（分析化学专业论文）壳聚糖修饰电极的研究及其在生物分析中的应用.pdf

摘要 生物高分子壳聚糖是甲壳素脱乙酰化反应产物，具有很好的生物 兼容性、可生物降解性、成膜性和反应性，实际应用广泛。壳聚糖也 常用于固定生物分子，研制酶电极等生物传感器。本学位论文中，对 壳聚糖和酶电极近期研究进展进行了简要的综述，并完成了以下研究 工作。 1 利用壳聚糖对c u 2 + 的配位吸附作用，制得壳聚糖c u 2 + 复合膜修 饰电极，迸一步通过c u 2 + 与蛋白质的配位作用将葡萄糖氧化酶固 定在金电极上制得酶电极。该酶电极检测葡萄糖的线性范围为 o 0 3 2 5m m o ll ，线性相关系数为0 9 9 7 ，检测限为lg m o ll d ( s n = 3 ) 。以电化学石英晶体微天平( e q c m ) 技术监测了各修 饰过程。 2 在氧化条件下使对苯醌和壳聚糖的氨基发生醌胺反应，对壳聚糖 进行改性，并利用改性壳聚糖固定葡萄糖氧化酶，研制了葡萄糖 氧化酶电极。该酶电极检测葡萄糖的线性范围0 0 0 1 - - , 2m m o ll 一， 灵敏度为8 3 7g alm m o l ，线性相关系数为0 9 9 9 。 3 以戊二醛为交联剂，利用壳聚糖中氨基的活泼特性，将多巴胺连 接到壳聚糖分子上，制备了电活性的壳聚糖多巴胺复合材料及 壳聚糖多巴胺碳纳米管复合材料。以f t i r 和u v - v i s 光谱对复 合物进行了表征。复合物修饰a u 电极能观察到邻酚的氧化还原 峰，并能有效催化n a d h 的氧化，过电位可降低5 0 0m v 。修饰 电极对n a d h 的检出限为6 5n m o ll 。 关键词：壳聚糖；葡萄糖氧化酶；c u 2 + ；对苯醌；多巴胺；n a d h ；酶 电极；电分析 n a b s t r a c t b i o p o l y m e rc h i t o s a n ( c s ) i sa p o l y s a c c h a r i d e d e r i v e d b y d e a c e t y l a t i o no fc h i t i n ，w h i c hh a sb e e nw i d e l yu s e di ns c i e n t i f i ca n d i n d u s t r i a lf i e l d sd u et oi t se x c e l l e n t p r o p e r t i e ss u c ha sb i o c o m p a t i b i l i t y ， b i o d e g r a d a b i l i t y ，a b i l i t yt of o r mf i l m s ，a n dh i g hr e a c t i v i t y c si su s u a l l y u s e da sam a t r i xt oi m m o b i l i z eb i o m o l e c u l e st oc o n s t r u c tb i o s e n s o r ss u c h a se n z y m ee l e c t r o d e s i nt h i st h e s i s ，w eh a v eb r i e f l yr e v i e w e dt h er e c e n t r e s e a r c hp r o g r e s sf o rc sa n dr e l e v a n te n z y m e e l e c t r o d e s ，a n dc o n d u c t e d t h ef o l l o w i n gr e s e a r c h e s 1 ac h i t o s a n c u 2 + c o m p o s i t ef i l mm o d i f i e da ue l e c t r o d ew a s p r e p a r e d t h r o u g ht h ec o m p l e x i m e t r i ca d s o r p t i o no fc u 2 + o nc h i t o s a n ，a n d g l u c o s eo x i d a s ew a sf u r t h e rc o m p l e x i m e t r i c a l l ya d s o r b e do nt h e c h i t o s a n c u 孙c o m p o s i t ef i l mt h r o u g hm e t a l p r o t e i nc o m p l e x a t i o nf o r f a b f i c m i n ga ne n z y m ee l e c t r o d e t h eb i o s e n s o re x h i b i t e dal i n e a r r a n g ef r o m0 0 3t o2 5m m o ll f o rg l u c o s es e n s i n g ，w i t hal i n e a r c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to fo 9 9 7a n dad e t e c t i o nl i m i to f1 b m o ll 。1 ( s n = 3 ) v a r i o u sm o d i f i c a t i o np r o c e s s e sf o rt h ee n z y m ee l e c t r o d e w e r em o n i t o r e db yt h ee l e c t r o c h e m i c a lq u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n c e ( e q c m ) t e c h n i q u e 2 c h i t o s a nc r o s s l i n k e d b yp - q u i n o n ew a sp r o p o s e dt o i m m o b i l i z e g l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) t od e v e l o pan e wg o d b a s e dg l u c o s e b kt h eb k e x h i b i t e di n e a r g f r o m0 0 01t o20losensorhe b i o s e n s o re x h i b i t e dal i n e a rr a n g ef r o m00 0 n o ll 。1f o rg l u c o s e 劬w i t h l i n e a rc o e 伍ofmmol t o g l u c o s es e n s l n kw i t hal i n e a rc o r r e l a t i o nc o ec i e n to f r 伍 0 9 9 9 3 c h i t o s a n - d o p a m i n e a n d c h i t o s a n d o p a m i n e m u l t i w a l l e d c a r b o n n a n o t u b e sc o m p o s i t e sw e r ep r e p a r e db yc o v a l e n t l yl i n k i n gt h ea m i n o i l i g r o u p so fd o p a m i n ea n dc h i t o s a nw i t hg l u t a r a l d e h y d e ，w h i c hw a s c h a r a c t e r i z e db yf t i ra n du v - v i ss p e c t r a t h ec o m p o s i t em o d i f i e d a ue l e c t r o d ew i t hw e l l d e f i n e d q u i n o n er e d o xp e a k se f f e c t i v e l y m e d i a t e dt h eo x i d a t i o no fn a d hi np h7 0p h o s p h a t eb u f f e r , w i t ha l l o v e r p o t e n t i a ld e c r e a s eb yc a 5 0 0m v ( v s b a r ea u ) ，al i m i to f d e t e c t i o no f6 5n n l o ll 一 k e y w o r d s ：c h i t o s a n ；g l u c o s eo x i d a s e ；c u 2 + ；p q u i n o n e ；d o p a m i n e ； n a d h ；e n z y m ee l e c t r o d e ；e l e c t r o a n a l y s i s i v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 潮年 茑舀涉、 0 茂 b 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文 本学位论文属于 1 、保密口，杠一一年解密后适用本授权书。 2 、不保密m ( 请在以上相应方框内打“ ) ，号矽 、， 作者签名： 为铈、 日期：w 障占月二日 翩签名：孓湃僻日期：忡6 月3 日 7 2 基于壳聚糖修饰电极的研究及其在生物分析中的应用 第一章绪论弟一早珀t 匕 1 1 壳聚糖 壳聚糖是至今为止发现的唯一天然碱性多糖，无毒性，具有很好 的生物相容性，是自然界中最丰富的多糖之一。壳聚糖是大多数真菌 和一些藻类的一种成分，但主要是存在于无脊椎动物外骨骼中。在我 国资源丰富，产量高，价格低，因此是一种理想的可开发资源。近几 年来壳聚糖及其衍生物的开发和应用是国内外相关科学家研究的热 点之一。 1 1 1 壳聚糖的理化性能 壳聚糖( c h i t o s a n ，c s ) 又名甲壳胺、脱乙酰几丁质等，化学名为 ( 1 ，4 ) 2 氨基2 脱氧b d 葡聚糖，是一种单元环中含有氨基的线性 多糖，经甲壳素( c h i t i n ，c t ) 脱乙酰化反应后制得。甲壳素又名甲 壳质、几丁质、壳多糖、壳素聚、乙酰氨基葡萄糖等，化学名为d ( 1 ，4 ) 2 乙酰氨基2 脱氧d 葡萄糖，也称为n - 乙酰基d 葡搪胺， 是很多节肢动物和软体动物外骨骼的主要成分，广泛存在于节肢动物 类( 蜘蛛类、甲壳类) 的翅膀和外壳中，也存在于真菌和藻类的细胞 壁中【l 】。甲壳素与壳聚糖的单元环结构都和纤维素( c e l l u l o s e ) 很类 似，如图1 1 所示。在壳聚糖分子链上通常含有2 n - 乙酰基葡萄糖和 2 氨基葡萄糖两种结构单元，两者的比例随脱乙酰基反应程度的不同 而不同口1 。一般脱乙酰基程度达到5 5 以上就可称之为壳聚糖。 壳聚糖是具有珍珠光泽的、半透明状的高分子聚合物，其色泽一 般为白色或浅黄色，其分子量因不同的来源和制备方法而存在较大差 异，一般在2 0 1 0 0 万之间。壳聚糖不溶于水、乙醇、丙酮、甲醇以 及乙醚等有机溶剂，能溶于稀酸，如硝酸、盐酸、柠檬酸、醋酸、乳 酸等。这是由于壳聚糖分子中n h 2 基同甲壳素中n h c o c h 3 基相比， 硕士学位论文 活性明显增加，在p h p k a i n s o l u b l e 4 - 2 n 矿 f i g 2 1s t r u c t u r eo fc h i t o s a n ( c s ) a n d i t sp r o t o n a t i o n d e p r o t o n a t i o n 在本文中，我们以h 2 0 2 电还原触发模式在金电极上电沉积 c s 薄膜 7 1 ，通过c s 与c u 2 + 配位作用制得c u 2 + _ c s 复合物修饰电 极，进一步通过c u 2 + 与葡萄糖氧化酶( g o d ) 的配位作用，制得了 g o d c u 2 + - c s a u 电极，并以e q c m 技术监测了各修饰过程。酶电 极用于葡萄糖检测获满意结果。 2 2 实验部分 1 7 硕士学位论文 2 2 1 仪器与试剂 电化学实验采用c h l 6 6 0 电化学工作站( 上海辰华) 和常规三 电极电解池。石英晶体微天平( q c m ) 和e q c m 实验中采用计算机 控制的h p 4 3 9 5 a 阻抗分析仪，自编v i s u a lb a s i c6 0 程序控制仪器 和采集数据 7 , 1 2 9 - 1 3 0 1 。实验采用a t 切9m h z 压电石英晶体( p q c ) ( 直径1 2 5m m ) ，通过7 0 4 硅橡胶固定在一开口玻璃管的前端，金 电极( 直径6 0m m ) 单面触液，触液面为工作电极。参比电极为饱 和甘汞电极( s c e ) ，对电极为碳棒。 g o d ( e c l 1 4 3 ，a s p e r g i l l u sn i g e ，- i i 型，活性1 5 0k ug - 1 ) 购 a m r e s e o 公司( 分装) 。壳聚糖( c s ，脱乙酰度9 0 ) 购自上海 国药集团化学试剂有限公司。葡萄糖购自上海化学试剂站。0 5 壳 聚糖溶液如下配制，将壳聚糖溶于o 1 0t o o ll 以醋酸溶液中，滤去不 溶物，然后用o 1 0m o ll 。1n a o h 溶液调至p h = 5 0 。实验中所用的 磷酸缓冲溶液( p b s ，p h7 o ) 含o 1 0m o ll k 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 + o 1 0 m o ll k 2 s 0 4 ，醋酸缓冲溶液( p h6 8 ) 含o 5 0m o ll 。1h a c - n a a e + o 1 0m o ll k 2 s 0 4 。其他化学试剂均为分析纯，所有溶液均用m i l iq 超纯水配制，实验在室温下进行。 2 2 2 实验步骤 在金电极表面滴3 0 h 2 0 2 和浓h 2 s 0 4 ( 3 ：1 ) 的混合溶液l 滴， 静置1 5 秒，用大量超纯水冲洗，如此反复3 次。然后将电极放在 o 2 0m o ll h c l 0 4 溶液中进行循环伏安扫描( 电位区间0 - - - 1 5vv s s c e ，扫描速度5 0m vs i ) ，直到循环伏安曲线重现为止。取出，超 纯水冲洗，纯氮气吹干备用。 在非搅拌、新配制的3 0m m o ll h 2 0 2 的o 5 壳聚糖( p h5 o ) 溶液中，施加一o 4vv s s c e 恒电位1 0 0s ，壳聚糖可沉积在金电极 基于壳聚糖修饰电极的研究及其在生物分析中的应用 上。取出电极，水洗，自然干燥后得c s a u 电极。该电极置于o 5 0 m o ll h a c n a a c 溶液中，加入2m m o ll 。1 的c u s 0 4 ，e q c m 实 时监测，饱和吸附后取出电极水洗，除去未结合牢固的c u 2 + ，得 c u 2 + - c s a u 。随后，电极置于p h6 8 的0 5 0m o ll d 醋酸缓冲溶液 中，加入2m gm l d 的g o d ，吸附平衡后取出电极，水洗，氮气吹 干，得g o d c u 2 + - c s a u 电极，密封干燥保存于冰箱中( 4 ) 备用。 酶电极的安培检测在搅拌的p b s 溶液中进行，以扣除稳态背景电流 的电流响应为分析信号。 2 3 结果与讨论 2 3 1h 2 0 2 电还原方式触发壳聚糖电沉积 壳聚糖的溶解度强烈依赖于溶液p h ，当p h 小于其p k ( 约为 6 3 ) 时，其氨基质子化，导致c s 以阳离子形式溶解；当p h 接 近或大于p k 时，因其氨基的去质子化而析出( 图2 - 1 ) 。h 2 0 2 电 还原过程消耗质子，使电极表面附近溶液p h 升高，当升高到c s 的陇附近或以上时，可触发壳聚糖在电极上发生均匀可控的电沉 积【6 7 】。在含有3 0m m o ll h 2 0 2 和o 5 c s 的o 1 0m o ll 。1 h a c - n a a c 缓冲溶液q a ( p h - 5 o ) ，施加o 4v v ss c e 恒电位1 0 0s ， 可电沉积c s 膜，成膜过程的电流、频率( 蛳) 和动态电阻( a r l ) 响应曲线如图2 2 所示。随着h 2 0 2 的还原，砺下降且丝l 增加， 一a f o a r l 值约为6 5h zq 1 ( 插图) ，小于粘密度效应的特征值( 1 0 h zf 2 1 ) ，表明所沉积的c s 膜为水凝胶膜，压电响应同时具有质量、 粘密度和应力效应【1 3 0 】，无法从湿频移准确评估膜质量。取出电极， 水洗，去除未结合牢固的c s ，室温干燥，记录电沉积前后空气中干 c s 膜的频率变化，得干频移蛳l - - - 1 2 9k h z ，据s a u e r b r e y 方程计 算的壳聚糖干质量为2 0 5 “g 。因c s 中一个葡糖胺单元( 含1 个氨 1 9 硕士学位论文 基) 的摩尔质量为1 7 4gm o l ，则以c s 葡糖胺单元计的摩尔数为 1 1 8 x l o m o l 。 e 、 - _ c ： 、f 司 4 8 1 2 1 6 2 0 - 2 4 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 0 0 t i m e | s f i g 2 - 2s i m u l t a n e o u sr e s p o n s e so fc u r r e n t ( d ，4 瓜a n d r ld u r i n gp o t e n t i o s t a t i cd e p o s i t i o n ( - o 4 vv s s c e ) o fac h i t o s a nf i l mi n0 5 c ss o l u t i o n + 0 10t o o ll 1a c e t i cb u f f e r ( p h5 0 ) w i t h3 0 m m o ll 1c o e x i s t i n gh 2 0 2 2 3 2c s a u 电极上c u 2 + 的吸附 图2 3 为0 5 0m o ll h a c n a a c + o 1 0m o ll 1k 2 s 0 4 溶液( p h 6 8 ) 中c s a u 电极对c u 2 + 吸附的蛳和欲l 响应。待压电信号 基本稳定后( 较小的信号漂移很可能是c s 的溶胀所致) ，加入2m m o l l 1 的c u s 0 4 ，鲕迅速下降，a r l 同时上升，表明c u 2 + 因与c s 螯 合而被固定在c s 链上。因一a f o a r l 值约为6 5 8 h zq 一，小于粘密 度效应的特征值( 1 0h zq 1 ) ，压电响应同时具有质量和粘密度效应， 难以从湿频移准确评估膜质量。取出电极，水洗，去除未结合牢固的 2 0 基于壳聚搪修饰电极的研究及其在生物分析中的应用 c u 2 + ，室温干燥，记录吸附前后空气中干c u 2 + c s 膜的频率变化，得 干频移a f o d 2 = 1 5 7l ( h z ，据s a u e r b r e y 方程计算的c u 2 + 干质量( 摩 尔数) 为2 4 8g g ( 3 9 1 x 1 0 一m 0 1 ) 。考虑到所沉积c s 中氨基的总摩 尔数为1 1 8 x 1 0 7t o o l ，则c u 2 + 的氨基配位数为3 o l ，表明其氨基配 位数未达到饱和值4 。 n 1 - - 、 9 q t i m e ，s a 、 r 疋 司 f i g 2 - 3s i m u l t a n e o u sr e s p o n s e so f 蛳a n da r ld u r i n gc u 2 + a d s o r p t i o no nt h ec s a ue l e c t r o d ei n as t i r r e d0 5 0m o ll - 1h a c - n a a e + 0 1 0m o il 1k 2 s 0 4b u f f e r ( p h6 8 ) 2m m o ll 1c u s 0 4w 舔 a d d e da tt i m ez e r o 所得c u z + - c s a u 电极在o 5 0m o ll 以醋酸缓冲溶液( p h6 8 ) 中进行电位环扫，结果如图2 4 所示。在约o 2v 附近观察到一对氧 化还原峰，对应于配合物中的c u ：+ c u + 电极过程，扣除背景电流后 ( 见图中虚线) ，得到氧化和还原峰电量分别为1 1 3 和2 8 8 c 。依 法拉第定律计算，得到电活性c u 2 十的摩尔数为1 1 7 x 1 0 母m o l ( 以氧 化峰计) ，因压电法测得的c u 2 + c s 膜中的c u 2 + 摩尔数为3 9 1 x 1 0 8 硕士学位论文 m o l ，故有摩尔分数约为2 9 9 的c u 2 + 因接近或接触基底金电极表 e | v 、l ss c e f i g 2 - 4c y c l i cv o l t a m m o g r a mo ft h ec u 2 + - c s a ue l e c t r o d ei n0 5 0m o ll 1h a c - n a a c + 0 1 0m o l l 。1k 2 s 0 4b u f f e r ( p h6 8 ) s c a nr a t e ：5 0m vs 1 面而具有电活性，而约9 7 的c u 2 + 因处于不导电的c s 链上而不 具有电活性。该电活性c u 2 + _ c s 膜也许可在电催化研究中得到一定 的应用，但我们发现其对h 2 0 2 的电催化氧化或还原并不明显( 图 略) 。 2 3 3 制备g o d c u 2 + - c s a u 电极用于葡萄糖传感检测 利用c u 2 + c s 膜中的c u 2 + 的未饱和氨基配位能力，可以进一步配 位固定g o d 。采用q c m 实时监测了o 5 0m o ll 以h a c - n a a c + 0 1 0 m o l l k 2 s 0 4 溶液( p h6 8 ) 中c u 2 + - c s a u ( 实线) 和c s a u ( 破 折线) 电极上的g o d 吸附过程，如图2 5 所示。在c u 2 + c s a u 电 极上，随g o d 加入，频率显著下降且电阻同时上升，而c s a u 上 的q c m 的响应非常小，表明c u 2 + - c s 膜中的c u 2 + 确实可与 基于壳聚糖修饰电极的研究及其在生物分析中的应用 g o d 配位而固定g o d ，大大提高了酶的负载量。类似地测得g o d 固定前后的干频移为蛳，1 5 3h l l z ，据s a u e r b r e y 方程可计算出， 在c u 2 + - c s a u 电极上固定的g o d 为2 4 2p g ( 1 5 7 x 1 0 j om o l ，以 分子量为1 5 4k d a 计) 。 考察了g o d c u 2 + c s a u 电极对葡萄糖的响应性能。首先优化 了检测电位和溶液p h 。在含o 1m m o l 葡萄糖的o 1 0m o ll 1 k 2 h p 0 4 一k h 2 p 0 4 + 0 1 0t o o ll 。1k 2 s 0 4 水溶液( p h7 o ) 中，在0 3 卸9 vv s s c e 间检测相应电流，在0 7vv s s c e 时达到饱和响应，故实 验中选择该电位为酶电极的检测电位。考察溶液的p h ( 5 o 9 o ) 对g o d c u 2 + - c s a u 电极响应的影响，p h7 0 时响应电流最大，故 选该p h 的磷酸缓冲溶液作为葡萄糖测试溶液。 n i - - 、 - p q t i m e ，s f i g 2 - 5s i m u l t a n e o u sr e s p o n s e so f 蛳a n d 衄ld u r i n gg o da d s o r p t i o no nc u 2 * - c s a u ( s o l i d c u r v e ) a n dc s a u ( d a s hc u r v e ) e l e c t r o d e si ns t i r r e d0 5 0t o o ll 1h a e - n a a c + o 1 0m o ll 1 k 2 s 0 4b u f f e rs o l u t i o n s ( p h6 8 ) 2m gm l - 1g o dw a sa d d e da tt i m ez e r o 图2 - 6 为酶电极在最优实验条件下( o 7vv ss c e ，p h7 0 的0 1 0 t o o ll k 2 h p 0 4 一k h 2 p 0 4 + o 1 0m o l l k 2 s 0 4 水溶液) ，连续加入葡 萄糖时的稳态电流响应。传感器电流响应的线性范围为0 0 3 2 5 硕士学位论文 m m o ll 一，灵敏度为9 5 5 雌lm m o l 一，线性相关系数为0 9 9 7 ，检测 限为l “m o l ( s n = 3 ) 。电极响应时间较短，1 0s 内可达稳态电流的 9 8 。 酶反应满足如下m i c h a e l i s m e n t e n 动力学特征【1 3 1 1 ， f = o c ( 氏+ c ) ，式中k 为最大响应电流，硒为表观米氏常数。 采用s i g m a p l o t s c i e n t i f i cg r a p h i n gs o f t w a r ev e r s i o n2 0 软件的非线 性最小二乘拟合程序，将扣c 实验数据拟合到此方程，得到表观米 氏常数k m = 2 6 7m m o ll 一。与文献值比较 6 7 1 ，该值较小，说明固定酶 与底物的亲和力较强。 c g i u m m o l - l 1 f i g 2 - 6r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es t e a d y s t a t e c u r r e n tr e s p o n s ea tt h eg o d - c u 2 + - c s a u e l e c t r o d ea n dg l u c o s ec o n c e n t r a t i o no b t a i n e di n0 1 0t o o ll 1k 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 + 0 1 0m o ll 1 k 2 s 0 4a q u e o u ss o l u t i o n ( p h7 0 ) i n s e ts h o w st h ec h r o n o a m p e r o m e t r i cr e s p o n s e s p o t e n t i a l a p p l i e d ：0 7v v s s c e 考察了抗坏血酸( a a ) 、尿酸( u a ) 和醋氨酚( a c e t a m i n o p h e n ， a c p ) 的影响。在g o d c u 2 + c s a u 电极上，u a 、a a 和a c p 的干 扰电流响应比较明显。而在电极上覆盖了一层n a t i o n 膜之后 2 4 基于壳聚糖修饰电极的研究及其在生物分析中的应用 ( n a t i o n g o d c u 2 + c s a u ) ，在搅拌的o 1 0m o ll 以p b s 中分别加入 葡萄糖( g l u ) 、从、u a 、a c p 和葡萄糖【1 3 2 1 ，n a t i o n g o d c u 2 + - c s a u 电极在0 7v 恒电位下的电流响应如图2 7 所示，可见干扰电流响 应较小。 f i g 2 7c u r r e n tr e s p o n s e sa tt h en a f i o n g o d - c u 2 + c s a ue l e c t r o d et ot h es e q u e n t i a la d d i t i o n o fg l u c o s e ，a a ，u a ，a c pa n dg l u c o s ei n t op b s p o t e n t i a la p p l i e d ：0 7vv ss c e 考察了传感器的工作和储存稳定性。对lm m o ll 1 葡萄糖，在 最优实验条件下连续测量2 0 次，得到电流响应的相对标准偏差为 5 2 。酶电极在4 冰箱中干态保存，每天取出在1 0m m o ll 。葡 萄糖+ o 1 0m o ll k 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 + o 1 0t o o ll k 2 s 0 4 溶液中测 量，一周内电流响应为其初始响应的9 6 o ，一个月后降为6 9 4 ， 表明所制酶电极具有较好的储存稳定性。 2 4 小结 本文利用c u 2 + 的配位行为，制备了g o d c u 2 + - c s a u 电极， 用于葡萄糖传感检测，结果满意。以e q c m 技术实时监测了c s 电 2 5 硕士学位论文 沉积、c s 膜对c u 2 + 及c u 2 + _ c s 膜对g o d 的配位吸附过程。本工 作对c s 吸附分离金属离子及基于c s 金属离子复合物的酶固定柱 的研制具有一定参考作用。 基于壳聚糖修饰电极的研究及其在生物分析中的应用 第三章醌胺聚合物为固定化酶载体的葡萄糖传感器 3 1 引言 近几十年来，固定化酶技术取得了很大的发展。固定化酶不但被 广泛应用于食品、医药、精细化工等部门，在临床医学、化学分析、 污水处理以及有机合成等领域，固定化酶的应用也越来越普遍。固定 化酶载体的微观结构和表面性质对吸附法固定酶的结果具有关键作 用。载体表面适当孔径的孔穴分布以及亲、疏水性基团和官能团的有 序分布，可以使酶或其它的生物分子通过氢键、疏水键和盐键等作用 力与载体结合，达到理想的固定化效果。 溶胶凝胶材料是一类非常适合于固定生物分子的基质材料，具 有一些诱人的特性【1 3 3 。3 6 1 ：本身具有化学惰性和透光性，低的溶涨性 和良好的机械稳定性，其孔径大小可调节的孔结构有利于生物分子的 包埋且不易泄露，同时小分子和生物识别分子可以自由穿梭于溶胶一 凝胶材料孔道。因此在酶的固定中，它具有两大优势：一是可以吸附 大量的水，利于保持酶分子的活性，使活性中心长期稳定【1 3 孔1 3 8 1 ；二 是可以在室温下制备【1 3 矧。壳聚糖具有许多优良的特性而被材料研 究者所青睐，同时它是一种天然的聚合物，有很好的生物兼容性，因 此被用于固定酶的研究。在固定酶的文献报道中，更多的是以戊二醛 为交联剂，但戊二醛对生物分子有一定的破坏【1 4 l 】。因此选择一种新 的交联剂尤为重要。在本实验中，我们以对苯醌为交联剂，将线形的 壳聚糖分子交联为网格状结构，同时化学交联壳聚糖( c l c s ) 还呈 现凝胶状，因此我们利用壳聚糖链上的氨基与对苯醌之间的反应生成 网状结构的醌胺聚合物，并以此醌胺聚合物为载体用于固定酶的研 究，得到了良好的效果。 3 2 实验部分 硕士学位论文 3 2 1 仪器与试剂 所有的电化学实验都是由c h l 6 6 0 电化学工作站( c hi n s t r u m e n t c o ，u s a ) 来完成的，采用常规三电极电解池。实验采用a t 切9mh z 压电石英晶体( p q c ) ( 直径1 2 5 m m ) 。p q c 金电极的一面( 直径 6 0 m m ) 与溶液接触，为工作电极，另一面密封在空气中。饱和k c i 甘汞电极( s c e ) 为参比电极，文中所有的电位都以此参比电极为对 照，对电极为自制的碳棒。 葡萄糖氧化酶( g o d ，e c l 1 4 3 ；型号i i a s p e r g i l l u sn i g e r ，活性 3 0 0 ，0 0 0ug - 1 ) 购自a m r e s c o 公司。壳聚糖( c s ，脱乙酰度9 0 ) 购自上海国药集团化学试剂有限公司。葡萄糖购自上海化学试剂站。 对苯醌( b q ) 购自国药集团化学试剂有限公司。0 2 5 壳聚糖溶液 如下配制：将壳聚糖溶于o 1 0t o o ll d 醋酸溶液中，滤去不溶物，然 后用0 1 0t o o ll dn a o h 溶液将p h 值调节到5 0 。实验中所用的缓冲 溶液为o 1 0t o o ll d 磷酸缓冲溶液。其他化学试剂均为分析纯，所有 溶液均用m i l io 超纯水配制。所有实验均在室温下进行( 2 5 2 c ) 。 3 2 2c l c s p t 复合物的合成 c l c s p t 复合物的合成步骤如下：在搅拌的情况下向6m l0 2 5 的壳聚糖溶液中加入0 3 8 8m l3 8 6 2m m o ll 1 的h 2 p t c l 6 溶液，并 且持续搅拌3 0r a i n 左右，然后快速搅拌下，向溶液中滴加k b i - h 溶 液，使h e p t c l 6 还原为金属铂粒子，然后向溶液中加入对苯醌，同时 加入氧化剂。混合物搅拌lh ，得到c l c s p t 复合物的溶液。 3 2 3 修饰电极的制备 在金电极表面滴3 0 h 2 0 2 和浓h ：s 0 4 ( v ：v = 3 ：1 ) 的混合溶液 l 滴，静置1 5 秒，用大量超纯水冲洗，如此反复3 次。然后将电极 放在o 2 0t o o ll h c l 0 4 溶液中进行循环伏安扫描( 电位区间0 - 一1 5 基于壳聚糖修饰电极的研究及其在生物分析中的应用 v v s s c e ，扫描速度5 0m vs 以) ，直到循环伏安曲线重现为止。取出， 超纯水冲洗，纯氮气吹干备用。 取c l c s p t 复合物的溶液4 0 此，加入5m gm l 。1 葡萄糖氧化 酶，搅拌并放置3 0m i n 左右，然后取l o 此酶的c l c s p t 复合物 溶液，分两次滴加在处理过的电极表面，室温下干燥，并保存在4 的冰箱中以备后用。 酶电极的安培检测在搅拌的p b s 溶液中进行，以扣除稳态背景 电流的电流响应为分析信号。 3 3 结果与讨论 3 3 1c l c s 的表征 胺和醌的反应在氧化条件下自发进行，反应式见式l 和式2 t 1 4 2 1 。 首先醌和胺反应生成单取代氢醌( i ) ，单取代氢醌( i ) 被苯醌氧 化成单取代苯醌( i i ) 后，再与胺反应生成二取代氢醌( i i i ) ，由于 苯环上引入了给电子基团从而降低了取代氢醌的氧化还原电位，苯醌 可作为氧化剂将( i i i ) 氧化成二取代苯醌( i v ) 。同时我们对生成的 聚合物做了红外光谱和紫外光谱表征。 3 3 1 1 红外表征 对照壳聚糖，苯醌及其c l c s 的红外图可以看出，在壳聚糖的 红外图中，3 4 0 0c m 1 左右的宽峰是o h 的伸缩振动吸收峰与n h 的伸缩振动吸收峰重叠而成的多重吸收峰，也就是对应于残糖基上的 羟基和氨基。1 5 9 9c m 1 存在的是- n h 2 吸收谱带。c 6 o h 是一级羟 基，在1 0 1 3c m 1 有特征吸收峰。c 3 o h 是二级羟基，在1 1 2 0c m 1 有特征吸收峰。而在c l c s 中，3 4 0 0c m 1 左右的峰变的更宽，这是 由于醌胺反应中生成的n - h 产生的伸缩振动吸收峰而使峰变宽， 1 5 9 9c m 1 存在的是n h 2 吸收谱带也减小，由这些峰的变化说明对 2 9 硕士学位论文 苯醌和壳聚糖反应生成了交联壳聚糖。 洲申一蹦 i i + h 2 n - r 一删 式2 i l l 0 ，f i g 3 - 1t h em e c h a n i s mf o rt h ef o r m a t i o no f c l c s 3 3 1 2 紫外表征 比较壳聚糖、对苯醌和c l c s 的紫外吸收光谱可以看到，壳聚糖 的吸收峰在2 8 2n n l 和2 3 3n n l ，对苯醌的吸收峰在31 9n m 和4 3 2n n l ， 而两者反应的聚合物其紫外吸收峰为3 3 2n l n 和4 3 4n m ，分别红移 了1 3n m 和2n m ，这是由于氨基连接到苯环上共轭引起的，这说明 对苯醌与壳聚糖反应生成了醌胺聚合物。 3 3 2c l c s p t 修饰电极 图3 4 为几种不同的方法所制备的电极在o 1 0m o ll 。k 2 i - i p 0 4 蛳p 0 4 + o 1 0m o ll k 2 s 0 4 水溶液( p h7 o ) 中扫描的循环伏安图， 由图中可以看出c l c s 和p t 粒子的共同作用下，c l c s p t - g o d a u 3 0 基于壳聚糖修饰电极的研究及其在生物分析中的应用 4 0 0 03 0 0 02 0 1 0 0 0 w a v e n u m b e r s c m 1 f i g 3 - 2i rs p e c t r ao f p - q u i n o n e0 3 q ) ，c h i t o s a n ( c s ) a n dc l c s d 九，n m f i g3 - 3t h eu vs p e c t r ao f p - q u i n o n e ( b q ) ，c h i t o s a n ( c s ) a n dc l c si n0 it o o l l 1a c e t i c b u f f e r ( p h5 0 ) 电极对h 2 0 2 具有最大的催化氧化作用。同时c s p t g o d a u 电极 3 l 硕士学位论文 的催化氧化效果好于c l c s g o d a u 电极，而c l c s p t - g o d a u 电 极作用大于c s p t - g o d a u 电极和c l c s g o d a u 电极之和，说明 c l c s 和p t 粒子的作用具有协同效应，可能是由于c l c s 在固定 了更多的酶，同时i i t 粒子的加入又增加了c l c s 修饰膜的电子传 导性。 f i g3 - 4t h ec y c l i cv o l t a m m o g r a m so f t h ee l e c t r o d ei no 1 0t o o ll 1k 2 h p 0 4 一k h 2 p 0 4 + 0 1 0 m o ll 1k 2 s 0 4a q u e o u ss o l u t i o n ( p h7 o ) a ts c a nr a t eo f5 0m vs ，0 im m o ll 1h 2 0 2w a s a d d e d 3 3 3 葡萄糖在c l c s p t - 葡萄糖氧化酶电极上的响应曲线 图3 5 为几种不同的方法制备的酶电极在最优实验条件下( o 7v v ss c e ，p h7 0 的o 1 0m o ll k 2 h p 0 4 一k h 2 p 0 4 + o 1 0m o ll qk 2 8 0 4 水溶液) 连续加入葡萄糖时的稳态电流响应。酶电极的电流响应随着 葡萄糖浓度的增加而增加。图中( a ) 代表c l c s p t g o d a u 电极 的电流响应曲线，该传感器电流响应的线性范围为0 0 0 1 - - 4m m o ll 一， 灵敏度为2 6 3 9 衅lm m o l ，线性相关系数为0 9 9 7 ，检测限为o 5 l x m o l ( s n = 3 ) 。电极响应时间较短，5s 内可达稳态电流