过程。这种细胞团体的每个细胞的生物学特性和功能完全相同，经克隆化获得 的杂交瘤也称亚克隆。由于大多数情况下产生特异性抗体的杂交瘤集落不是来自 单个细胞，其中可能混有不分泌抗体的克隆，而且它比分泌抗体的克隆生长快， 因此应尽早进行检测及克隆化。刚刚融合获得的杂交瘤不稳定，染色体易选择， 既便经过多次克隆化，分离出分泌抗体的杂交瘤细胞系，在培养过程中也会发生 变异，不再产生抗体，因此需要再克隆化，选择出分泌特异性抗体的杂交瘤。一 般融合后获得的杂瘤要经过2 3 次的克隆化，达到1 0 0 孔均为抗体阳性克隆为 止。另外，长期冻存于液氮的杂交瘤细胞，复苏后分泌特异性抗体的功能仍有丢 失的可能，因此也应定期作克隆化，检测抗体分泌情况。 细胞融合后第一次克隆化的时间应尽可能早，越早越不容易丢失阳性克隆。 因此要求尽早检测，以确定细胞融合后的克隆是否分泌特异性抗体( 当然这主要 还依赖于检测方法大小，应立即进行克隆化，这是保证克隆化成功，获得稳定分 泌m c a b 的杂交瘤细胞系的非常重要的一环。 由于融合过程中，杂交瘤是在h a t 选择性培养液中生长，其生长力比它的 亲本骨髓瘤细胞弱，当确认骨髓瘤细胞已死亡时，第一次克隆化应改用含h t 的 培养液，以提供足够的嘌呤和嘧啶核苷，以后的克隆化可用不含h t 的培养液。 此外，由于单个细胞难以存活，克隆化时常需加入饲养以提供必要的淋巴细胞生 长因子。 三、抗v 中药研究发展现状 1 、v 的发现及命名 人免疫缺陷病毒( h i v ) 是引起艾滋病的病原体，h i v 属逆转录病毒科 ( r e t r o v i r i d a e ) 慢病毒亚科( l e n t i v i r i n a e ) 。美国疾病控制中心的流行病学家 于1 9 8 1 年在美国首先发现获得性免疫缺陷综合征( a c q u i r e di m m u n o d e f i c i e n c y s y n d r o 稻e ，艾滋病) ，并证鞠这是一种新的传染性滚瘸。1 9 8 3 年到1 9 8 4 年，法 国憋囊德磺究所的氍o n t 8 9 n i e r 、美国国立墨生硬究院国立癌痉磺究质的g a l l 。 和加州大学三藩市分校的l e v y 先后从艾滋瘸