蜂胶专业论文汇总.pdf

蜂胶与保健 南昌同心紫巢生物工程有限公司 电话 0791 5297571 网址 1 目录 蜂胶的研究进展 1 超临界 CO2流体萃取的蜂胶可排除铅的存在 P3 5 2 超临界 CO2流体萃取蜂胶工艺的优点 P6 7 3 蜂胶黄酮类化合物超临界萃取工艺研究 P8 15 4 梯度升温法对超临界 CO2萃取蜂胶的影响 P16 18 5 响应面法优化蜂胶超临界 CO2萃取工艺的研究 P19 25 蜂胶与疾病 1 蜂胶超临界 CO2萃取物抑菌作用 P26 32 2 蜂胶的安全性 急性毒性试验 P33 37 3 蜂胶的保健功能及应用进展 P38 45 4 蜂胶的药理作用和临床应用 P46 50 5 蜂胶功效成分研究进展 P51 55 6 蜂胶降糖效果观察 P56 58 7 蜂胶降血脂作用的实验研究 P59 60 8 蜂胶抗癌机理研究进展 P61 69 9 蜂胶在糖尿病综合治疗中的作用 P70 72 2 超临界 CO2流体萃取的蜂胶 可排除铅的存在 上海东绿科技有限公司 201101 吴家森 摘要 利用超临界 CO2流体萃取工艺 CO2气体在超临界状态下 不溶解重金属 铅 达到了除铅效果 关键词 蜂胶 重金属 铅 蜂胶中铅的存在 一直是国内外关注的一个问题 曾因出口蜂胶原料由于重 金属特别是铅含量的超标 引起过贸易纠纷 国内外市场供应的蜂胶产品 也有 因处理不当 含铅量过多 造成消费者中毒的事件 蜂胶作为保健食品 正被越来越多的消费者所接受和青睐 但蜂胶中可能含 有重金属铅 却对消费者的健康构成潜在威胁 蜂胶受到铅污染的因素很多 有采集蜂胶的器具污染 生态环境污染和蜜蜂 采集蜂胶不良习性造成的污染 蜜蜂有采集油漆和沥青的习性 从而使油漆和沥 青中的铅污染蜂胶 为削弱或消除蜂胶的铅污染 一是从蜂胶原料提取过程中就不使铅出现在蜂 胶中 一是在提取出蜂胶后 再除去含在蜂胶中的铅 前一种工艺一直是人们的 企盼 后一种方法是当前蜂胶生产者普遍采用的方式 用乙醇提取的蜂胶 必须 在后期进行除铅处理才能食用 因为铅是一种多亲和性毒物 在体内具有蓄积性 不易排出体外 铅对各组 织都有毒性作用 主要损害神经系统 造血系统 消化系统和肾脏 同时还损害 人体免疫系统 使人体抵抗力下降 我国食品卫生法规定 大多数食品中的含铅量不得超过 1mg kg 而蜂胶每 1 千克原料中的含铅量能高达几十毫克 所以不经过严格处理的蜂胶是不能食用 的 目前一些商贩向消费者出售未经除铅提纯的蜂胶液 更有让消费者自行用白 酒或食用酒精浸泡蜂胶原块后食用 这种行为都是非常有害和危险的 中国农业 科学院蜜蜂研究所徐明和陈黎红曾用蜂胶原块样品 A B 为黄褐色 C D 为 青褐色 进行了蜂胶在不同溶剂中的溶出比较 充分证实了铅的存在 3 蜂胶各溶出组中铅占蜂胶总铅含量的比例 超临界 CO2 流体萃取蜂胶 是一种理想的蜂胶提取工艺 也是一种人们企 盼在提取蜂胶同时可以排铅的先进工艺 因为 CO2 气体在特定压力和温度下形成的超临界流体 它能大量地将蜂胶 原块中的蜂胶溶解出来 而对重金属一概不予溶解 为此得到的蜂胶十分纯净 几乎不含重金属 不用担心蜂胶中的含铅量 也不必再增加排铅工序 我们曾做 过二种试验测试 1 样品 超临界蜂胶和紫苏籽油胶囊 配比 蜂胶 16 紫苏籽油 84 验测单位 上海市预防医学研究院 2 样品 超临界蜂胶 配比 100 验测单位 上海市预防医学研究院 4 由表可见 超临界 CO2 流体工艺萃取的蜂胶无论是纯蜂胶或制成的胶囊 均可放心食用 经多次测试结果证明 铅含量仅为国家卫生食品允许含量的十分 之一以下 结论 超临界 CO2 流体萃取蜂胶工艺 也包含了排除铅的工序 为蜂胶的 应用创造了一个有利条件 本文摘自 养蜂科技 2002 年第 3 期 5 超临界 CO2流体萃取蜂胶工艺的优点 摘要 超临界 CO2流体萃取蜂胶工艺 萃取得到的蜂胶有着很多优点 如色泽为 鲜明的黄色 芳香 减少过敏物质等七个优点 鲜明的黄色意味三个优点 用超临界提取的蜂胶 呈洁净鲜明的黄色 如果用其他方法提取出来的是带 黑色的褐色 自然而然会认为蜂胶是褐色物 我也曾那么想过 但一经看到超临 界提取出来的蜂胶是鲜明的黄色 就会推翻是褐色的原有想法而产生蜂胶原来是 什么颜色呀这样的疑问 一般的蜂胶所以会呈现出所带的黑色 这是由于是能溶 于酒精的黑色焦油状态的物质的性质所致 这是多酚的一种咖啡酸聚合物 这种 聚合体对生理活性关系并不怎么大 但入口时会感到有难以入口的味道 这是用 酒精提取的蜂胶难服的一个原因 在口中会有麻木感 而超临界提取的蜂胶就没 有那种不舒服的感觉 这是第一个优点 咖啡酸的诱导体也是过敏原因的物质 在超临界提取的蜂胶里 不含有这种物质因此我们不必担心会发生过敏症 这是 优点之一 这就称之为第二个优点吧 这黄色恐怕是黄酮类吧 黄酮类具有酒精 可溶性 这黄酮类即使是小量 我们推测也会 有极强的发色力 用作溶媒的二 氧化碳的特征是能够提出很多的脂溶成分 因此我们就可用这脂溶物来获取有强 抗癌作用的萜烯类化合物 在超临界提取的蜂胶中含有大量的萜烯化合物 这种 物质 对预防和治疗癌有良效 这是第三个优点 第四个优点 不担心溶媒的残留 超临界提取的蜂胶就是在提取时完全不让溶媒残留下来 用任何溶媒 在提 取物中总会残留着溶媒 这是企业的共识 是最大的难点 从中药的生药中提取 其精华的 溶媒残留是非常大的问题 成为大家议论的对象 提取中药精华所使 用的媒体是甲醇 甲醇会使人中毒 是对身体有害的东西 虽说这残存量极少 可以置之不问 但这是一个不能放手的问题 在超临界提取的蜂胶里 关于溶 6 媒残留方面 一切都不成问题 第五个优点 用低温提取不会破坏有效成份 超临界提取蜂胶的第五个优点 是提取时所用的温度是用近于室温那样的低 温 用作溶媒的二氧化碳的临界温度是 31 度 不会破坏非耐热的酵素等 在使 用水 液体和气体 时 就要用高温 这样就会消失掉酵素的活性 所谓提取温度 低 是指沸点非常低的香味 是可以原封不动地提出香的成分 因为所有香的成 分是脂溶性的 是可以完全溶解于二氧化碳的 如用超临界提取法以外的方法 其溶解溶媒的香味就会散失掉 如用水提取就会溶于水中而失去 因此超临界提 取法是提取全部香味的最好方法 超临界提出的蜂胶非常香 给人一种惊奇 蜂 胶原来是这种香味 好香呀 这芳香还有生理活性 最近的芳香疗法 嗅了香 味能得到精神上安定 能得到应激反应等就是这个道理 第六个优点是不会使提出的成分氧化 优点之一是能在无氧的状态下提取 如在提取高度不饱和脂肪酸或含有很多 多酚化合物的时候一遇氧气 它们的活性就会支离破碎 无氧提取通常是一种很 难的技术 而用超临界提取法是解决问题的一张王牌 提取的时候 如果进入的 氧会有什么样的不良影响呢 我就这一点谈一下 首先 在有氧状态下提取含有 黄酮类的多酚化合物 就会成为氧化的无活性的聚合体 颜色也会着上假色 有 氧状态下 即是室温 也会氧化 稍微一加热 氧化就会加深 被氧化的物质就 会失去黄酮类的活性 可以说黄酮类的作用是没有了 还有蜂胶里的不饱和脂肪 酸虽然很少 但还是存在的 氧一接触它不饱和脂肪酸就会产生过氧化炭脂化合 物 这是活性氧的一种 明显带有毒性 第七个优点能有选择地提取成分 这种超临界提取法 不是没有有待解决的问题 因为如必需加高温和高压 这样就需要生产那些适应耐高温 高压的容器 目前生产用的容器的容量还有限 制 对大量生产还不能适应 现在生产成本虽高一些 今后如能进一步改善 就 会成为非常实用的技术 本文摘自 养蜂科技 2001 年第 6 期 7 蜂胶黄酮类化合物超临界萃取工艺研究 高荫榆 游海 陈芩 何小立 陈才水 南昌大学生命科学与食品学院 摘要 通过单因素实验和正交实验研究 超临界流体萃取蜂胶黄酮类化合物的 工艺进行了优化设计 试验结果表明 影响萃取得率的各因素强烈程度顺序是 萃取压力 乙醇浓度 固液比 萃取温度 最佳萃取实验工艺条件为 萃取压力 25MPa 乙醇浓度 95 固液比 6 1 萃取温度为 500C 萃取时间为 4h 流体 流速为 35kg h 而且黄酮类化合物得率较高 萃取物纯净 色泽金黄 纯度高 关键词 超临界 CO2 萃取 夹带剂 蜂胶 黄酮类化合物 蜂胶以其独特的医疗和保健功效 成为各国科学家研究的热点 目前国内外 普遍采用是一直沿用至今的酒精提取蜂胶原胶的传统工艺 该工艺优于水浸提蜂 胶液的制作方式 但也存在着色泽 质量和生产周期长等问题 超临界 CO2 流体 技术提取蜂胶的有效成分的研究正处于探索和攻坚阶段 利用超临界 CO2 流体萃 取蜂胶黄酮类化合物具有很多优点 色泽淡黄 无溶剂残留 安全健康 杂质少 重金属含量低 工艺流程简单等 然而采用超临界流体萃取技术 提取物是一种 脂溶性并且难溶于酒精 黄酮类化合物含量低 呈胶状的具有抗应变性活性的 物质 在实验条件下 提取物中黄酮类化合物的含量大致是同一原料乙醇提取的 1 5 以下 因此只能说明单纯的超临界流体萃取技术适合提取色调 香味及食味 方面的食品或加工食品用的材料 正是由于黄酮类化合物 内酯和多糖 蛋白质 以及鞣质等物质在超临界流体 CO2 中的溶解度极低 需要在高压力下才能被溶 解 因此对于在超临界流体中溶解度很小的溶质 需要在超临界流体系统中加入 少量的夹带剂来改变超临界流体系统的相行为 以达到大大增大其溶解度的目 的 鉴于乙醇无毒 在 SFE 中溶解度大 便于用 SFE 分离等特点选取乙醇作为首 选的夹带剂 虽然夹带剂给超临界流体萃取技术带来好处 但在萃取质中混杂的 8 夹带剂的分离和存在于残渣中的夹带剂的回收会增加一些设备和能耗 因此研究 夹带剂用量多少及其浓度对萃取效果的影响是十分重要的 本文将进行含夹带剂 的超临界流体萃取技术萃取蜂胶中黄酮类化合物的工艺研究 以期达到萃取温度 不高 有机溶剂少 时间短 蜂胶黄酮生理活性保存高的目的 1 实验材料和实验方案 1 1 设备和试剂 实验设备 HA121 50 01 超临界 CO2 萃取装置试剂 无水乙醇 AR 南昌洪 都试剂厂 安徽特酒总厂 蜂胶 江西养蜂研究所提供 1 2 实验方案 将经过除蜡预先处理过的蜂胶粉末 加入不同的浓度的乙醇 配置成不同固 液比的蜂胶溶液 用超临界流体 CO2 进行 SFE 实验 实验的萃取压力为 7 36MPa 萃取温度为 35 55 萃取时间为 60 360min 分离压力为 6 5MPa 为便于对 比 每次实验的进料量都取等量 300g CO2 流率固定为 10L min 循环萃取 影 响黄酮类化合物萃取率的主要因素有萃取压力 萃取温度 夹带剂的浓度 固液 比 萃取时间和流速等 1 3 单因素实验 1 3 1 萃取压力实验 SFE 过程中 萃取压力是影响最终黄酮类化合物含量的重要因素 温度恒定 时 流速和固液比保持不变时 随着萃取压力的增大 超临界二氧化碳密度增 大 其溶解能力随之增加 但是二者不是线性关系 物质不同 所要求的萃取压 力有很大差异 对于属于强极性的黄酮类化合物 萃取压力要求较高 9 该图 1 显示萃取压力与萃取得率是呈正相关的 当萃取压力较低时 18MPa 分离釜中黄酮类化合物的得率随萃取压力增大而缓慢增加 当萃取 压力范围处于 18 25MPa 时 分离釜中黄酮类化合物的得率随萃取压力的增加将 迅速增加 当萃取压力 25MPa 分离釜中的黄酮类化合物含量则随萃取压力的升 高而又重新缓慢递增 尽管压力越大 萃取得率越高 然而由于压力过高 生产 成本将增加 同时增加了不安全因素 因此选取合适的萃取压力为 20 25MPa 范 围 1 3 2 萃取温度和时间实验 由于采用乙醇作为超临界流体萃取的夹带剂 乙醇用量较少 实验中固液比 控制在 2 1 之上 乙醇浓度选用 60 以上 流速为 20 50kg h 图 2 给出了相 同的固液比 乙醇浓度和 CO2 流体流速前提下 压力范围 10 36MPa 四种不同 温度 35 44 50 和 58 下 萃取压力对黄酮类化合物得率的影响关系如图 2 10 结果表明 在萃取流量和萃取压力恒定时 萃取得率在一定范围内随温度升 高而增加 但超过一定温度 萃取率反而下降 这是由于温度升高到一定程度 58 时 因密度变化引起的溶解能力占主导地位 从而使总的萃取能力下降 同 时表明 在 20 30MPa 压力范围内 萃取温度为 50 时黄酮类化合物萃取率最 大 图 3 为 50 时 固液比 6 1 乙醇浓度为 95 四种萃取压力下萃取率与 萃取时间实验关系图 结果表明只有当萃取时间大于 2h 以后 萃取效果才会明 显 萃取时间的最佳条件为 4h 左右 当萃取时间延长至 4h 以上时 萃取得率增 长十分缓慢 11 1 3 3 固液比实验 为达到增大黄酮类化合物在超临界流体 CO2 中的溶解度的目的 为此实验中 考察经过预处理的 7 种不同的固液比的蜂胶溶液在其他工艺条件相同的条件下 的固液比对黄酮类化合物萃取率的影响 图 4 结果表明 在固液比处于 2 1 6 1 范围内时 随着固液比的增加 即 乙醇含量的减少 黄酮类化合物提取率随之增大 在固液比为 6 1 时达到最大 值 这是由于一方面乙醇在超临界提取蜂胶黄酮类化合物时起到了提携作用 相 对于无夹带剂作用时 大大地提高了萃取得率 另一方面过多的乙醇会使超临界 流体二氧化碳饱和 而未起到足够的饱和作用 以至萃取得率提高不是很显著 这就与文献报道的夹带剂使用量不宜过多是一致 然而当夹带剂的使用少于一定 用量时 利用夹带剂提高黄酮类化合物的萃取得率的特性并不能充分得到体现 实验发现当固液比大于 7 1 时 萃取率将不会随着固液比的增大而增加 反而 有所下降 1 3 4 乙醇浓度实验 乙醇作为超临界流体 CO2 萃取蜂胶中黄酮类化合物的夹带剂 其用量的多少 对萃取率的影响在上面已经讨论研究 这里考虑夹带剂的另一个因素 乙醇浓 度对萃取效果的影响 根据前面的单因素实验 实验研究在萃取温度为 50 固 液比为 6 1 萃取时间为 4h 流速为 35kg h 实验条件下 乙醇浓度对萃取效果 的影响 12 图 5 显示 在同样的实验条件下 随着夹带剂 乙醇 浓度的增加 黄酮类 化合物的得率将会逐步提高 原因是由于黄酮类化合物在乙醇溶液中的溶解度 将随着浓度的增大而增大 从而正相关地影响萃取的效果 1 3 5 流体流速实验 对于超临界流体萃取技术 影响萃取效果的因素除了温度和压力以外 萃取 流体的流速也是一个影响因素 实验条件 萃取温度 50 固液比 6 1 乙醇 浓度 95 萃取时间 4h 进行萃取压力和流体流速实验 并不是很大 同时显示 对于不同的压力 达到最佳萃取效果的流速是有所不同的 由图可见压力越高 达到最佳萃取效果的流速越低 萃取压力越低 达到最佳萃取效果的流速越大 2 正交实验及其数据分析 13 根据前面的单因素实验 各工艺参数单因素 萃取压力 萃取温度 固液比 萃取原料与夹带剂的比值 乙醇浓度 萃取时间和流体流速对萃取得率的影 响实验研究表明 利用夹带剂超临界流体萃取蜂胶中的黄酮类化合物时 萃取时 间只有当大于 2h 时 萃取效果才明显 随后随着萃取时间的增加 黄酮萃取得 率增加很缓慢 另外 流体流速单因素实验得出流体流速对萃取效果的相对影响 更是甚微 因此正交实验中就萃取压力 A 萃取温度 B 固液比 C 乙醇浓 度 D 这四个主要影响因素 安排了四个因素的三水平正交实验 以确定它们对 超临界流体萃取效果的影响主次关系以及最终确定较优的超临界流体萃取工艺 参数 正交试验表头设计如表 1 试验方案及结果分析为表 2 3 极差和方差分析表明 四种对蜂胶中黄酮类化合物提取效果影响的因素 萃取压 力 萃取温度 固液比 乙醇浓度 它们的强烈程度从高到低的顺序是 萃取压 力 乙醇浓度 固液比 萃取温度 同时进一步从 F 值与临界值的比较知道因素 萃取压力的影响是最显著的 乙醇浓度和固液比较影响显著 而因素提取温度无 显著影响 因此可以确定超临界流体萃取的优化工艺参数为 萃取压力为 25MPa 乙醇浓度 95 固液比 6 1 和萃取温度 50 3 结论 选用乙醇作为夹带剂 通过对超临界流体 CO2 对蜂胶中黄酮类化合物的萃取 技术研究 发现 3 1 最佳萃取实验工艺条件为 萃取压力 25MPa 乙醇浓度 95 固液 比 6 1 萃取温度为 50 萃取时间为 4h 流体流速为 35kg h 此时黄酮类 化合物萃取率达到 15 以上 3 2 影响萃取得率的各因素的强烈程度顺序是 萃取压力 乙醇浓度 固液 比 萃取温度 萃取压力的影响是最显著的 乙醇浓度和固液比影响较显著 而 14 因素提取温度无显著影响 3 3 尽管相对醇提工艺 利用乙醇作为夹带剂 采用超临界流体萃取技术 萃取的黄酮类化合物得率较低 但是萃取物纯净 色泽金黄 芳香 呈脂状 而 且溶剂残留极少 有效成分不受破坏和氧化 3 4 利用乙醇作为夹带剂 采用超临界流体萃取技术萃取蜂胶中黄酮类化 合物 相对于报道的无夹带剂的超临界流体萃取技术 黄酮类化合物得率很高 而且大大地缩短了生产周期 为蜂胶产品的深度开发提供了工业化技术基础 本文摘自 食品科学 2002 年第 8 期 15 梯度升温法对超临界 CO2 萃取蜂胶的影响 刘晶晶 张盛木 章晋武 徐培娟 摘 要 在用超临界 CO2 萃取蜂胶过程中 蜂胶得率往往只有 8 12 且其 中黄酮类化合物含量也只有 5 6 这是由于蜂胶在高于常温条件和高压力条 件下容易结块 板结 导致 CO2 气体由弥散式通过萃取物的形式变成通道式通 过萃取物 从而大范围降低与萃取物的接触面积使萃取蜂胶有效成分降低 得率 下降甚至萃取失败 通过设置梯度升温方式进行萃取可以缓解板结 结块而使 蜂胶有 效成分萃取完全萃取得率增加到 15 20 其中黄酮类化合物含量达 到 7 9 关键词 蜂胶 超临界 CO2 萃取 黄酮类化合物 梯度升温 蜂胶是蜜蜂从植物的芽孢 树皮或茎杆的伤口中采集的树脂与自身分泌物的 混合体 它是植物有效成分经过动物深加工的产物 结合了动植物双重功能优 势 特别适合人体的吸收和利用 蜂胶的成分非常复杂 现已发现含有 300 多 种有效成分 包括 30 多种人体必需的微量元素 20 多种氨基酸 30 多种黄酮 类物质 以及丰富的萜烯类 酶类 多糖等具有生物学活性的天然成分 超临 界 CO2 萃取是一种安全 高效的高新分离技术 被广泛地应用于天然资源活性 物质的提取 普通的超临界萃取蜂胶过程中超临界蜂胶产物较低 有效成分含量 也不高 因此超临界萃取蜂胶也有少数专家质疑其可行性 但通过梯度升温方 式进行超临界蜂胶萃取发现 其超临界产物得率明显提高 且产物品质也大大提 升 1 材料与方法 1 1 实验材料及仪器 蜂胶 南昌同心紫巢生物工程有限公司提供 CO2 超临界流体萃取仪 5 L 江 苏华安超临界设备公司 气相色谱仪 日本岛津 GC 9A 气相色谱仪 1 2 研究方法 将蜂胶冷冻粉碎后分成 4 组 每组设 3 个重复 各组数据为 3 个重复的平均 16 值 在其他操作条件 萃取压力 32 MPa 与 CO2 的流量 35 kg h 及萃取时间 4h 相同的条件下 第 1 组以 35 的萃取温度进行超临界流体萃取 第 2 组以 45 的萃取温度进行超临界流体萃取 第 3 组以 55 的萃取温度进行萃取 第四 组以 35 为基础每隔 1h 升高 5 的方式进行萃取 即第 1h 萃取温度为 35 第 2 h 为 40 第 3h 45 第 4h 50 收集各组超临界萃取最终产物 计 算超临界萃取得率 同时用气相色谱法测定产物中黄酮类化合物含量 NaOH 滴 定法测定酸价及目测法评定颜色 入口品定辛辣味 超临界蜂胶得率 每组超临 界萃取累积量 原料蜂胶重量 100 1 3 工艺流程 原料 冷冻粉碎 称重 装柱 密闭 升温 升压到预定条件 超临界状态 下萃取 由分离柱得到所需超临界产物 2 结果与讨论 2 1 超临界流体萃取蜂胶得率和黄酮类化合物含量 见表 1 2 2 超临界流体萃取产物的感官评定分析 见表 2 2 3 讨论 在超临界萃取过程中 蜂胶中的蜡质和挥发性油脂及有机酸和酯类物质很容 易萃取出来 而萜类化合物 黄酮类化合物 酶类 多糖等生物学活性成分较难 萃取出来 由表 1 可以看出 对比组第 1 2 3 组 在萃取温度升高时 萃取 得率先有所增加后又下降 但组别间相差不是很明显 前三组与第 4 组对比时发 17 现 第 4 组的超临界产物得率明显提高 且产物中的黄酮类化合物含量也明显 增加 通过对超临界产物的品质分析发现第 4 组的产物颜色更为黄亮 且酸价有 所下降 入口辛辣感增强 酒精可溶物增加 不难看出这是因为前三组中萃取的 成分中蜡质和挥发性油脂及有机酸和酯类物质含量比例大 大量其他有效成分没 有萃取出来 因此颜色是黄色中略微带有浅白色 酸价较高 辛辣感较第 4 组 弱 酒精可溶物含量也不高 而第 4 组产物在颜色 辛辣感和酒精可溶物明显 增加 辛辣感也增强 表明第 4 组超临界萃取过程中蜂胶有效成分大部分被萃 取出来 通过对各组超临界萃取后的料渣分析发现 第 1 2 3 组的料渣结块 严重 且温度越高结块越严重 而第 4 组料渣疏松 透气 通过对第 1 2 3 组 料渣冷冻粉碎后重新进行超临界萃取发现 还能萃取出部分超临界产物 表明 超临界萃取蜂胶过程中由于蜂胶在稍高的温度 35 以上 下容易结块的物 理性质 导致在物料结块降低气体的通透性而导致有效成分不能完全萃取出来 这与 Shouqin Z 等人报道一致 通过梯度升温的方式 在较低的温度下让低熔点 的部分有效成分先萃取出来 从而减少了蜂胶中低熔点成分 提高了蜂胶的熔 点从而提高了其板结温度 再适度提高萃取温度将其中部分稍高熔点的成分萃 取出来而再次提高其板结温度 3 结论 通过梯度升高萃取温度 萃取釜中的蜂胶的板结温度也在梯度提高 从而 保证了在整个萃取过程中蜂胶不结块 不降低其气体的通透性 从而保证了有效 成分的萃取完全 本文摘自 食品研究与开发 2007 年第一期 18 响应面法优化蜂胶超临界二氧化碳萃取 工艺的研究 徐 响 孙丽萍 董捷 摘要 采用响应面法优化蜂胶超临界二氧化碳萃取工艺 根据中心旋转试验 设计 研究萃取压力 萃取温度和二氧化碳流速等工艺条件对萃取率的影 响 结果表明 蜂胶萃取物的萃取率随温度的升高而降低 随压力和二氧 化碳流速的增加萃取率不断增大 而在高压和高流速下又呈现下降趋势 分析所得的回归方程确定最佳工艺条件为 萃取压力 3 3 4 MPa 温度 4 5 4 二氧化碳流速 16 8L h 在此条件下萃取蜂胶1 20 m in时萃取物的萃取 率达19 62 g 100 g 蜂胶 GC MS 分析表明萃取物中含有较高含量的烷烃类 物质和烷醇类物质以及肉桂酸肉桂酯 柯因 5 甲基柯因等 关键词 蜂胶 超临界二氧化碳 响应面 蜂胶是蜜蜂从植物芽孢和树干处采集树脂并混入蜜蜂上颚腺分泌物和蜂蜡 等形成的一种具有芳香味的黏性 胶状固形物 作为一种极为稀少的天然资源 蜂胶具有抗菌 抗病毒 抗肿瘤 降血脂 降血压作用 超临界流体技术在近几 十年来发展迅速 在食品 医药 化工 材料科学 环境科学 分析技术等领域 己经得到广泛的应用 因二氧化碳临界温度和临界压力 低 31 06 7 39MPa 对中 低分子量和非极性的天 然产物有较强的亲和力 而且具有环境友好的特 点 超 临界二氧化碳技术广泛用于功能性油脂 挥发性油 生物碱 苷类 香 豆素类 萜类的提取 超临界二氧化碳萃取蜂胶制成保健食品的生产过程无污染 能有效地脱除重金属 产品已被越来越多的消费者接受和喜爱 响应面 response surfacemethodology RSM 采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数 关系 通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数 解决多变量问题 在食品工 业中得到了广泛应用 但其应用于超临界二氧化碳萃取蜂胶的工艺条件优化尚未 见报道 本研究将响应面法应用于蜂胶超临界二氧化碳萃取工艺优化中 为蜂胶 功能食品的开发和利用提供理论基础和实验依据 1 材料与方法 1 1 材料与仪器 19 蜂胶 北京中蜜科技发展有限公司 HA220 50 06型超临界流体装置 江苏省南通华安超临界萃取公司 7890 5975 气相质谱仪Agilent 公司 1 2 方法 1 2 1 超临界二氧化碳萃取工艺流程 精确称取粉碎的蜂胶 125g W1 及 20 乙醇装于萃取釜中 设定萃取温度 分离温度 从钢瓶中流出的二 氧化碳经净化后进入冷凝箱即液化器冷凝至流体 经高压计量泵加压至设定压力 经加热器加热至预定温度后进入萃取釜进行动态 萃取 经过120 min后 蜂胶提取物于分离釜底部经放油阀放出收集 除去乙醇 精确称量萃取物重W2 计算萃取率 W2 萃取率 100 W1 1 2 2 响应面试验方案 20 在单因素试验基础上选取萃取压力 温度和二氧化碳流速三个因素 表 1 采用中心旋转设计 centralcomposite design CCD 优化超临界二氧化碳 萃取蜂胶工艺参数 试验方案见表 2 1 3 GC MS 分析 21 将 30MPa 50 15L h 条件下得到的萃取物 0 5g完全溶于三氯甲烷中 定容至10ml 过0 4 5 m滤膜 采用GC MS进行分析 GC条件 色谱柱为DB 5MS 30m 0 32 mm 0 25 m 载气 氦气 1ml min 进样口温度 280 分流进样 量 1 l 分流比 1 2 0 柱温升温程序 初始75 保持1min 以10 min 速度升温至180 保持10min 以2 5 min 速度升温至320 保持20min MS 条件 电离方式为EI源 离子源温度180 四极杆温度150 接口温度280 电子能量70eV 质量扫描范围为35 450amu 2 结果与分析 2 1 回归方程及ANOVA分析 采用Statgraphics Centurtion XV软件对所得数据进行回归分析 分析结果 见表3 萃取压力的平方项 温度的一次项和平方项对萃取率的影响极显著 p 0 01 压力的一次项 二氧化碳流速的平方项对萃取率的影响显著 p 0 05 数据经回归拟合后得到的回归方程如下 其R2 0 927773 R2 Ad j为0 83909 表明回归方程与实验值具有高度拟合性 Y 220 763 2 85891X1 7 22821X2 3 40131X3 0 0390801X1 0 0 123296 X1X2 0 0185137X1X3 0 0706965X2 0 0237213X2X3 0 0874972X3 2 2 超临界二氧化碳萃取蜂胶的响应面分析 22 响应面图直观地反映了各自变量对响应值的影响 并且从图上可形象地看出 最佳参数以及各参数之间的相互作用 图2是在二氧化碳流速15L h 时压力和温 度的 响应曲面图 在较低的压力范围内 方程中一次项系数为正 蜂胶萃取物 的萃取率随着压力的增加而增大 因为压力的升高使密度增加从而提高弱极性化 合物在超 临界二氧化碳中的溶解度 当压力大于33 MPa左右时 萃取率增加变 得平缓 在高压时甚至出现下降趋势 这可能是由于二氧化碳在高压下使溶质与 二氧化碳的排斥作用增强 萃取温度对蜂胶萃取物萃取率的影响显著 p 0 05 其一次项系数为正 二 次项系数均为负 在实验的温度范围内对萃取率呈现出明显的降低作用 如图 2 和图4所示 随着萃取温度的增加 萃取率呈下降趋势 这主要与温度对二氧化 碳流体的密度和蜂胶原料的影响有关 随着温度的升高 二氧化碳流体的密度降 低 导 致物质在二氧化碳中的溶解度下降 并且高温易使粉 碎的蜂胶发生黏合 降低溶质在二氧化碳中的传质速率 从而使萃取率随着温度的升高而降低 23 在萃取压力30M Pa 温度50 下二氧化碳流速对萃取率的影响见图3和图4 二氧化碳流速的平方项对 萃取率影响显著 p 0 05 随着二氧化碳流速的增加 萃取率随之 增高 当流速大于17L h时 萃取率又呈下降趋势 二氧化碳流速对萃取过程同 时存在着两方面的影响 一方面 流速的增加使单位时间里二氧化碳对蜂胶原料 的萃取次数增加 提高了传质速率 另一方面 当二氧化碳流速较大时 溶质与 超临 界流体来不及充分作用即到达分离釜中 使得萃取率下降 1 1 2 3 最佳工艺条件的优化对回归方程取一阶偏导数等于零 求解方程组得 X1 33 4012 X2 45 387 X3 16 8192 即蜂胶超临界二氧化碳萃取工艺的最 24 佳条件为 萃取压力33 4MPa 温度45 4 二氧化碳流速 16 8L h 在该条件 下蜂胶萃取物萃取率可达19 62g 100g 2 4 萃取物组成 采用GC MS对超临界萃取得到的蜂胶萃取物进行定性分析 总离子流图如图 5 GC MS检出组分经NIST WILEY检索数据库进行检索并根据文献进行谱图解析 采用峰面积归一化法计算解析组分的百分含量 结果见表4 超临界CO2萃取蜂胶 得到的样品除含有较高含量的烷烃类物质和烷醇类物质外 还含有苯甲酸 苯乙 醇 肉桂醇 肉桂醛 愈疮木醇类物质等 这与其杨树型植物来源和混入的蜂蜡 有关 从表4还可以看出 在超临界CO2萃取物中 3 羟基 4 甲氧基肉桂酸 肉 桂酸肉桂酯 柯因 5 甲基柯因等含量较高 表明超临界CO2 萃取能够将蜂胶中 黄酮类化合物进行萃取 其功效有待于进一步研究 3 结论 响应面法优化蜂胶超临界二氧化碳萃取工艺试验结果表明 萃取压力 温度 和二氧化碳流速显著影响萃取率 p 0 05 综合分析回归模型确定最佳的工艺条 件 为 萃取压力33 4 MPa 温度45 4 二氧化碳流速16 8L h 在此条件下萃 取蜂胶12 0min 萃取物的萃取率为19 62g 100g 蜂胶 萃取物中含有较高含量 的烷烃类物质和烷醇类物质 以及苯甲酸 苯乙醇 肉桂醇 肉桂醛 愈疮木醇 类物质 肉桂酸肉桂酯 柯因 5 甲基柯因等 本文摘自 食品科学 2009 年第 8 期 25 蜂胶超临界 CO2萃取物抑菌作用 赵强 刘文群 张彬 周率 黎新江 摘 要 摘 要 探讨了蜂胶超临界CO2萃取物的抑菌作用 并与蜂胶醇提物 水提物的抑菌 效果进行比较 实验以 8种细菌作为受试菌 通过滤纸片法和试管稀释法分别测定 其抗菌活性和最小抑菌浓度 M IC 结果表明 超临界CO2蜂胶萃取物对8种受试 菌种有良好的抑制作用 最低抑菌浓度为 78 1 2 500 g mL 超临界 CO2 蜂 胶萃取物的抑菌活性较蜂胶醇提物更强 2 5m g mL 最小抑菌浓度总体相当 但大大强于蜂胶水提物 关键词 关键词 蜂胶 超临界CO2萃取物 抑菌活性 最小抑菌浓度 蜂胶 propolis 是工蜂采集植物幼芽中的粘性树脂成分并混入上腭腺分泌 物及蜂蜡等形成的一种天然物质 国内外已从蜂胶中鉴定出 300 多种物质 其功 能成分主要有类黄酮化合物 芳香酸类化合物 酚类 醛类 醇类 酮类化合物 以及萜烯类化合物等 蜂胶具有抗菌 消炎 抗病毒 抗肿瘤 抗氧化 降血脂 等多种作用因而备受研究者们关注 现已广泛应用于医药 食品 化工 农业等 领域 蜂胶有效成分的抗菌作用仍然是目前的研究热点之一 Dave 和 Dobrowalski 等人报道蜂胶具有抑制革兰氏阳性菌的活性 但对革兰氏阴性菌活 性 较弱 Fernandes 等人证明了蜂胶乙醇提取物对酵母病原体的抑制作用 Ozcan 等研究了蜂胶的抗真菌性能 发现蜂胶对酵母菌和霉菌也具有很强的抑制 作用 Pa rk 等人发现来自巴西不同地区的蜂胶乙醇提取物均对链球菌的生长有 抑制作用 大量实验表明蜂胶具有广谱的抗菌作用 研究还发现蜂胶能抑制和杀 灭多种细菌 真菌和病毒 并且只抑制和杀灭对人体有害的微生物 最近几年 国内一些研究机构采用超临界二氧化碳萃取技术提取蜂胶中的有效成分 所萃取 的产物与乙醇提取物色泽 气味 质地有明显不同 Katali nic 对蜂胶研究发现 提取方式的不同导致化学成分的不同 生理活性也就不尽相同 先前有关蜂胶超 临界二氧化碳萃取方法 成分 功效研究国内外有不少报道 但相关蜂胶抗菌效 26 果的研究大多是针对蜂胶乙醇提取物或水提物 蜂胶超临界二氧化碳萃取物的抗 菌作用研究偏少本研究采用滤纸片法和试管稀释法 分别测定蜂胶超临界 CO2 萃取物对大肠埃希氏杆菌 金黄色葡萄 球菌 枯草芽孢杆菌 产气肠杆菌 普 通变形杆菌 啤 酒酵母 假丝酵母 黑曲霉的抗菌活性和最小抑菌浓度 并与 蜂胶的醇提物 水提物进行比较 以探讨蜂胶超临界 CO2 萃取物的抗菌活性 1 材料与方法 111 材料与仪器 大肠埃希氏杆菌 Escherichiacoli 金黄色葡萄球菌 Staphy lococcus aureu s 枯草芽孢杆菌 Bacillussubtilis 普通变形杆菌 P roteusvulgaris 产 气肠杆菌 E nterobacter aerogenes 啤酒酵母 Saccharomy cesce revisia e 假丝酵母 Candidasp 黑曲霉 Aspergillusniger 由南昌大学生命科学学院 微生物实验室提供 蜂胶 由江西汪氏蜜蜂园有限公司提供 牛肉膏 BR 蛋白胨 BR 琼脂 中国医药集团上海化学试剂公司产品 N aC l AR DMSO 二甲基亚砜 AR 乙醇 AR 乙酸乙酯 AR 氯仿 AR 培 养基 自制牛肉膏蛋白胨培养基和 PDA 培养基 超临界 CO2 萃取装置 南通 市华安超临界萃取有限公司 超净工作台 高压蒸汽灭菌锅 恒温干燥箱 电热 恒温培养箱 打孔器 电炉 培养皿 试管 酒精灯等 气相色谱 质谱联用 仪 GC MSAgilen t 6890N 5973 i 等 112 实验方法 1 2 1 实验样品的制备 1 2 1 1 乙醇提取蜂胶 称取蜂胶 40 g 冷冻后粉碎 置 500 mL 圆底烧瓶 中 加入 400 mL 70 V V 的乙醇 常温 25 左右 搅拌提取 24 h 提取两次 合并滤液浓缩至 400 mL 置冰箱中于 5 冷析 4h 过滤除去上层析出的蜂蜡后 得滤液 滤液旋转蒸发脱除溶剂 得到蜂胶乙醇提取物 提取率为 44 43 1 2 1 2 水提取蜂胶称取蜂胶 40 g 冷冻后粉碎 提取方法与乙醇提取法相 同 只是溶剂改为水 滤液最后冷冻干燥得蜂胶水提取物 2 5 g 1 2 1 3 超临界 CO2 萃取蜂胶称取蜂胶 200 g 脱蜡 冷冻粉碎 对粉碎 的蜂胶进行造粒处理后投入萃取釜进行萃取 萃取温度 55 压力 30 M Pa 流 量 50 kg h 萃取时间 4 h 得萃取物 27 33 g 称取萃取物 40 g 加入到 500 mL 27 的单口瓶中 加入 400 mL 的乙酸乙酯 50 恒温提取 2 h 常温冷却过滤 滤液依次在 5 18 下过滤 脱除溶剂 得超临界 CO2 萃取蜂胶的分离物 提取率为 30 23 1 2 1 4 实验样品的配制分别精确称取蜂胶 3 种提取物 0 25 g 用 DM SO 溶解并定容为 10 mL 配成 25 m g mL 的样品溶液 无菌操作 配制的容器用 具提前灭菌 样品及编号具体见表 1 表 1 蜂胶抑菌实验样品 1 2 2 抑菌试验 1 2 2 1 实验菌悬液的制备 从新鲜菌苔斜面上挑取一环供试菌 接种于盛有适合牛肉膏蛋白胨液体培养 基中 细菌 37 摇床培养 18 h 真菌 28 摇床培养 24 h 培养后用无菌水制 备菌原液 吸取 1 mL 菌原液加入 9 mL 无菌水中 得到稀释 10 倍的菌悬液 再 依次进行梯度稀释 将已灭菌并冷却 50 左右的培养基分别倒入无菌平皿中 水平放置待冷却 将不同稀释度的菌悬液用无菌吸管各吸取 0 2 mL 分别加入 到各自适宜的平板培养基表面 涂布均匀 按细菌 真菌生长条件培养 实验平 行 3 组 根据观察结果及活菌计数结果 选取合适的菌液浓度 要求在该浓度下 菌能长满整个培养皿且分布均匀 1 2 2 2 抑菌圈的测定 滤纸片法 1 用记号笔在无菌平皿底部划线 将平板分为 6 个区 每一 个区上标注加入样品名称 2 吸取 0 2 mL 已选取的合适菌液浓度的菌悬液 分别加入到牛肉膏蛋白胨培养基或 PDA 培养基的固体平板上 涂布均匀 3 取 已灭菌的圆形滤纸片 D5 mm 分别浸入装有各种蜂胶提取物样品的小烧杯中 浸泡 1 h 左右 4 无菌操 作将滤纸片帖在平板相应区域 平板中间贴上浸有无 菌生理盐水的滤纸片作为对照 每个菌种设个平行组 贴好滤纸片的含菌平板倒 置放入 4 冰箱静置 2h 再置于培养箱培养 细菌 37 培养 24 h 真菌 28 养 28 48 h 取出测量抑菌圈的直径 实验结果取平均值 1 2 2 3 最小抑菌浓度 M IC 的测定 根据抑菌圈所得的结果 对各受试菌种抑菌效果明显的样品进一步做 M IC 实验 试管稀释法操作如下 取无菌试管 13 100 mm 13 支 排成一排 除 第 1 支管加入 1 6 mL 牛肉膏蛋白胨或 PDA 的液体培养基外 其余每管加入 1 mL 在第 1 支管加入抗菌样品原液 25m g mL 0 4 mL 混匀 然后吸取 1 mL 至第 2 管 混匀后再吸取 1 mL 至第 3 管 如此连续倍比稀释至第 11 支管 并从 第 11 支管中吸取 1 mL 弃去 第 12 支管为不含样品的生长对照 然后 在每管 内加入上述制备好的接种物各 1mL 使每支管最终菌液浓度约为 106 CFU mL 第 1 支管至第 11 支管最终的样品浓度分别为 2500 1250 625 312 5 156 3 78 1 39 1 19 5 9 8 4 9 2 4 g mL 第 13 支管以无菌生理盐水做空白 对照 在读取和报告所测试菌株的 M IC 前 先检查生长对照管的细菌生长情况 是否良好 同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染 质控菌株的 M IC 值是否处于质控范围 以肉眼观察不到试管内培 养物浑浊的最低样品浓度 为依据 即为受试菌的 M IC 1 2 3 GC M S 分析 样品制备 各取 0 5 g 蜂胶醇提物和超临界 CO2 萃取物 置于 10 mL 容量 瓶中 加氯仿使溶解并稀释至刻度 摇匀 供分析用 色谱条件 H P 5 30 m 0 25 mm 0 25 m 弹性石英毛细管柱 F ID 检测器 升温程序 80 保 持 5 m in 8 m in 升温到 200 保持 5 m in 5 m in 升温到 280 保持 20 m in 载气 高纯 He 流量 1 mL m in 进样口温度 280 分流比 20 1 进样量 1 L 质谱条件 离子源 E I 离子源温度 230 四极 杆温度 150 电子能量 70 eV 电子倍增器电压 1718 V 接口温度 280 质量扫描范围 m z 50 550am u 2 结果与讨论 211 GC M S 分析结果 蜂胶醇提物 超临界 CO2 萃取物 GC MS 分析结果按化合物组成进行分类 其结果见下表 2 表 2 蜂胶样品化学组成 29 212 抑菌圈实验效果 滤纸片法测定蜂胶 3 种提取物样品对 8 种受试菌种的作用结果见表 3 由表 3 可知 3 种样品对大肠埃希氏杆菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 均具有较强的生长抑制作用 但 2 样对其它 5 种菌作用不明显 对 8 种菌的抑 制效果 其中 3 样与 1 样对枯草芽孢杆菌 大肠埃希氏杆菌 产气杆菌作用 尤其明显 3 样对黑曲霉的抑制作用显然强于 1 样 3 样的抑菌活性总体强 于 1 样 2 样的抑菌作用相对最弱 以大肠杆菌为例 3 种样品的抑菌效果 见附图 30 213 M IC 测定结果 根据抑菌圈结果 蜂胶水提物效果较差 试管稀释法测定 1 与 3 样的最 低抑菌浓度 测定结果见表 4 由表 4 可知 菌液浓度为 5 105 5 106 cfu mL 时 蜂胶醇提物与超临 界 CO2 萃取物的抑菌作用总体相当 对部分菌种的抑制活性前者强于后者 两 者对细菌的抑制作用明显强于真菌 对 8 种菌 M IC 为 78 1 2 500 g mL 综合表 3 表 4 可得出超临界 CO2 蜂胶萃取物的 抑菌圈效果较蜂胶醇提物 强 M IC 总体相当 但大大强于蜂胶水提物 酚类化合物 特别是黄酮类 酚 酸及其酯类化合物 一般被认为是蜂胶抗菌的主要原因 但是热带蜂胶不含有这 类物质仍然具有类似的活性 这一点显示了蜂胶中不同物质的组合是它能抗菌 31 的关键 另一方面 M a rcucc i Ku jungiev Kro l 等一批研究者认为蜂胶抗 菌的机制较为复杂 可能归于类黄酮和萜烯类协同作用的结果 而 Santos 等人 研究发现巴西蜂胶抗菌的原因应归于少数几个化合物协同作用的结果 蜂 胶醇 提物 其总酚类物质特别是黄酮类化合物含量较高 这可能是蜂胶具有抗菌作用 的主要原因 蜂胶超临界 CO2 萃取物 其主要成分总体较醇提物极性低 总黄 酮含量偏低 但萜烯类化合物含量较高 其抗菌活性与蜂胶醇提物相当 抗菌机 制可能归于类黄酮和萜烯类协同作用的结果 蜂胶水提物 抑菌活性较弱 有报 道说对结核杆菌有很强的抑制作用 这说明蜂胶水提物只对某些菌有抑制作用 起关键作用成分可能与其中的多酚类化合物 有机酸及其酯类有关 3 结论 蜂胶超临界 CO2 萃取物的抑菌活性较蜂胶醇提物更强 25 mg mL 最小 抑菌浓度总体相当 由于蜂胶超临界 CO2 萃取物的抗菌活性较强 又因其绿色 环保 安全无毒 研究掌握其抗菌作用 将其应用于防病治病和防腐 为今后 蜂胶的广泛应用提供实验依据 具有重要意义 本文摘自 南昌大学学报 第 32 卷第 4 期 32 蜂胶的安全性 蜂胶的安全性 急性毒性试验 金枝 纯 仁科 保 蜂胶的利用历史可以追溯到远古希腊 在 12 15 世纪的医学专著中就有蜂 胶作为口腔内消炎剂 虫牙镇痛剂的记载 其后蜂 的进一步演化研究也以欧洲 作为中心 在日本 受 1985 年名古屋召开的第 30 届国际养蜂会议影响 蜂胶作 为保健食品原料的需求快速增长 日本蜂胶协议会积极地开展关于蜂胶成分 功 效以及安全性方面的资料收集 分析研究等 就恰当的销售 使用方法等指导 行业 努力育成健全的蜂胶市场 关于蜂胶的安全性 许多蜂胶的论述和 报告 中阐述简单 新奇的实验报告很少 非常有必要考虑蜂胶安全性的基础研究 因 此 委托日本食品分析中心作蜂胶急性毒性试验 另外 德岛文理大学药学部也 愿意研究蜂胶的过敏问题以及蜂胶制剂的生物活性问题 现将蜂胶急性毒性试验 结果报告如下 一 蜂胶概述 蜂胶是蜜蜂从植物 特别是从树木幼芽采集来的树脂 并混入自身分泌蜂蜡 作成的树脂状物质 蜜蜂用蜂胶加固蜂巢 修补蜂箱掩埋入侵死亡昆虫和小动物 尸体等 也用于蜂王产卵前巢房的涂层上光 蜂胶的成分复杂 由多种多样的有 机化合物组成 主要成分有黄酮类化合物 有机 酸 酚酸类 芳香醇以及酯类 还含有维生素和矿物质等 蜂胶中这些化学成分与蜂场附近的树木分泌液成分类 同 二 蜂胶的作用 蜂胶在蜂巢内是一种防腐剂 有抗菌性 在欧洲和中国 蜂胶作为蜂产品用 在医疗中