（分析化学专业论文）某些蛋白质及辅酶（nadh）的电催化研究.pdf

中国科技大学博士论文( 北京) 中文摘要 中文摘要 、对蛋白质、酶( 辅酶) 、神经递质等生物物质进行电化学研究是当前电化学和 电分析化学领域中的前沿课题之一。由于绝大多数重要的生物物质在常规的【司体 电极上的电子传递非常缓慢，并且其本身或反应产物还易在电极表面吸附而引起 电极表面的钝化或失活，故必须借助于电子传递媒介体来加快它们在电极表面的 y 电子传递，以实现生物物质的性能研究和分析检测。据此，j 本论文研究了媒介体 修饰电极对蛋白质( 血红蛋白，肌红蛋白，细胞色素c ) 的电催化还原和对辅酶 n a d h 的电催化氧化。即构筑了对血红蛋白有良好催化作用的聚天青( d 玻碳修饰 电极：对血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素c 均具有良好响应的大黄酸修饰电极； 同时构筑了对辅酶i ( n a d f 0 催化氧化的芦丁、咖啡酸、阿魏酸修饰玻碳电极。这 些工作为制作它们的电化学传感器奠定了基础。 ， 叫论文分二大部分。第一部分：蛋白质在化学修饰电极上的电催化还原；第二部 分：n a d h 在化学修饰电极上的电催化氧化。其主要内容报告如下： 1 对某些蛋白质( h b 、m b 、c c y t ) 及辅酶i ( n a d h ) 的研究进展作了近期评 述。 2 ，将天青( i ) 作为电子传递媒介体聚合于玻碳电极表面所制成的修饰电极在 o 2 5m o l lh 2 s 0 4 溶液中于+ 0 8 0 8 v 电位范围内出现3 个峰，其中峰1 ，3 是 一对氧化还原峰。该修饰电极对血红蛋白具有良好的催化还原作用，催化峰电 流与血红蛋白浓度在7 5 x1 0 6 - 9 0 x1 0 4 m o l l 范围内呈线性关系，对3 0 x 1 0 4 m o l l 血红蛋白连续测定1 0 次，其相对标准偏差为o 5 4 ，结果令人满意。文 中对电催化过程作了一些探讨。 3 将大黄酸通过电沉积的方式修饰于玻碳电极表面所制成的修饰电极放入0 0 6 m o l lh 2 s 0 4 溶液中呈现一对氧化还原峰。还原峰电位随着p h 的增加而负移， 在p h3 0 - 5 0 0 之间时，还原峰电位随p h 线性变化关系的斜率为一6 7m v p h 。 该修饰电极对血红蛋白的还原具有良好的催化作用，催化电流与浓度在6 0 x 1 0 屯l _ 3xl 矿m o l l 范围内呈线性关系，对1 0 x1o - 7m o l lh b 连续测定六次， 中国科技大学博士论文( 北京) 生塞塑塞 相对标准偏差为3 5 ，结果令人满意。文中还对大黄酸的修饰机制进行了一 些探讨。 4 研究了在0 3 0m 0 1 ，i h 2 s 0 4 溶液中大黄酸修饰电极对肌红蛋白( m b ) 的艟化 作用，催化电流与肌红蛋白( m b ) 浓度在1 5 1 0 7 1 3 x 1 0 缶m o l l 范围内呈 线性关系，检测限为1 o 1 0 7m o l l ，对5 0 1 o _ 7m o l lm b 连续测定八次其 相对标准偏差为4 8 。实验表明：在肌红蛋白( m b ) 存在的条件下，电圾过 程是由吸附控制的。 5 在0 1 0 m o l lh 2 s 0 4 溶液中研究了大黄酸修饰电极对细胞色素c 的催化作用， 催化电流与细胞色素c 浓度在4 0 1 0 - 4 0 i 矿m o l l 范围内呈线性关系，能 进行电化学研究与检测。实验表明：在细胞色素c 存在的条件下，其电极过程 是由吸附控制的。 6 将芦丁修饰到玻碳电极表面上所制成的修饰电极在o 1 0m o l l 磷酸缓冲溶液 中( p h7 o ) 于o + o 5 0v 电位范围内出现一对氧化还原峰。其式量电位( f ) 为+ o 3 0 5 v ，d 随p h 增加而朝负方向移动，在p h5 6 0 9 范围内e i 随p h 线性 变化关系的斜率为一5 6 9 5m v p h 。算出表观电极反应速率常数) 为4 4 s 一。电 极反应的电子转移数为2 且伴随着2 个质子参与。该修饰电极对n a d h 的氧 化具有很好的催化作用，其过电位降低了2 7 6m v 。n a d h 浓度在o 1 5 0 m m o l 几范围内与峰电流呈现良好的线性关系。测得其催化速率参数为9 2 3 1 0 3 m 。f 1 。 7 将咖啡酸通过电沉积的方式键合到玻碳电极表面上而制成的修饰电极在0 1 0 m o l 磷酸缓冲溶液中( p h7 o ) 于o 啦+ o 5 0v ( o s a g a g c l ) 电位范围内呈现 一对氧化还原峰。其式量电位( ) 为+ o 2 5 0 v ( o s a g a g c l ) ，随p h 增加 而朝负方向移动，实验表明：在d h5 o 8 0 范围内的线性方程为 e 旬6 2 3 3 - 0 0 5 9 9 6p h r = 0 9 9 6 9 。表观电极反应速率常数( k 。) 为1 2 3 s 。电极反 应的电子转移数为2 且有2 个质子参与。该修饰电极对n a d h 氧化具有很好 的催化作用，其过电位降低了3 1 6 m v 。峰电流与n a d h 浓度在o 1 - - 6 0 m m o l l 范围内呈现良好的线性关系，能进行电化学研究与检测。文中还对电催化过程 作了一些探讨。 中国科技大学博士论文( 北京) 中文摘要 8 将阿魏酸通过聚合的方式修饰到到电极表面，修饰电极在0 1 0m o l l 磷酸缓冲 溶液中( p h 6 6 0 ) 于1 o 5 0v ( u s a g a g c i ) 电位范围内呈现一对氧化还原峰， 其式量电位为+ o 1 8 8v ( u s a g a g c i ) 。其式量电位啪p h 增加而朝负方向移动， p h 在4 5 0 8 3 8 范围内萁线性方程为掣；o 5 2 5 7 - 0 0 5 1 5p h , r = 0 9 9 5 1 。电子转移 系数为0 4 9 6 , 表观电极反应速率常数陇) 为6 6s 。电极反应的电子数为i 且有1 个质子参与。该修饰电极对n a d h 氧化具有很好的催化作用，其过电位降低了 3 8 1m v 。n a d h 浓度在0 0 1 5 0 m m o l l 范围内与峰电流呈现良好的线性关系。 、 通过电化学方法测得催化速率常数为6 8 2 x1 0 3 m - 1 s 一。厂 关键词：、幺蛋白，赢左蛋白，细胞色素c ，天青田，大黄酸，嘌呤二 j 核苷酸，芦丁，咖啡酸，阿魏酸，玻碳电极，化学修饰电极，电聚合，遁沉积， 咆催化，测定 中国科技大学博士论文( 北京) 英文摘要 a b s t r a c t t h ep h d t h e s i si n c l u d e st w o p a r t s ( 8c h a p t e r s ) o n t h es t u d i e so f c h e m i c a l l ym o d i f i e de l e c t r o d e s a n dt h e i re l e c t r o c a t a l y t i cb e h a v i o r s ，o n ei s e l e c t r o c a t a l y s i sa c t i v i t yt o w a r d ss o m ep r o t e i nr e d u c t i o na tc h e m i c a lm o d i f i e d e l e c t r o d e s ；a n o t h e r i s e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yt o w a r dn a d ho x i d a t i o n a t c h e m i c a lm o d i f i e de l e c t r o d e s t h ec o n t e n t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h er e v i e ww a sp r e s e n t e do nt h ep r o g r e s si ns o m ep r o t e i ns t u d y i n ga t c h e m i c a lm o d i f ye l e c t r o d e ，a n o t h e rw a sp r e s e n to nt h ee l e c t r o c a t a l y s i s t o w a r d sn a d ho x i d a t i o na tc h e m i c a lm o d i f ye l e c t r o d e s 2 t h ec m e ，w h i c ha z u r e i w a sp o l y m e r i z a t e do ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e i np b sb y c y c l i cv o l t a m m e t r ye x h i b i t st h r e ep e a k so v e r t h ep o t e n t i a lr a n g e o f + 0 8 - 一0 8 v ( v s a g a g c i ) p e a k l a n dp e a k3i sa c o u p l eo f r e d o x p e a k t h e p o l y ( a z u r e i ) f i l m s h o w sag o o d e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t y t o w a r d s h e m o g l o b i ni n o 2 5m o l lh 2 s 0 4s o l u t i o n t h el i n e a rr a n g eb e t w e e n c o n c e n t r a t i o na n dc u r r e n ti s7 5 x l o - 6 _ 9 0 x 1 0 4m o l l t h em e c h a n i s mo f e l c t r o c a t a l y s i st o w a r d s h br e d u c t i o nh a sb e e ns t u d i e d 3 t h ec m e ，w h i c hr h e i nw a sd e p o s i t e do ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d eb y c y c l i cv o l t a m m e t r ye x h i b i t sap a i ro f r e d o x p e a k si no 0 6m o l lh 2 s 0 4 i t s f o r m a lp o t e n t i a lw a s - 0 18 4 va ts c a nr a t eo f5 0m v s t h ec a t h o d i cp e a k p o t e n t i a ls h i f t sl i n e a r l yi nt h en e g a t i v ed i r e c t i o nw i t hi n c r e a s i n gs o l u t i o n p h w i t has l o p eo f6 7m v p e rp h u n i t t h er h e i nm o d i f i e de l e c t r o d es h o w s e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t y f o rh e m o g l o b i nr e d u c t i o ni no 0 6m o l lh 2 s 0 4 s o l u t i o n t h ee l e c t r o c a t a l y t i cc u r r e n t sa r ep r o p o r t i o n a lt oc o n c e n t r a t i o n so f h e m o g l o b i ni n t h er a n g eo f6 0 x 1 0 8t o1 3 1 0 一m o l l t h ed e t e c t i o nl i m i t i s1 0 xl0 一m o l la to p t i m a lc o n d i t i o n t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o ni s 3 5 f o r6s u c c e s s i v ed e t e r m i n a t i o no f1 0 xl0 m o l lh b t h em e c h a n i s m o ft h ee l e c t r o d er e a c t i o nh a sb e e nd i s c u s s e di nt h i sp a p e r 4 t h er h e i nm o d i f i e de l e c t r o d es h o w s e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t y f o rm b r e d u c t i o ni n0 3 0m o l lh 2 8 0 4s o l u t i o n t h ep e a kc u r r e n t sa r ep r o p o r t i o n a l t oc o n c e n t r a t i o n so fm bi nt h er a n g eo f1 5 0 x 1 0 t o1 3 x 1 0 m o l l t h e d e t e c t i o nl i m i ti s1 0 x10 m o l la to p t i m a lc o n d i t i o n t h er e l a t i v es t a n d a r d 4 中国科技大学博士论文( 北京) 英文摘要 d e v i a t i o ni s4 8 f o r8s u c c e s s i v ed e t e r m i n a t i o no f5 o x10 m o l lm b i n t h ep r e s e n c eo fm b ，t h ee l e c t r o d er e a c t i o nw a sc o n t r o l l e d b ya b s o r p t i o n 5 t h er h e i nm o d i f i e de l e c t r o d es h o w s e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t y f o r c y t o c h r o m ecr e d u c t i o ni n0 10 m o l lh 2 8 0 4s o l u t i o n t h ee l e c t r o c a t a l y t i c c u r r e n t sa r e p r o p o r t i o n a lt oc o n c e n t r a t i o n so fc y t o c h r o m e ci nt h er a n g eo f 4 0 x 1 0 “t o4 0 x 1 0 。m o l l i nt h ep r e s e n c eo f c y t o c h r o m ec t h ee l e c t r o d e r e a c t i o nw a sc o n t r o l l e db y a b s o r p t i o n 6 t h ec m e ，w h i c hr u t i nw a s d e p o s i t e do ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d eb yc y c l i c v o l t a m m e t r ye x h i b i t sap a i ro fr e d o xp e a k si np h7 o p b s t h em o d i f i e d e l e c t r o d eg i v e sar e l a t i v er e v e r s i b l er e d o xp e a ki n0 1 0m o l lp h7 0p b s o v e rt h ep o t e n t i a lr a n g ef o n no 0t oo 5 v ( d s a g a g c i ) ，w h i c ht h ef o r m a l p o t e n t i a l i s o 3 0 5 v ( u s a g a g c i ) t h ef o r m a lp o t e n t i a ls h i f t sl i n e a r l y i n t h en e g a t i v ed i r e c t i o nw i t hi n c r e a s i n gs o l u t i o np hw i t has l o p eo f5 6 9 5 m v p e rp h u n i ti nt h ep h r a n g eo f5 0 - 7 9 t h ea p p a r e n te l e c t r o nt r a n s f e r r a t ec o n s t a n t ( k s ) w a s4 4s t h ee l e c t r o d er e a c t i o nc o n t a i n st w oe l e c t r o n s a n dt w op r o t o n s t h et u r i nm o d i f i e de l e c t r o d es h o w s e l e c t r o c a t a l y t i c a c t i v i t yi n o 10m o l lp h o s p h a t eb u f f e r s o l u t i o n ，w i t had i m i n u t i o no ft h e o v e r p o t e n t i a l o f2 7 0m vc o m p a r e dt ot h e p r o c e s s a t a nu n m o d i f i e d e l e c t r o d e t h ee l e c t r o c a t a l y t i cc u r r e n t sw e r e p r o p o r t i o n a lt oc o n c e n t r a t i o n s o ft h en a d hi nt h e r a n g eo f0 1 - 5 0m m o l l t h e h e t e r o g e n e o u sr a t e c o n s t a n tf o ro x i d m i o no fn a d ha tt h er u t i nm o d i f i e de l e c t r o d es u r f a c ew a s a l s od e t e r m i n e da n d f o u n d t ob ea b o n t9 0 1 0 3 m - l s 7 t h ec m e ，w h i c hc a f f e i ca c i dw a sd e p o s i t e do ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e b yc y c l i cv o l t a m m e t r y e x h i b i t sa p a i ro f r e d o x p e a k s i np h 7 0p b so v e rt h e p o t e n t i a lr a n g ef o r m0 0t oo 5 v ( u s a g a g c i ) ，w h i c ht h ef o r m a lp o t e n t i a l i s o 2 5 0 v ( u s a g a g c i ) t h e f o r m a l p o t e n t i a l s h i f t s n e g a t i v e l y a s p h v a l u e si n c r e a s e do v e rt h er a n g eo f5 0t o8 0 t h el i n e a rr e g r e s s i o ne q u a t i o n i s e 0 = o 6 2 3 3 0 0 5 9 9 6 p h ，r = 0 9 9 6 9 t h ea p p a r e n t e l e c t r o nt r a n s f e rr a t e c o n s t a n t ( k s ) w a s1 2 3 s ，t h ee l e c t r o d er e a c t i o nc o n t a i nt w oe l e c t r o n sa n d t w o p r o t o n s t h ec a f f e i ca c i dm o d i f i e de l e c t r o d es h o w se l e e t r o c a t a l y t i c a c t i v i t y f o ro x i d a t i o no fn a d hi n0 im o l lp h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n ， w i l had i m i n u t i o no ft h eo v e r p o t e n t i a lo f310m v c o m p a r e d t ot h ep r o c e s s 中国科技大学博士论文( 北京) 英文摘要 a ta nu n m o d i f i e de l e c t r o d e t h ee l e c t r o c a t a l y t i cc u r r e n t sw e r ep r o p o r t i o n a lt o c o n c e n t r a t i o n so ft h en a d hi nt h er a n g eo fo 1 - 6 0 mm o l l t h em e c h a n i s m o fe l e c t r o d er e a c t i o nh a sb e e nd i s c u s s e di nt h i sp a p e r 8 t h ec m e ，w h i c hf e r u l i ca c i dw a s p o l y m e r i z a t e d o ng l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e b yc v i na na c e t a t eb u f f e rs o l u t i o ng i v e saq u a s i r e v e r s i b l er e d o xp e a k si n 0 10m o l l p h6 6 0 p b so v e rt h e p o t e n t i a lr a n g e f r o m 一0 1t o 0 5 v ( u s a g a g c i ) i t sf o r m a lp o t e n t i a li s018 8 v ( d s a g a g c i ) t h ef o r m a lp o t e n t i a l s h i f t si nn e g a t i v ed i r e c t i o na si n c r e a s ep hv a l u e sf r o m4 6 0t o8 3 8 t h el i n e a r r e g r e s s i o ne q u a t i o ni se 0 = o 5 2 5 7 0 0 5 15p h r = 0 9 9 51 t h ee l e c t r o d er e a c t i o n c o n t a i n so n ee l e c t r o na n do n e p r o t o n t h e m o d i f i e de l e c t r o d es h o w s e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yf o ro x i d a t i o no f n a d hi n0 10m o l lp h o s p h a t eb u f f e r s o l u t i o n ，w i t ha no v e r p o t e n t i a lo f3 8lm vw h i c hi sl o w e rt h a nt h a ta tt h eb a r e e l e c t r o d e t h e a p p a r e n t e l e c t r o nt r a n s f e rr a t ec o n s t a n t ( k s ) a n dt r a n s f e r c o e f f i c i e n tf o re l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nt h ee l e c t r o d es u r f a c ea n di m m o b i t i z e d p o l y ( f e r u l i ca c i d ) w e r e c a l c u l a t e da s6 6s “a n do 4 9 6 ，r e s p e c t i v e l y , t h e e l e c t r o d er e a c t i o nc o n t a i n so n ee l e c t r o na n do n ep r o t o n t h ee l e c t r o c a t a l y t i c c u r r e n t sw e r ep r o p o r t i o n a lt oc o n c e n t r a t i o n so ft h en a d hi nt h er a n g eo f o 01 - 5 0m m o l l f i n a l l yt h eh e t e r o g e n e o u sr a t e c o n s t a n tf o ro x i d a t i o no f n a d ha tt h e p o l y ( f e r u l i ca c i d ) m o d i f i e d e l e c t r o d es u r f a c ew a sa l s o d e t e r m i n e da n df o u n dt ob ea b o u t68 2 1 0 3m 一1 s k e yw o r d s ：h b ，m b ，c c y t ，n a d h ，r h e i n ，r u t i n ，a z u r e i ，c a f f e i ca c i d ， f e r u l i c a e i d ，g l a s s y c a r b o n e l e c t r o d e ，c m e ，e l e c t r o p o l y m e r i z a t i o n ，e l e c t r o d e p o s i t i o n ，e l e c t r o c a t a l y s i s ，d e t e r m i n a t i o n 6 厂l 中国科技大学博士论文( 北京) 第一章绪论 第一章绪论 近年来，随着生命科学与化学科学的相互交叉和渗透，对生命活动起着重要 作用的物质蛋白质及辅酶的研究也同益增多，已成为电分析化学的热门研究 领域之一。蛋白质的电化学研究已有间接和直接电化学两方面的工作，对辅酶 ( n 删) 的研究仅局限于媒介体的工作。下面对这一领域的研究工作作一简要 评述，内容包括以下几个部分： 一 蛋白质的直接电化学研究概述 二 蛋白质的间接电化学研究概述 三n a d h 电催化研究概述 四本文研究的背景和目的 第节蛋白质的直接电化学研究概述 1 1 引言 生命过程的实质离不开电子传递。无论是能量转换，还是神经传导；无论是 光合作用还是呼吸过程；甚至是生命的起源、大脑的思维、基因的传递，都与电 子传递密切有关。研究生命过程实质上就是研究生物体中的电子传递过程，因此 生命科学的发展向电化学和电分析化学提出了新的挑战，并促进了生物电化学、 生物电分析化学、生物电子学等奴学科的发展。一切生命过程都是建立在存关 生物大分子的结构、运动及其相互作用的基础上的。所以，涉及到生命科学基本 内容的生物大分子的研究，具有重大的理论和实际意义。 蛋白质是一种信息大分子，切生命过程中都起着关键性的作用。生物体的 绝大部分化学反应都是在活性蛋白艮酶的催化下进行的，目前已知的酶没有 一个不是蛋白质，所以研究蛋白质的电化学和电子转移过程对于揭示生命过程的 本质有着十分重要的意义。这种蛋白质的电化学和电子转移在某种程度上类似与 生物体内蛋白质与生物膜之间的电子转移过程。例如血红蛋白是脊椎动物红细胞 内的呼吸蛋白，是血液中分子氧的载体，它的辅基血红素的铁原子能与氧分子可 逆的结合。一分子的血红蛋白含有四个亚基，每个亚基可以结合一分子氧，l 司此 每个血红蛋白可运输四分予氧。血红蛋白的电活性中心被四条肽链包围，较难接 近表面又由于血红蛋白在电极表面发生强烈吸附而引起电极表面钝化，因此它在 一般电极上的电子转移很慢，得不至4 有效的电流响应。 氧化还原蛋白质堤指那些在生命体内可以发生电子传移的蛋白质，研究在电 极上的直接哇酢匕学，对于研究理解和认识他们在生命体内的电子转移机理和生理 作用具有重要意义。但迄今为止，只观察到几个少数氧化还原蛋白质可在裸固体 电极e 表现出电化学活性f l j 。这主要是由于多数蛋白质的电活性基团被埋在其多 肽链的内部与电极表面距离较远，很难与电极表面直接交换电子：蛋白质在电极 表面的取向往往不利于其电活性基团与电极之间的电子交换。某些杂质在电极表 面上的吸附或蛋白质本身的吸附变性可能阻碍它们与电极间的直接电子转移。为 此，蛋白质的电化学研究常常不得不借助于某些具有电化学活性的媒介体 ( m e d i a t o r ) 或促进剂( p r o m o 来加速蛋白质在电极上的电子传递反应。媒介体 本身是一种电活性物质，通过其自身在电极表面的电化学反应，可催化蛋白质的 氧化还原反应，从而间接研究蛋白质的电子传递过程。促进剂的特点是在所在研 究的电位范围内不发生任何电化学反应，它是通过改善蛋白质与电极间的界面相 容性等，使蛋白质不发生变性吸附，从而加速蛋白质与电极的直接电子传递。1 9 7 7 年，h i l l 等冈将4 ，47 联吡啶加入细胞色素c ( c y t , c ) 的溶液中，在金电极上得到了准 可逆的循环伏安图。4 ，47 联毗啶是一种促进剂，它本身在所研究的电位范围内是 非电活性的。促进剂作用下蛋白质的电化学反应也被称为直接电化学，而媒介体 作用下的蛋白质的电化学反应则称为间接电化学。因此，依靠采用促进剂来修饰 电极表面，蛋白质的直接电化学研究取得了很大进展。 在蛋白质电子转移的研究领域内，直接电子转移的研究具有独特的魅力。首 先，从创新的角度而言，电极材料与蛋白质的结合产生具有特定功用的生物传感 器或实现生物电催化是期望中的目标；其次，可以从此研究中获取蛋白质内在的 热力学和动力学特征的重要信息：再次，由于直接电化学的实现必须建立在克服 了界面特异性、相容f 生及蛋自失活等问题的基础上，因此在此i 嘏中可更多地了 解并控制蛋白质膜界面动力学过程，这对于生物电化学研究及蛋白质组的研究与 分析等科学命题都具有重要意义。 由于蛋白质分子结构复杂，氧化还原活性中心往往深埋于封闭或绝缘的肽链 中，因而最初人们普遍认为氧化还原蛋白质与电极之间发生直接可逆或准可逆的 电子传递是不可能的。但自从1 9 7 7 年由k u w a n a , e d d o w e s 或h i l l 等人分别实现 了细胞色素在掺杂的二氧化锡和静电计上的准可逆的直接电化学响应后，多种氧 化还原蛋白质的直接电化学得到了广泛的研究。因此，蛋白质的直接电化学已被 认为无论是在修饰电极或普通电极表面都是可能实现的了。 i 2 实现蛋白质直接电化学的方法瑚 电活性物质与电极之间的电子传递受到多种因数的影响。对于蛋白质与电极之 间的传递机理，通常以删甜_ v o l m 髓理论和m a r c u s 理论进行解释。从实验结果 出发，在探讨蛋白质界面电子转移特性的过程中，人们发现m 眦燃理论模型比 b u t l e r - v o l m e r 理论对于蛋白质与电极间电子转移的解释更加接近实际情况【4 】。蛋 白质的电子传递常数与相关参数存在如下关系p j ： k = 1 0 1 3 一e - “2 ”。 暇：电子传递速率；b ：对于给定的氧化还原体系为常数：d ：电子供体与受 体之间的距离，即电子隧道距离；g ：驱动能；九：m a r c u s 重组能。) 理论计算和实验证明，d 的最大允许值约为1 7 ，大于此值，电子传递速率慢至无 法观测。对于大多数蛋白质而言，由于电化学活性中心深埋于非导电性的肽链结 构中，电子隧道距离相当大，因而电子转移速率常数非常小，在通常条件下，难 以观察到蛋白质与电极之间的直接电子转移。要实现一些缺乏天然的长程电 子通道的蛋白质的直接电化学氧化还原反应，需要采取一些特定方法一达到以下 目的：( 1 ) 使蛋白质的活性中心尽可能接近电极表面：( 2 ) 蛋白质适当变形但未 失活( 3 ) 电极表面与蛋白质充分接触( 4 ) 通过修饰电极打开电子转移通道。到 目前为止，常用的方法有使用电子转移促进剂、吸附成膜、自组装法生成单层膜 以及涂饰法形成堆积双层膜等方法，以下就分别展开讨论。 1 2 1 使用电子转移促进剂 事实上，最早的关于蛋白质的直接电化学的报道正是以4 ，4 联毗啶为促进 剂实现了细胞色素c 与金电极之间的电子转移。此后，众多研究者对不同类型的 促进剂对于蛋白质与电极之间的电子传递的促进作用作了广泛的深入的研究。综 合看来，促进剂大致可分为以下四类旧： 1 金属阳离子和络离子。这类促进剂一般对于小分子蛋白质如细胞色素c 、 b 5 的直接电化学有良好的促进作用f 7 j 。通常是通过静电相互作用，带负电荷的蛋 白质分子充分接近经过修饰的带负电的电极表面，阳离子在中间起到了电子桥作 用。阳离子所带电荷是决定其促进作用大小的关键。典型的例子是k 十无促进作用。 而镁离子和o ( n h 3 ) 6 猿现出较强的促进能力。研究表明，通常不与碳氧基团配 为连接，而m g 等阳离子可与血红素丙酸基等负电荷基团配位作用，从而对血红 j 0 素结构产生细微的局部扰动，结果是增加了蛋白质辅基的正电荷密度，使得其还 原态稳定性增加。y 3 夕t - s a m l u i 等人也观察到促进作用下亚硫酸盐还原酶在热解 石墨电极上的良好伏安相应。 【2 】含有双功能团结构x y 的有机小分子化合物，x 是能吸附于金电极表面的 活性功能团。如h s 一、r s 、r s s 、3 - t h i o p h e n y l 、其它含硫基团、p r 、3 , 4 - p y r i d y l 及r 2 n - 等；y 是阴离子或碱性基团，可以是蛳d y l 2 ，b , - c o o h , - s o s h ， p 0 3 h 2 , o h 等。基团常可吸附于清洁的金电极表面，它的吸附能力的强弱可影响 促进作用的稳定性。而基团的作用在于能使蛋白质在电极表面弱吸附，从而增加 电极表面蛋白质的浓度和电子转移速率。 除了联吡啶及其类似结构的化合物外，含巯基的各类化合物被证明对于蛋白质 的直接电化学行为是很有效的促进剂。氨基酸作为此类促进剂的一种，对于细胞 色素在金电极上的直接电化学行为的影响，由z h u 锄g ! 研等人作了对照研究。他们 发现半胱氨酸、色氨酸、蛋氨酸、组氨酸等均对q tc 与电极之间的电子转移起 到了有效的促进作用，另一端则可与蛋白质分子的氨基酸残基通过静电相互作用 或氢键作用有利于蛋白质分子定向排列于电极表面，从而为电子转移打开通道。 3 氨基类化合物：主要为新霉素、链霉素和庆大霉素等。a r m s t r o n g 等人以庆 大霉索和新霉索为促进剂，实现了细胞色素c 过氧化物酶( c c p ) 在石墨电极电 极上的直接电子转移和对于过氧化氢的直接电催化还原i q 。而阳离子如m 尹 q ( n h 3 ) ，对此体系无促进作用。文中认为，氨基苷类化合物对于细胞色素c 过 氧化物酶的直接电化学其促进作用的原因与阳离子存在时简单的静电作用不同， 庆大霉素和新霉素在口h7 4 的实验条件下分别带有川5 和“的电荷，其所带 正电荷分布于它们结构中个分离的i n l l 3 + 基团上，于是沿着分子结构有一展开的 带正电荷区域，从而能有效地诱导电极表面的c u d 基团与蛋白质分子间的相互作 用，使相互间直接交换电子成为可能。 4 其它促进剂：除了以上几类促进剂，对于蛋白质电化学还有肉桂酸1 9 】、吸附 原子( s 、加、b j 、c u 、a g 、h g 、s n 、s b 、s e 、t e ) 【1 4 ，1 1 1 ”、杂多钨酸【1 2 】、 聚5 掘基吲哚卿等报导。 1 2 3 自组装单层膜固定蛋白质 巯基化合物在金或其它金属表面自发形成自组装( s a 咖已发展成为分析化 学的前沿课题。巯基通过化学吸附与金属表面形成s - m 键，而伸向溶 瘦的有机 链则形成有序排列的单分子层结构，类 以于生物组织中磷脂双层膜的碳氢链，为 蛋白质的固定和定向排布提供了温和、稳定的环境，并且能保持蛋白质的生物活 性。因此，这种排列有序的单分子有机膜对于蛋白质的固定以及界面电子转移机 理的研究是非常有用的。 以- c o o h 为尾基的烷基硫醇( h s ( c h 2 ) n - c o o h ) 可在金电极上形成对细胞 色素 c y tq 具有良好固定作用的单层膜，当烷基链长度吐碣时，c y tc 在此电极 上的标准电子转移速率常数与n 成指数关系减小，而所得到的隧道衰减因子 ( b = 1 o - 1 1 c h ：) 与其它小分子在同样电极上所得到的结果一致。通常修饰有 h s ( c h 2 ) n c 0 叫自组装单层膜的金电极表面带负电，因而蛋白质的带正电的氨基 酸残基可与电极表面伸向溶液的负电基团发生静电相互作用；另种方式是通过 交联剂如碳二亚胺将蛋白质分子与自组装单层膜化学键合从而固定蛋白质。用此 方法得到的细胞色素c 氧化酶单层膜可于金电极间发生快速电子传递，并且酶仍 保持有对低物c y tc 的催化活性。 r u s i n g 小组以3 巯基，1 。丙磺酸作为修饰剂构成自组装单层膜修饰的金电 极，在此基础上，金电极再交替修饰蛋白质与聚离子化合物，由此得到了聚离子 多层膜中的肌红蛋白、细胞色素p 4 5 0 和细菌光合成的反应中心蛋白质的直接电 化学。 以- o h 为尾基的烷基硫醇( h s ( c h 2 ) n - c o o h ) 是另类用于研究蛋白质在 电极表面直接电子转移的促进剂。当烷基链较短时，在自组装单层膜电极上能观 察到细胞色素的准可逆循环伏安峰，而当链较长时，电极被致密的自组装膜绝缘， 以至于无法观察到蛋白质与电极之间的直接电子传递。b o w d e n 等首次比较研究 了h s ( c h 2 ) n - c o o h 与h s ( c h 2 ) n - o h 两类硫醇对于细胞色素的电化学行为的不 同影响。在h s ( c h 2 ) r l - - c o o h h s ( c h 2 ) n _ 0 虹混合自组装单层膜修饰的金电极 上，对于细胞色素的电子转移速率大大提高。原因可能是：在单层的c o o h 自 组装膜上，由于疏水作用不足和缺乏相应的电子通道，细胞色素难以以最佳方位 定向排布在单层膜上，原子力显微镜研究表明，c o o h 自组装膜较以甲基结尾 的自组装膜缺乏适宜的界面分子排布和灵活性。而在混合自组装单层膜中，一 c o o h 基团密度较小，而亚甲基基团的增加使得膜呈现出不规则状态，表现出更 强的疏水性和更大的自由度。晟终电极表面变得适合以良好的电子和状态连接蛋 白质，从而是从分子水平直接探测活性中心电子转移成为可能。 不同蛋白质固定在巯基化合物自组装膜修饰金电极上的电化学参数如下 表1 - 1 巯基化合物自组装膜修饰电极上蛋白质的直接电化学特性 修饰剂蛋白质