实验动物技术.ppt

第十二章转基因动物培育技术 一 概况二 转基因动物的原理和方法三 转基因动物的应用 第十二章转基因动物培育技术 一 概况二 转基因动物的原理和方法三 转基因动物的应用 第十二章实验动物技术 第一节实验动物胚胎工程的基本内容 一 超数排卵 Superovulation 1 几种常用于超数排卵的激素2 超数排卵 Superovulation 在实验动物中的应用二 胚胎培养 EmbryoCUlture 三 胚胎保存 Embryopreservation 四 胚胎移植 Embryotransfer 五 胚胎分割 Embryosplit 六 体外受精 InVitrofertilization 七 显微受精 Microfenilization 又称辅助受精 Assistedfertilization 八 细胞核移植 Nucleartransplantation 九 卵的激活与孤雌发育 Ocyteactivationandparthenogeneticdevelopment 十 胚胎干细胞 Embryonicstemcell 简称ES细胞 第二节实验动物冷冻胚胎库的建立 一 器材和试剂1 器材 1 液氮罐 2 生物冷冻仪 3 解剖显微镜 冰箱 CO2培养箱 渗透压测定仪 4 手术器械 注射器 针头 玻璃表面皿 玻璃细管 胚胎管 0 25m1 或安瓿等 5 针头过滤器 0 22um和0 45um孔径的滤膜 2 试剂药品3 溶液配制4 操作程序 1 超数排卵 2 采集胚胎 3 挑选胚胎 4 胚胎冻存 5 资料 6 入库的各品种品系胚胎 必须分2份以上 放存在不同罐内和不同地方 7 当需要使用胚胎和检测胚胎时 取出机动胚胎管 按冻存方法条件 采用相应的解冻方法解冻 复苏 8 每个品种品系冻存胚胎数量 第三节试管动物的培育 一 试管小鼠的培育 一 器材和试剂药品1 器材设备2 试剂药品 二 溶液配制 三 方法步骤1 小鼠精子采集与获能2 小鼠卵子获取3 体外受精 4 受精卵培养5 胚胎移植二 试管兔的培育 一 几种溶液的配制1 培养液成份2 PBS液3 TCM 199液配制4 DM DefinedMedium 二 精液采集和获能1 采集精液2 精子获能 三 供体母兔超排 四 受体母兔同步发情 五 供体母兔注射HCG 六 体外受精 七 受精卵培养 八 胚胎移植三 试管猕猴的培育 一 溶液配制 二 超排 三 采卵 四 采精与精子获能1 电刺激采精器2 用直肠探子法的采精技术 第十二章转基因动物培育技术 一 概况二 转基因动物的原理和方法三 转基因动物的应用 第十二章转基因动物培育技术 一 概况二 转基因动物的原理和方法三 转基因动物的应用 第四节转基因动物培育技术 一 概况二 转基因动物的原理和方法三 转基因动物的应用 一 概况 一 概况 一 转基因动物 定义是利用基因工程和胚胎工程技术 改变动物遗传性状的新方法 是将外源基因导入动物的受精卵 再将受精卵植入到代孕动物的输卵管或子宫中培育的动物 定义采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞 然后将细胞导入动物子宫 使之发育成个体 转基因 被导入的目的基因转基因动物 transgenicanimal 目的基因的受体动物 目录 激素转基因鼠 硕鼠 右边为同胞鼠对照 核转移技术即动物整体克隆技术 将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内 使之发育成个体 即克隆 clone 基因剔除技术也称基因靶向 genetargeting 灭活 有目的去除动物体内某种基因的技术 转基因动物 transgenicanimals 是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物 整合到动物染色体基因组的外源基因被称为转基因 transgene 转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术 它涉及外源基因的组建 载体 受体 基因导入技术 供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面 二 克隆动物 克隆动物技术主要包括三个步骤 1 制备成熟的卵细胞2 细胞核移植 将供体细胞的细胞核与去核的卵细胞融合成一个杂合细胞3 将 核质融合 的卵细胞移植到借腹怀孕动物的子宫发育直到出生 2 研究现状 转基因动物自1980 1981年产生后 迅速发展 现已广泛应用于医药 农业及生物学领域 在医学领域己用于遗传病 肿瘤 心血管疾病 免疫性疾病的研究 包括建立疾病的病理模型 探讨其病因 发病机理和基因治疗方法 研究基因表达调控以及进行药物干预和新药的开发实验等 建立疾病的转基因动物模型是转基因动物技术应用于医学方面的一个重要研究内容 在农业方面 转基因农业动物研究有了很大进展 尤其在通过胚胎细胞或体细胞将基因导人牛 猪 羊和山羊 产生可遗传的转基因牲畜方面发展很快 说明转基因牲畜不仅可作为生物反应器 为人类生产基因工程产品和用于牲畜品种改良 提供更好的服务 同时也促进了胚胎学和发育遗传学的飞速发展 并开拓了医学研究的新领 人类培育出的第一只转基因猴 安迪 于2000年10月2日在美国出生 美国密苏里大学最近通过克隆技术培育出四只含有荧光水母基因的小猪 左为荧光小猪 右为正常小猪 2003年11月21日 美国得克萨斯的一家公司宣布 经过转基因技术他们已经研制出能发荧光的小型热带鱼 荧光鱼 转基因的小鸡 2004年6月30日由中国军事医学科学院主持 山东农业大学 莱阳农学院等单位共同参与首批28只带有t PA组织型纤溶酶原激活剂的转基因羊 在山东省东营市天翼公司陆续降生 t PA是目前治疗急性心肌梗塞最好的溶血栓药物 二 转基因动物培育的原理和方法 一 基本原理 1 借助分子生物学和胚胎工程的技术 将外源目的基因在体外扩增和加工 再导入动物的早期胚胎细胞中 使其整合到染色体上 当胚胎被移植到代孕动物的输卵管或子宫中后 发育成携带有外源基因的转基因动物 2 关键技术 1 外源目的基因的制备 2 外源目的基因的有效导入 3 胚胎培养与移植 4 外源目的基因表达的检测 1 重组DNA技术 RecombinantDNATechnology 是在体外按人们的意愿将不同的DNA分子重组的技术 二 外源目的基因的制备 1 基因工程基本概念 是指利用重组DNA技术将目的基因和载体重组 再导入受体细胞内进行扩增和表达的过程 2 基因工程 geneticengineering 是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体 基因工程相当于目的基因的无性繁殖过程 也称其为基因克隆 genecloning 3 克隆 clone 2 基因工程操作中常用的工具 1 工具酶 限制性内切酶T DNA连接酶大肠杆菌DNA聚合酶 逆转录酶T4多核苷酸激酶硷性磷酸酶末端脱氧核苷酸转移酶 限制性内切酶 restrictionendonuclease 定义 是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基序列的核酸水解酶 分类 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统 限制外源DNA 保护自身DNA 命名 第一个字母代表细菌的属名 用大写 第二 三个字母是该细菌的种名 用小写 第四个字母代表株 用罗马数字表示发现的先后次序 型限制酶识别序列特点 回文结构 GAATTC CTTAAG 切口 黏性切口和平端切口 EcoR Hpa GAATTC GTTAAC CTTAAG CAATTG G CTTAA黏端切口平端切口 AATTC G GTT CAA AAC TTG 2 载体 定义 是携带目的DNA片段进入受体细胞进行扩增和表达的工具 常用载体 细菌质粒噬菌体黏粒病毒腺病毒 腺病毒相关病毒 痘病毒逆转录病毒 猴空泡病毒 质粒 plasmid 特点能在宿主细胞内独立复制 带有某些遗传信息 会赋予宿主细胞一些遗传性状 pUC19质粒的物理图谱 头部 尾 尾部纤维 蛋白衣壳 噬菌体 bacteriophage phage 3 基因工程的操作过程 化学合成法要求 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 基因组DNA 基因组DNA文库 genomicDNAlibrary cDNAcDNA文库 cDNAlibrary 聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 1 目的基因的获得 1 同源黏性末端连接方式 同一限制酶切割位点连接配伍末端连接2 平端连接适用于 限制性内切酶产生的平端切割黏性末端或切平形成的平端3 定向连接适用于 两种不同的黏性末端一个黏端 一个平端 2 目的基因与载体的连接 目的基因与载体的各种连接方式 受体菌的条件 安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态 导入方式 转化 transformation 转染 transfection 转导 transduction 3 重组体导入受体细胞 直接选择法 抗药性标记选择插入失活法标志补救 互补分子杂交法原位杂交Southern印迹 非直接选择法 免疫学方法如免疫化学方法酶免检测法 4 基因工程菌的筛选 平皿上的单菌落 复印硝酸纤维膜 溶菌DNA变性固定杂交 菌落原位杂交 继续培养 原核表达体系大肠杆菌标准 选择标志强启动子SD序列多接头克隆位点 不足 不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体很难表达大量可溶性蛋白 5 外源基因的表达 真核表达体系优点 重组质粒转染的细胞具有遗传的稳定性和可重复性 哺乳动物细胞能对外源基因转录的hnRNA剪切加工成成熟的mRNA 对表达的蛋白质能进行转录后的加工如糖基化 可将表达产物分泌到培养基中方便下游的提纯 缺点 操作技术难费时不经济 四 基因转移和基因剔除技术在医学中的应用 建立动物模型 单基因决定疾病模型基因剔除获得性突变 gain of functionmutation 多基因决定疾病模型 三 胚胎培养与移植方法 基因显微注射法逆转录病毒感染法胚胎干细胞介导法精子载体导入法 基因显微注射法 1 目的基因的制备和纯化 来源 人工合成 逆转录 PCR等扩增 通过载体方式或者PCR进行 常选用质粒做载体纯化 限制性内切酶 2 小鼠的准备 小鼠的有关要求 3 超排卵与取卵孕马血清促性腺激素 PMSG 42 48h人绒毛膜促性腺激素 HCG 10 13h 4 基因显微注射 5 受精卵移植 单细胞至桑椹胚阶段移植到输卵管 囊胚期则移植到子宫 6 目的基因的检测 7 建系 显微注射仪 纳米显微注射仪 转基因仪 DNA显微注射的转基因过程的总效率 逆转录病毒感染法 1 病毒载体的构建 提取病毒环状DNA克隆到载体中切除病毒编码区目的基因导入转染细胞 2 包装细胞 3 感染早期胚胎 取出8细胞胚胎去除透明带与包装细胞共培养转入假孕母鼠的子宫内产出小鼠 通过病毒载体导入ES细胞建立转基因小鼠的技术路线 胚胎干细胞介导法 1 分离培养ES细胞 2 ES细胞基因操作 3 获取囊胚期胚胎 4 将ES细胞注射到囊胚期胚胎的囊胚腔内 5 将胚胎移植到假孕母鼠子宫内 精子载体导入法 利用精子作为载体 将外源基因导入精子 共育法 电穿孔 脂质体等 借助受精作用把外源基因导入受精卵 整合到受精卵的基因组中 该法简单 方便 免去对原核的损伤 可用于多种动物特别是大动物 非常实用 但这一技术还处于完善阶段 主要步骤如下 1 外源目的基因导入精子 2 精子与卵子结合 3 将受精卵移植到假孕母鼠子宫内 电穿孔法和脂质转染法 一 电穿孔法的原理很简单 在直流电场作用的瞬间 细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道 即电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性 达到将DNA导入细胞的目的 电穿孔的时间只有几秒钟 而且DNA片段不需要特殊的纯化操作 二 脂质转染法 用人工合成的阳离子类脂与外源DNA结合 借助类脂容易穿越脂膜的特性将DNA导入 三转基因动物的应用 1 研究基因结构和功能及其表达和调控 2 建立人类疾病动物模型 例如 乙型肝炎表面抗原转基因动物模型 将人乙型肝炎表面抗原 HBsAg 基因导入小鼠 可获得HBsAg转基因导入小鼠 而且该转基因小鼠的肝中可以产生HBsAg 这种转基因小鼠既可以模拟患者的带毒状态 又不导致发病 这种转基因小鼠模型可用来研究免疫应答耐受与肝细胞损伤的关系 探讨发病机制 持续带毒状态及其清除 药物筛选试验 HBVDNA在宿主内的复制 表达及调控与乙型肝炎发病的关系等有关HBV病理学和治疗学方面的难题 3 研究人类疾病基因治疗可以通过基因枪注射治疗基因进入皮肤或皮下肿瘤细胞治疗肿瘤 转入胰岛基因可以治疗糖尿病 4 研制生物反映器 生产天然活性药物蛋白 2004年6月30日由中国军事医学科学院主持 山东农业大学 莱阳农学院等单位共同参与首批28只带有t PA组织型纤溶酶原激活剂的转基因羊 t PA是目前治疗急性心肌梗塞最好的溶血栓药物 5 扩大移植供体来源 2000年3月 英国著名国际生物技术公司PPf宣布 他们已用猪的成年体细胞通过两步核移植技术 创造出一窝共5只小猪 并对它们的基因组DNA进行微卫星分析 发现其中三只小猪属于同一细胞系 另外两只小猪属于另一细胞系 该公司准备使用这些小猪作为患者的供体 6 改良动物品种 羊奶能代替打针吃药 2003年12月美国俄亥俄州夸克生物科技公司报告创造出了一种不含胆固醇的小鼠 应用创造医学研究需要的动物模型改良动物品质培育动物新品种 课堂练习 1 什么叫转基因动物 2 根据目的基因导入的方法与对象不同 培育转基因的主要方法有 显微基因注射法逆转录病毒感染法胚胎干细胞介导精子载体导入 3 基因显微注射法的基本步骤4 转基因动物的应用 基因敲除的原理和方法 2 1 利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的 80年代初 胚胎干细胞 ES细胞 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础 1985年 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础 到1987年 Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 1 直到现在 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法 2 1 1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤 图1 a 基因载体的构建 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到