（果树学专业论文）光诱导苹果果实着色相关基因的克隆和表达分析.pdf

山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 苹果( m a l u sd o m e s t i c ab ) 是世界上最重要的鲜食果品之一，果实色泽 是重要的外观品质。为了研究光诱导苹果果实着色的调控机制，本文克隆 了与苹果着色有关的5 个基因的e d n a 全长和花青素合成途径中两个关键 酶基因的启动子，并分析了它们的光诱导表达模式。主要结果如下： 1 从苹果果皮中克隆了朋敬豫y 1 、m d c r y 2 、燃o p l 、刎c 卯2 和? i 纪 打曰j 的全长c d n a 以及花青素合成关键酶基因m d d f r 和膨u 粥丁 的启动子。 m d c r y le d n a 全长2 31 0b p ，编码一条含有6 8 0 个氨基酸残基的蛋白， 估计分子量为7 6 6k d ，预测等电点( p i ) 为5 3 ，含有1 个高度保守的f a d 结构域，m d c r y l 与其它植物的c r y l 同源性在6 0 n 上，尤其是葡萄高 达8 3 5 。 m d c r y 2e d n a 全长2 1 0 2b p ，编码一条含6 4 8 个氨基酸残基的蛋白， 分子量约7 3 5k d ，预测等电点( p i ) 为5 7 ，含有在2 个高度保守的区域， 即d n a 光解酶区域和f a d 区域。 m d c o p l j e d n a 全长2 0 8 7b p ，编码一条含6 6 5 个氨基酸残基的蛋白， 包含1 个高度保守的w d 4 0 基序，分子量约为7 4 7k d ，预测等电点( p i ) 为6 4 。 m d c o p i 2e d n a 全长2 2 1 3b p ，编码一条含6 5 9 个氨基酸残基的蛋白， 含有1 个高度保守的w d 4 0 基序，分子量大小约7 4 2k d ，预测等电点( p i ) 为6 2 。 m d m y b le d n a 全长8 6 5b p ，编码一条含2 4 3 个氨基酸残基的蛋白，存 在一个保守的r 2 r 3 结构域。m d d f r 、m d u f g t 启动子分别长l1 4 5 b p 和 1 6 7 4 b p ，它们都含有m r e 、m b s 或m b s i 等与m y b 类转录因子结合的 作用元件。 2 自然光明显诱导m d m y b l 、m d d f r 和m d u f g t 基因的表达，三个 基因在光诱导下的表达模式相似。 3 删门和m d c r y 2 基因的表达水平受光诱导，二者在光诱导下的表 达模式相似。 光诱导苹果果实着色相关基因的克隆和表达分析 4 在自然光处理下，伴随着上述基因的表达被激活或调控，果皮花青素 含量递增，果实实现着色。 关键词：苹果( m a l u sd o m e s t i c ab ) ；花青素；果实着色；基因克隆；表 达分析 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t a p p l ei so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf r e s hf r u i t sw o r l d w i d e p e e lc o l o ri sa l l i m p o r t a n tc o m p o n e n tf o rf i u i tq u a l i t y t og e ti n s i g h ti n t ot h em e c h a n i s m u n d e r l y i n ga p p l ef r u i tc o l o r a t i o n , w ec l o n e dt h ef u l l l e n g t hc d n a so ff i v e c o l o r a t i o n - r e l a t e dg e n e sa n dt h ep r o m o t e rr e g i o n so ft w oc o n t r u c t i v eg e n e s ， a n da n a l y z e dt h e i re x p r e s s i o nl e v e li nt h ep e e lo fb a g g i n ga p p l ef r u i t se x p o s e d t on a t u r a ll i g h t t h er e s u l t sa r es h o w na sf o l l o w s 1 f u l l l e n g t hc d n a so f5i m p o r t a n tg e n e s ，i e m d m y b l ，m d c r y l ， m d c r y 2 , m d c o p l - 1a n dm d c o p j 一2 ，a s s o c i a t e dw i t ha p p l ec o l o r a t i o n , a s w e l la st h ep r o m o t e rr e g i o n so ft w oc o n t r u c t i v eg e n e sm d d f ra n dm d u f g t f o ra n t h o c y a n i nb i o s y n t h e s i s ，w e r ei s o l a t e df r o ma p p l e t h ef u l l - l e n g t he d n ao f 朋黝门i s2 310b pi ns i z e i t so i 心e n c o d e d6 8 0 a m l l oa c i dr e s i d u e s t h ep r o t e i ni sp r e d i c a t e dt ob e7 6 6k di nm o l e c u l a r w e i g h ta n d5 3i np i ，a n dc o n t a i n sac o n s e r v e df a dd o m a i n c o m p a r e d 诵吐l o t h e rp l a n th o m o l o g si ng e n b a n k m d c r y1s h o w e d 6 0 i d e n t i t ya ta m i n o a c i dl e v e lt oi t sc o u n t e r p a r t sf r o mo t h e rp l a n ts p e c i e s ，e s p e c i a l l yu pt o8 3 5 t o g r a p e v i n ec r y lp r o t e i n t h ef u l l l e n g t hc d n ao fm d c r y 2i s210 2b pi ns i z ea n de n c o d e s6 4 8 a m i n oa c i dr e s i d u e s t h em o l e c u l a rw e i g h ta n dp io ft h ep r e d i c t e dp r o t e i na r e 7 3 5k da n d5 7 ，r e s p e c t i v e l y t h ep r e d i c t e dp r o t e i nc o n t a i n sac o n s e r v e df a d d o m a i na n dad n a p h o t o l y a s ed o m a i n t h ef u l l l e n g t he d n aq im a c o pl li s2 0 8 7b pi ns i z e i t so r fe n c o d e sa p r o t e i nc o n t a i n i n g6 6 5a m i n oa c i dr e s i d u e sw i t hm o l e c u l a rw e i g h t7 4 7k da n d p i6 4 t h ep r e d i c t e dp r o t e i nc o n t a i n sac o n s e r v e dw d - 4 0 m o t i f t h ef u l l - l e n g t hc d n ao fm d c o p l 2i s2 213b pi ns i z e i t so r fe n c o d e s 6 5 9a m i n oa c i dr e s i d u e s n l ep r e d i c a t e dm d c o p1 - 2p r o t e i nc o n t a i n s j 。a c o n s e r v e dw d - 4 0m o t i i t sm o l e c u l a rw e i g h ta n dp ia r e7 4 2k da n d6 2 ， r e s p e c t i v e l y t h ef u l l - l e n g t he d n ao fm d m y b li s8 6 5b pi ns i z e i t so r fe n c o d e s2 4 3 a m i n oa c i dr e s i d u e s t h ep r e d i c t e dm d m y b1 p r o t e i nc o n t a i n sc o n s e r v e d 3 光诱导苹果果实着色相关基因的克隆和表达分析 r 2 r 3m o t i f s t h ep r o m o t e r so fm d d f ra n dm d u f g ta r e114 5b pa n d16 7 4 b pi ns i z e ，r e s p e c t i v e l y t h e r ee x i s tc o n s e r v e dc s - a c t i n ge l e m e n t s ，i e m r e ， m b sa n dm b s ii nt w op r o m o t e r s ，t ow h i c hm y bt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s p o s s i b l yb i n d 2 l i g h te x p o s u r e i n d u c e st h ee x p r e s s i o no fm d m y b l ，m d d f ra n d m d u f g tg e n e s t h r e eg e n e ss h o wt h es i m i l a re x p r e s s i o np a t t e r n 3 b o t hm d c r y la n dm d c r y 2g e n e sa r ee x p r e s s e di nas i m i l a rp a r e mi n t h ep e e lo fb a g g i n ga p p l ef r u i t su p o ne x p o s e dt ol i g h tt r e a t m e n t 4 a l o n g 、析t l lt h et r i g g e r i n go rr e g u l a t i o nb yl i g h tt r e a t m e n t , a n t h o c y a n i n g r a d u a l l ya c c u m u l a t e si np e e l ，a n df r u i t sr u m r e di nc o l o r k e yw o r d s ：a p p l e ( m a l u sd o m e s t i c ab ) ；a n t h o c y a n i n ；f r u i tc o l o r a t i o n ；g e n e s c l o n e ；g e n ee x p r e s s i o n 4 英文缩略表 英文缩写英文名称中文名称 a m p a m p i c i l l i n氨苄青霉素 b p b a s e p a i r碱基对 c a m v 3 5 s p r o m 。t e r o f c a l i n 。w e rm o s o i cv i m s 蓍黧萋花叶病毒3 5 s 口斜j 】 t a e c d n a p v p d d h 2 0 d e p c c 砌 d n a d n t p e b e c o l i e d l a g f p q r t - p c r i p t g t r n a k a n l b t r i s - h c i e d t ab u f f e r c o m p l e m e n t a r yd n a p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e d i s t i l l e da n dd e i o n i z e dw a t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e c e t y l t r i m e r o m i d e t h y l a m m o l l o n i u m b d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e t h i d i u mb r o m i d e e s c h e r i c h i ac o l i d i s o d i u me t h y l e n d i a m i n e t e t r a c e t a t e g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n q u a n t i t i v e r e v e r s e 仃a n s c f i p f i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n i s o p r o p y l t h i o p - d - g a l a c t o s i d e t r a n s f e rr n a k a n a m y c i n l u r i a - b e r t a n im e d i u m i r i s 乙酸e d t a 缓 冲液 互补d n a 聚乙烯吡咯烷酮 重蒸水 焦碳酸二乙酯 十六烷基三乙基溴 化铵 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷 酸 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 绿色荧光蛋白 实时定量反转录聚 合酶链式反应 异丙基- p - d - 硫代半 乳糖苷 转运r n a 卡那霉素 l b 培养基 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并向 社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：乏丝擎磊 导师签名：拶， 日 期：坦咎f 二 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 花青素( a n t h o c y a n i n ) 及其衍生物是决定果实颜色的主要色素，该类色 素主要通过类黄酮途径( i s o f l a v o n o i dp a t h w a y ) 合成。目前，该代谢途径 中各种酶的生化特性已经非常清楚，编码这些酶的大多数结构基因也已经 克隆并鉴定( h o l t o na n dc o r n i s h ，1 9 9 5 ) 。很多研究表明，环境和发育信号 能够调控花青素合成途径中相关结构基因的表达，从而导致果实和花等器 官呈现不同的颜色，花瓣和果实的颜色在吸引动物进行授粉和种子传播等 方面有重要作用( s t i n t z i n ga n dc a r l e ，2 0 0 4 ) 。一个复杂的信号传导网络负 责对各种信号的感应和传递，其中转录因子是信号传导途径的重要组成部 分，现在已经知道，m y b b h l h w d 4 0 转录因子复合体在植物花青素生物 合成调控中起核心作用( s t r a c k ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 在苹果中，果实着色也受多种环境和发育信号的调控，其中光是最主要 的外部调节因子之一( w e i s s ，2 0 0 0 ) ，苹果果实花青素必须在光诱导下才能 进行生物合成( s a u r e ，19 9 0 ；l a n c a s t e ra n dd o u g a j l ，19 9 2 ；d o n ge ta 1 ，19 9 8o m y b 类转录因子是植物转录因子中最大的家族之一，目前在拟南芥、水稻、 玉米和棉花中分别鉴定了1 9 8 、1 8 3 、8 0 和2 0 0 个m y b 基因( c h e ne t a l ，2 0 0 6 ； r a b i n o w i c ze ta 1 ，1 9 9 9 ；c e d r o n ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在数目众多的m y b 基因中， 有些参与调控花青素合成，女i i a t p a p l 和a t p a p 2 调控拟南芥种皮中的花青 素合成( b o r e v i t ze ta 1 ，2 0 0 0 ) ，c 1 调控玉米胚乳的花青素合成( c o n ee ta 1 ， 1 9 8 6 ) ，p h m y b a n 2 调控矮牵牛花中的花青素合成( q u a t t r o c c h i oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 在果树中，葡萄v v m y b a l 和v v m y b a 2 两个转录因子可以通过调节 v v u f g t i 拘表达影响果实着色( k o b a y a s h i e ta 1 ，2 0 0 4 ；w a l k e re ta 1 ，2 0 0 7 ) ： 草莓f a m y b l 转录因子可以抑制转基因烟草中的花青素合成( a h a r o n ie ta 1 ， 2 0 0 1 ) ；在苹果中，目前已经克隆的着色相关m y b 类转录因子有m d m y b l 、 m d m y b 10 和m d m y b a ( 1 址o se ta 1 ，2 0 0 6 ；r i c h a r de ta 1 ，2 0 0 6 ；y u s u k ee ta 1 ， 2 0 0 7 ) ，这些转录因子在光诱导的苹果果实着色中起着重要的调控作用。 蓝光对植物的生长发育也起着重要的调节作用，它可以调节多种生理过 程，包括脱黄化、开花、昼夜节律、基因表达、向光性、叶绿体运动和气 孔运动等( b r i g g s a n dh u a l a 1 9 9 9 ；l 虹2 0 0 0 ) 。徐凯等( 2 0 0 7 ) 研究发现， 光诱导苹果果实着色相关基因的克隆和表达分析 蓝光可以促进草莓中花青素含量的增加，促使草莓变得更红，这说明蓝光 对草莓中花青素的合成有调节作用。在2 个世纪以前，高等植物的蓝光效 应就有过报道，1 9 9 3 年第1 个蓝光受体隐花色素c r y l 得到分离( a h m a d a n dc a s h m o r e ，1 9 9 3 ) 。不久，隐花色素c r y 2 也得到分离。目前，研究最 为广泛的是拟南芥中的三个隐花色素和两个向光素，现在已经分离得到的 c r y l 和c r y 2 都是核黄素蛋白，其辅基为核黄素，在植物茎的伸长、枝 叶伸展、花色素积累以及基因表达中起调控作用。 c o p l ( c o n s t i t u t i v e l yp h o t o m o r p h o g e n i c1 ) 是一个光调控 植物发育的分子开关( m o l e c u l a rs w i t c h ) ，在光形态建成中起抑制作用。当 植物在黑暗环境下生长时，c o p l 蛋白聚集在细胞核内，抑制光形态的建 成，而在光环境下，c o p l 蛋白则分散到细胞质中，对光形态建成的抑制 作用得以解除。c o p l 蛋白在细胞内的核质分布受光和光受体等多个因素 的影响，核内c o p l 通过与特异转录因子的相互作用来调节光形态建成。 h o n g 等( 2 0 0 8 ) 的结果表明，拟南芥c o p l 可以与隐花色素c r y l 相互作用， 并且能与m y b 类转录因子b i t l 结合，使其降解。这表明隐花色素基因， c o p l 基因及m y b 类转录因子可能存在于同一个途径中。 1 1 花色素苷的生物合成及其光调控 花青素( a n t h o c y a n i n ) 是一类广泛存在于植物中的黄酮类化合物，是植 物的次生代谢产物，对决定果实、花和种子的颜色起重要作用( r e g a ne ta 1 ， 2 0 0 1 ；s c h a e f e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。它由一系列附着于细胞膜和内质网膜上的酶催 化合成，然后运输并积累在维管植物液泡中。目前花青素的生物合成途径 已经基本上清楚( a w a de ta 1 ，2 0 0 1 ；t a k o s e ta 1 ，2 0 0 6 ) ，多种植物中编码合 成花青素的酶基因也已得到克隆( 赵云鹏等，2 0 0 3 ；s c 城j l e ne ta 1 j2 0 0 4 ) 。 1 1 1 花色素苷的结构 花色素苷( a n t h o c y a n i n ) 又称花青素，主要存在于植物的花、果、叶和 茎内( f e i l de ta 1 ，2 0 0 1 ) 。由植物中分离到的花色素分子中，c 3 ( 或c 3 、 c 5 ) 位上的羟基常与葡萄糖、鼠李糖、丰乳糖以及某些戊糖缩合成花色苷。 花色素根据结构可分为三种基本类型：缔纹天竺素、矢车菊素和飞燕草素 ( 图1 1 ) 。花色素和花色苷类大多可溶于水、乙醇等亲水性溶剂。现已知 山东农业大学硕士学位论文 在2 7 个科、7 3 个属中存在2 5 0 多种天然花色苷。 飞 呱心删 # j - 图1 - 1 花色素的三种基本类型 f i g1 1 t h r e et y p e so fa n t h o c y a n i d i n 1 1 2 花青素的生物合成途径 花青素生物合成过程中的催化酶主要有：苯丙氨酸解氨酶( p h e n y l a 】a n i n e a m m o n i a l y a s e ，伴山) ；查尔酮合成酶( c h a l c o n es y n t h a s e ，c h s ) ；查尔酮异 构酶( c h a l c o n e f l a v a n o n ei s o m e r a s e ，c h i ) ；黄烷酮3 羟化酶( f l a v a n o n e 3 - h y d r o x y l a s e ，f 3 h ) ；二氢黄酮醇- 4 - 还原酶( d i h y d r o f l a v o n o l 一4 一r e d u c t a s e ， d f r ) ；花色素合成酶( a n t h o c y a n i d i n s y n t h a s e ，a n s ) 和类黄酮3 0 葡糖基 转移酶( u d p g l u c o s e - f l a v o n o i d3 - 0 一g l u c o s y l - t r a n s f e r a s e ，u f g t ) 。 花青素的生物合成在总体上可以分为三大步骤( 图1 2 ) ：先是苯丙氨酸 在苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 、肉桂酸羟化酶( c 4 h ) 和c o a 连接酶( 4 c l ) 的作用下，生成香豆酸c o a 。在p a l 催化的基础上产生香豆酰( b u c h a n a ne t a 1 ，2 0 0 0 ) 。然后香豆酰c o a 在c h s 、c h i 和f 3 h 的催化下产生无色的二氢黄 酮醇。其中，c h s 的表达受诸多内外因素的调控，信号因子之间相互作用 形成复杂的调控网络。再后，二氢黄酮醇在f 3 t h ，f 3 5 h 矛d d f r 的催化下 生成无色花青素，进而在花色素合成酶( a n s ) 和类黄酮3 o 葡糖基转移 酶( u f g t ) 的作用下将无色花青素转变成为修饰的花青素( h o l t o na n d c o r m i s h 1 9 9 5 ) 。 光诱导苹果果实着色相关基因的克隆和表达分析 i r i s h 麓警擎舢_ 型甓羚概拳删一 乡 孑 童尔舟戚一i 蠢尔囊彝构- i 饰 鬟棒冀量 髑掣r 7 毫蝴 撩反柏 k品硼化- li p ，h t黄雠奢f 咐i m 膏硝硼雌i 黄雠奢l 咐 二山艄塑曼塑：塑爿赢塑! ! 嬲，璐k i 嗍二簟一誊啊d z i l l 2 k d z i l l 2 k 雠l io 挑i 淞帆i ：t 冀囊娟簟ld ，r 无色罩t 鼍 上盖邑矢手尊色囊 i 悄匏天钤 n sl 甚曩媳黼柚3 瞄斛知 l u 泔 秘重 p 翰? t 0 ：o 椭冀，i i - 毒- o 艚蕊转事- 懈i 玎，瀚色； - i 螂警 鼍：材矗0 盼三瞰e 毒盯 c 眦色， “ 罩簟曩斗t 番曹毒e 拍 l 溅弋i 眦 必事嚣色曩 餐譬瞥 c fi ，c 才l ， 舞车誓色曩孓暮譬警善鼍 m t ii m n l 曩憎霸8 囊囔，- 鼍 奢事鞠i ( 墨，汜j( 鼍曩己)膏【芑， 图1 - 2 花青素生物合成途径( h o l t o na n dc o r m i s h ，1 9 9 5 ) f i gl - 2d i a g r a m m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h ef l a v o n o i db i o s y n t h e t i cp a t h w a y 1 1 3 花色素苷合成中的调控 植物花青素的时空合成机制已有深入的研究。已有的研究表明，不同植 物中的花青素生物合成受2 类基因的共同控制：类是结构基因，编码生 物合成途径中所需的酶；另一类是调节基因，编码调控结构基因时空表达 的转录因子。目前已分离和鉴定了3 类花青素合成的转录因子：( 1 ) i 毪r 3 m y b 蛋白；( 2 ) m y c 家族的b h l h 蛋白；( 3 ) w d 4 0 蛋白( r a m s a y a n d g l o v e r , 2 0 0 5 ) 。 1 1 3 1 二氢黄酮醇一4 - 还原酶( d f r ，d i h y d r o f l a v o n 0 1 4 r e d u c t a s e ) 二氢黄酮醇4 还原酶( d i h y d r o f l a v o n 0 1 4 - r e d u c t a s e ，d f r ) 是花色素苷生 物合成途径中的关键酶，是一个重要的调控点。它能催化3 种二氢类黄酮 山东农业大学硕士学位论文 醇底物生成无色花青素，由此可见，d f r 是将二氢黄酮醇转变为花色素苷 反应的第1 个酶。d f r 在花色素苷生物合成中的关键作用最初是在紫罗兰 一个突变体中发现的。d f r 基因在植物基因组中一般为单拷贝( h e l l e re ta 1 ， 1 9 8 5 ) 。 d f r 最大的特点是能够选择性地将3 种二氢黄酮醇d h k 、d h q 和d h m 底物催化成相应的花色素苷。在矮牵牛和兰花( c y m b i d i u mh y b r i d a ) 中， d f r 能有效催化d h q 和d h m 两种底物生成矢车菊素和飞燕草素，使其最 终在花瓣中积累( j o h n s o ne ta 1 ，1 9 9 9 ) ；在非洲菊( g e r b e r ah y b r i d a ) 中， d f r 簖o j 用全部3 种二氢黄酮醇作为催化底物，这种d f r 对底物的选择性解 释了为什么橙色的天竺葵素存在于非洲菊中，但不存在于矮牵牛中 ( j o h n s o ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 在苹果中虽然非红色苹果不积累花青苷，但是d f r 酶也保持较高的活 性，j u 等( 1 9 9 9 ) 研究指出，在没有花青苷积累的果实膨大期，红色品种 的d f r 也有一定活性。套袋果实除袋前不仅d f r 没有活性，而且果实中也 没有类黄酮的合成：早期除袋，虽然d f r 活性增加，却没有花青素的积累； 稍晚除袋，d f r 活性增强，花青苷大量合成。 1 1 3 2 花青素- 3 0 葡糖基转移酶( u v g t , u d p g f l a v o n o i d - 3 - 0 - s y l t r a n s f e r a s e ) u f g t 可以使不稳定的花青素转变为稳定的花青苷，并由无色转变为有 色。u f g t 活性和花青苷积累之间呈明显的正相关，乙烯处理和套袋都可 提高u f g t 活性，促进花青苷的合成( j ue ta 1 ，1 9 9 5 ) 。但是，在果实膨大 期没有花青苷积累时，u f g t 活性仍然较高，而且此时施用乙烯利可以提 高u f g t 活性，但是却没有花青苷的积累，这说明u f g t 不是花青苷合成的 关键酶。j u 等( 1 9 9 9 ) 试验结果表明，延迟收获，黄色和绿色苹果也能合 成花青苷， k o b a y a s h i 等( 2 0 0 4 ) 用n o r t h e m 杂交研究u f g 瑾因，白色葡萄品种和 它的红色突变系中都有u f g 瑾因，且编码区结构相同，由此推断，红色 突变类型是调控u f g 瑾因表达的调节基因发生了突变，引起u f g 瑾因在 果皮中强烈表达，产生了红色品种。基因检测显示黄色葡萄品种也存在与 花色素苷合成相关酶基因，只是表达丰度较紫色品种弱，所以u f g t 基因 9 光诱导苹果果实着色相关基因的克隆和表达分析 的表达在葡萄花青苷合成中具有决定性的作用。因此，u f g t 是调控花青 苷合成的关键酶之一。 1 2m y b 转录因子 在植物的生长发育过程中，细胞之间出现了各种分化，原因就是细胞内 的基因表达在时间和空间上存在差异，导致这种差异的主要原因之一就是 转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r , t f ) 在转录水平上的调节作用( g e r te ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。转录因子也称为反式作用因子，是指能够与真核基因的顺式作用 元件发生特异性相互作用，并对转录有激活或抑制作用的d n a 结合蛋白 ( 刘强，2 0 0 0 ) 。 m y b 转录因子是其中非常重要的一类，而且是植物转录因子中最大的 家族之一。最早的m y b 转录因子( v m y b ) 是从鸟类的白血病病毒a m v 和e 2 6 中发现的，一般认为，v m y b 是其前体c m y b 在氨基端和羧基端缩 减部分氨基酸残基而成( k l e m p n a u e r e ta 1 ，1 9 8 2 ) 。玉米的c 7 基因所编码的 蛋白是一个从植物中发现的m y b 转录因子，后来研究发现，在拟南芥和玉 米等许多植物中都存在着大量的m y b 转录因子，它们在调节转录中起着多 方面的重要作用。 1 2 1m y b 转录因子结构特征 m y b 蛋白包含一段保守的m y b 结构域，每个m y b 结构域是一段约 5 1 5 3 个氨基酸的肽段，包含有一系列的高度保守的氨基酸残基和间隔序 列。首先是每隔约1 8 个氨基酸间隔的色氨酸残基，它们参与空间结构中疏 水核心的形成( h a i l i n ga n dc a t h i e ，1 9 9 9 ) 。有时该残基会被某个芳香族氨 基酸或疏水氨基酸所取代。其次，在每个保守的氨基酸前后都存在一些高 度保守的氨基酸，例如在第1 个色氨酸的c 末端通常是一簇酸性氨基酸。正 是上述这些保守的氨基酸残基使得m y b 结构域折叠成螺旋螺旋转角螺 旋( h e l i x - h e l i x t u r n h e l i x ，h h t h ) 结构。 根据含有m y b 结构域的数量，可将m y b 类蛋白分为3 类：( 1 ) 含有 1 个m y b 结构域的m y b 蛋白( r 1 ) ，例如拟南芥中的l h y 、c c a l 和 c p c i 蛋白( a l a b a d ie ta 1 ，2 0 0 1 ) ，玉米中的i b p l 蛋白( l u g e r ta n dw e f t , 山东农业大学硕士学位论文 1 9 9 4 ) ，马铃薯中的m y b s t l 蛋白；( 2 ) 含有2 个m y b 结构域的m y b 蛋白( i 毪r 3 ) ；( 3 ) 以及含有3 个m y b 结构域的m y b 蛋白( r 1 r 2 r 3 ) ， 例如拟南芥中的m y b 3 r 1 和m y b 3 r 4 蛋白( h a g a e ta 1 ，2 0 0 7 ) 。其中数量 最大、功能多样的是含有2 个m y b 区( r 2 r 3 ) 的m y b 蛋白，仅在拟南 芥中就有1 9 8 种之多，估计在其它高等植物中也会有相应的甚至更大数量 的r 2 r 3m y b 转录因子。r 2 r 3m y b 蛋白具有调节植物次生代谢、控制 细胞分化、应答激素刺激和外界环境胁迫等生物学功能( j i na n dm a r t i n ， 1 9 9 9 ) ，表l 是目前已经分离和鉴定的一些调控花青素合成的m y b 基因。 袭l 几种植物中调节花青素生物合成结构基因的m 莒基因 1 2 2m y b 转录因子的功能 人们之所以对m y b 蛋白有浓厚的兴趣，最终还是取决于m y b 蛋白的功 能，m y b 蛋白是植物花青素合成中涉及最为广泛的调节因子。m y b 蛋白 虽然在序列上有一定的保守性，在结构上有一定的相似性，但不同的物种、 不同的个体、甚至同一个体不同的组织器官之间，m y b 蛋白的功能也存在 光诱导苹果果实着色相关基因的克隆和表达分析 着重大差异。与动物相比，植物中存在着更大数量的m y b 蛋白，它们的功 能也更加广泛( a v i l ae ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 玉米的c ，基因所编码的蛋白是m y b 转录因子的一种，并且是第一个克 隆到得调节花青素合成的基因。它能够和r b 基因家族所编码的蛋白协同 作用，对花青素的合成起调控作用( c o n ee ta 1 ，1 9 8 6 ) 。矮牵牛( p e t u n i a h y b r i d a ) a n 2 编码的m y b 蛋白只在花瓣翼部表达，功能上可与玉米的c 1 蛋白互换( q u a t t r o c c h i oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 。尸俄编码的m y b 蛋白在花瓣表皮中 表达，a n 4 编码花粉囊中的m y b 蛋白( w a l k e re ta 1 ，1 9 9 9 ) ，这些m y b 蛋白 均与矮牵牛花的花青素合成相关。 拟南芥中p a p l 基因的异常表达导致拟南芥大多数器官中形成紫色花青 素，a t m y b l 2 是幼苗中类黄酮生物合成的特异激活子，它在花青素合成 途径中可以激活c h s 、c h i 、f 3 h 和f l s 基因的表达( m e h r t e n se ta 1 ，2 0 0 5 ) ； 拟南芥中的g l i 基因也编码一种m y b 蛋白，与毛状体的形成有关：拟南 芥中的另一种m y b 蛋白a t m y b 2 ，在对干旱、低氧和a b a 的应答中起 转录调控的作用( h o e r e ne ta 1 ，1 9 9 8 ) ；a t m y b 6 0 参与植物的耐旱胁迫过 程与高温应答反应( f e n ge ta 1 ，2 0 0 4 ；c o m i n e l l ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 葡萄( 阳t i sv i n i f e r a ) 中的r 2 r 3 m y b 型转录因子v v m y b a l 在果皮中特 异表达，可以诱导葡萄皮花青素的生物合成( j e o n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 。葡萄浆 果中v v m y b p a l 的表达可以诱导v v c h i 和v v f 3 。5 h 等基因表达上调，它的 的激活作用需要b h l h 蛋白协助。花青素合成催化酶基因v v u f g t 的启动子 不受v v m y b p a l 影响，但是此基因可以被v v m y b a 2 高效激活( 增高6 0 0 倍) ，但v v m y b a 2 不激活花青素合成的其他基因( b o g se ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 m d m y b l 是从t a k o s 等( 2 0 0 6 ) 首先从c r i p p s p i n k 苹果果皮中分离到的， 它是一种r 2 r 3m y b 型转录因子。在拟南芥和葡萄培养细胞中，m d m y b l 可以诱导花青素的过量表达。当套袋的果实曝露在阳光下时，m d m y b l 的 表达量增加，果皮中花青素开始合成。红色果皮m d m y b l 的表达量远远高 于未红果皮的表达量。b a n 等( 2 0 0 7 ) 也从苹果果皮中分离得到了m y b 类 转录因子m d m y b a ，其表达具有组织和品种特异性。3 5 s ：m d m y b a 转化 苹果苗子叶的瞬时表达结果显示，子叶上出现了微红色的点状物，同时转 基因烟草中花青素含量增加。m d m y b a 特异结合于花青素合酶( m d a n s ) 1 2 山东农业大学硕士学位论文 的启动子。 此外，还存在抑制花青素合成的m y b 蛋白。草莓的f a m y b l 基因在红 色果实中特异表达，编码短的m y b 蛋白。在烟草中，f a m y b l 的过量表 达会抑制花和雄蕊中花青素和类黄酮的积累，这些组织中花青素合成途径 后期的催化酶基因的表达量和催化酶含量也下降( a h a r o n ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 拟南芥的a t m y b 4 、i c x i 基因也是花青素合成的抑制子( j i ne ta 1 ，2 0 0 0 ； w a d ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 除此之外，在矮牵牛、玉米和金鱼草等植物中研究发现m y b 和b h l h 蛋白可以相互作用共同调节花青素的生物合成，随着w d 4 0 研究的深入， 发现在一些物种中，m y b b h l h w d 4 0 复合体对花青素的合成起重要的 调节作用。拟南芥中册、刀鼍和t t g l 是未成熟种子中类黄酮结构基因 表达所必须的，其中册编码一个i 匕r 3m y b 蛋白，t t 8 和t t g l 分别编 码b h l h 转录因子和w d 4 0 重复蛋白( n e s i e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 1 3 隐花色素对光形态建成和花青素生物合成的影响 植物的生长发育过程受很多外界环境的影响，其中光是重要的环境影响 因素之一。植物在进化过程中为了适应光环境，逐渐形成了一系列光受体 家族。高等植物中主要存在三种光受体，主要包括：( 1 ) 吸收红光远红光 ( 波长为6 6 0 7 3 0 n m ) 的光敏色素( p h y t o c h r o m e ) ；( 2 ) 吸收蓝光和紫外 光( 波长为3 2 0 5 0 0 n m ) 的隐花色素( c r y p t o c h r o m e ) 和向光素( p h o t o t r o p i n ) 。 蓝光影响植物的生长和发育，植物的蓝光反应包括抑制下胚轴伸长、刺 激子叶扩展、调节开花时间、向光性弯曲、气孔开放、引导昼夜节律时钟 和调节基因表达等( l i n ，2 0 0 0 ) 。隐花色素和向光素是目前研究最为广泛的 蓝光受体( b r i g g s ，19 9 9 j2 0 0 2 ) ，隐花色素是一种类光解酶的蓝光受体，广 泛存在于细菌、植物、动物和人体内。 1 3 1 隐花色素 1 9 8 0 年德国科学家k o o m n e e f 等人筛选到了一株拟南芥的光形态建成突 变体b y 4 ，其下胚轴的生长不受蓝光的抑制，1 9 9 3 年美国宾西法尼亚大学 的趾皿a d 和c a s h m o r e 在n a t u r e 上发表文章称从b y 4 突变体中克隆得到了一 种蓝光受体，称为h y 4 ，以后称为c r y l 。1 9 7 7 年g r e s s e l l 仓j 造出c r y p t o c h r o m e 光诱导苹果果实着色相关基因的克隆和表达分析 这个词来描