（微生物学专业论文）13丙二醇高产菌株的选育及其发酵研究.pdf

摘要 聚对苯二甲酸丙二醇酯 p t r 是一种新型的合成聚酯 具有许多优良特性和很好的应用前 景 而1 3 j 丙二醇 1 3 p d o 是其合成的关键性材料 近年来 1 3 j 丙二醇的研究受到了全球众 多知名企业的重视 与化学合成法相比 微生物发酵法生产1 3 丙二醇具有显著的优点 成为当 前的研究热点 产物抑制和副产物多造成微生物发酵法产1 3 丙二醇的产量低 另外 副产物多也是甘油转 化率低和产物分离困难的原因之一 选育既有1 3 一丙二醇高浓度耐受性 同时又具有副产物代谢 途径突变的菌株 是提高1 3 一丙 醇产量和甘油转化率并简化后期提取工艺的一种尝试 通过向培养基中添加外源性产物的方法 考察了1 3 丙二醇和其它有机酸如乙酸 乳酸 琥 珀酸对肺炎克雷伯氏杆菌 k p n e u m o n i a 发酵过程的影响 结果表明9 0g l 的1 3 一丙二醇完全 抑制了尼p n e u m o n i a e 的生长 乙酸虽有利于菌体生长却降低了1 3 丙二醇的产量 而乳酸则对 菌体生长有抑制 琥珀酸有利于1 3 丙二醇和乳酸形成 用m i n i t n 5 随机转座和亚硝基胍分别诱变 在含1 0 0g 几1 3 丙二醇和0 1 7 m 溴化钠 溴酸钠 质子自杀方法 的培养基上筛选既有l 3 丙二醇高浓度耐受性 同时又有产酸代谢途径突变的 菌株 传代后获得 个稳定突变株 摇瓶培养后作产物分析 经初筛和复筛获得一个l j 丙二醇 高产菌株 其乳酸脱氢酶酶活为1 6 2 u 仅为亲株的5 0 对突变株在自动发酵罐上作发酵研究 考察了溶氧对其产1 3 丙二醇的影响 最终选定适时 调整搅拌转速和通气量傲流加补料批式发酵 获得5 9 8 5g 几的1 3 丙二醇最高产量 此时其生产 强度为0 8 8 班a 甘油的摩尔转化率为5 3 9 4 突变株在初始甘油浓度为4 3 9 扎的批式发酵 中 1 3 丙二醇终浓度为2 1 2 9 k 较对照提高了 以上 1 3 丙二醇的生产强度为0 9 6 妒庙 较对照提高了6 5 且发酵液中只含1 3 丙二醇和乙酸两种产物 关键词 肺炎克雷伯氏杆菌 1 3 丙二醇 甘油 发酵 突变株 a b s t r a c t p o l y t r i m e t h y l e n et e r e p h t h a l a t e 呱an e w f a s h i o n e dp o l y e s t e r h a sn u m e r o u sp r o m i s i n g p r o p e r t i e sa n da p p l i c a t i o n s 1 3 p m p a n e d i o l 1 3 一p d o a sap i v o t a lm o n o m e r t ot h es y n t h e s i so fp t r i t h a sa t t r a c t e dp a r t i o d a ra t t e n t i o no fm a n yf a m o u sc m p o r a t i u ni nt h ew o r l di t h e s ey e a r s c o m p a r e d w i t hc h e m i c a ls y t h e s i s m i c r o b i a lf e r m e n t a t i o np r o c e s s e st o1 3 p d oh a v em a n yo b v i o u sa d v a n t a g e s t h ee n v i r o n m e n t a lf r i e n d s h i pa n dp c ea d v a n t a g em a k ei tm o r ep r o m i s i n g a n db e c o m et h ef o c u s e so f r e s e a r c h t h ei n h i b i t i o no fp r o d u c t so nm i c r o o r g a n i s mc e l l sw i l ll i m i tt h ep m d u dt i t e r t h ey i e l do f1 3 p d o o ng l y c e r o l a n dl e a dt h ep r o d u c tr e c o v e r ya n dp m i f i c a t i o nt oat r o u b l e s o m et a s k t h e s ep r o b l e m sm a y b ee f f e c t i v e l ys o l v e di fm u t a n t sw i t ht o l e r a n c et oh i g hc o n c e n t r a t i o no f1 3 p d oa n dl e s sb y p r o d u c t s w e r eo b t a i n e db ys e l e c t i v eb r e e d i n g 1 3 p d o l a c t a t e a c e t a t ea n ds u c c i n a t ew e r ea d d e dt of e r m e n t i o nm e d i a a n dt h e i re f f e c t sw e l e i n v e s t i g a t e d o nt h ea e r o b i cf e r m e n t a t i o no fl 目e b s i e l l ap n e u m o n i a e a sar e s u l t 1 3 p d oa ta c o n c e n u a 曲no f9 0g lw o u l di n h i b i tt h eg r o w t ho fc e l l sc o m p l e t e l y a c e t a t ew a sf a v o m b kt oc e l l s g r o w t h b u tr e p r e s s i v et o1 3 一p d oa c c u m u l a t i o n o e l l sg r o ww r e p r e s s i v eb yl a c t a t e a tac e r t a i n t y c o n c e n t r a t i o n s u c c i n a t ew o u l di n c r e a s et h ep m d u c i o no f1 3 p d oa n dl a c t a t e f o r t y f o u rm u t a n t sw e r eo b t a i n e da f t e rt h em i n i t n 5t r a n s p o s o ni n s e r t i o no rh t gm u t a g e n e s i so f 丘p n e u m o n i a ea n ds e l e c t e do ns e e dm e d i u mc o n t a i n i n g1 0 0g ll 3 p d oa n do 1 7 mn a b r n a b r 0 3 p r o t o n i c i d em e t h o d m u t a n t sw e r ei n v e s t i g a t e db ys h a k i n gf l a s k s a n dam u t a n tn a m e dn o 9w i t h h i g h1 3 p m p a n e d i o lp r o d u c t i v i t yw s e l e c t e d i t sl a c t a t ed e h y d r o g e a a s e0 d h a c t i v i t yw o n l y 1 6 2 u a b o u th a l f o ft h ep a r e n ts t r a i n i nt h ef e d b a t c hc u l t u r e s o fn o 9 al 3 p m p a n e d i o lt i t e r so f5 9 8 5g l w u so b t a i n e d a tt h em o m e n t t h ep r o d u c t i v i t yo f1 3 p d oi s0 8 8g t m t h em o l ec o n v e r s i o ne f f i c i e n c yo f y c e r o lw a s5 3 9 4 i n t h eb a t c hf e r m e n t a t i o nw i t hai n i t i a lg l y c e m lc o n c e n t r a t i o na t4 3 9g kn o 9f i n a l l ya c c u m u l a t e d2 1 2 g lo f1 3 p d 0 唧 h i g h e rt h a nw i l dt y p es t r a i n i t sp r o d u c t i v i t yo f1 3 一p d ow 勰0 9 6g 1 2 h h i g h e rt h a nw i l dt y p es t r a i n f u r t h e r m o r e o u l yt w op r o d u c t s 1 3 p d oa n da c e t a t e w e r ef o u n di nt h e c u l t u r e k e yw o r d s k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 陇p n e u m o n i a e f e n n e n t a t i o n m u t a n t 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他入已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意 躲1 时间 犹rf 月如时间 2 一年6 月 汩 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩印或扫描等复 制手段保存 汇编学位论文 同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 褓密的学位论文在解密后应遵守此协议 躲1 幼帆叨 月细 导师签名 l 锣影寥 时间 刎歹砗乡月z j 日 中回农业大学硕士学位论文文献综述 第一章文献综述 1 1引子 2 0 0 4 年8 月 北京国际展览中心开幕的中国国际内衣博览会上 一场时装秀在内衣展上引 起轰动 由美国杜邦公司与其中国合作伙伴海天轻纺集团联合举办新型面料产品发布会推出了使 用杜邦s o r o n a 聚合物开发的新型面料 c o r n t e c 杜邦公司技术专家全面介绍了s o r o n a 聚合物的卓越性能和广泛应用 生动展示了使用s o r o n a 聚台物开发的面料 c o r 町e c 的各 项优异性能 这一被称为 智能型 的聚合物 当用于纺织业时 它能满足设计师 制造商和客 户对服装所期待的所有优趣特质 用它制造的纤维具有比涤纶 尼龙纤维更为优异的性能 出色 的柔软性 舒适的拉伸回复性 优良的抗皱和抗污功能和易染色性等 如表1 1 内至轻薄柔 软的睡衣 外至蓬松厚实的夹克 用s o r o u a 1 j 成的纤维和织物能广泛应用于便装 工作服 运 动装 外套 针织套衫 袜类 女式紧身农和内衣等领域 具有很好的市场前景 而s o m n a 聚合物则是杜邦公司新推出的高分子合成聚酯一一聚对苯二甲酸丙二醇酯 p t t 是杜邦公司历经半个多世纪 在上百斡专利技术的基础上创造的聚合物和纤维家族中 的新成员 襄卜1p t t 纤维与涤她 阼t 尼龙 p a 6 p a 6 6 纤维的性能比较 邢声远 蕊r 垡 p 1 阿p e t p a 6p a 6 6 蓬松性及弹性优中中良 抗折皱性 优 优中良 静电 低 很高高高 拉伸回复性优差良优 吸水性差差 d 中 耐气候性 优 良差差 尺寸稳定性良良良良 染色性 优 优良良 印花适应性优中良良 耐污染性优良优优 加工及后处理费用 低 高 由 中 中国农业大学硕士学位论文文献综述 p r t 由对苯二甲酸 p t 和l 3 一丙二醇 1 3 p d o 作为单体聚合而成 l 3 一丙二醇分子合 适的碳链长度和对称的分子构形 p t t 兼具聚对苯二甲酸乙二醇酯 p e t 和聚对苯二二甲酸二醇酯 p b t 的优良特性 用p t t 制成的新的合成纤维材料和 程塑料 应用前景非常广阔 热塑性 工程塑料方面 p t t 既具有p e t 的物理性能 包括强度 韧性和耐热性 又具有p b t 的加工优势 如熔体温度低 结晶快等 同时又保持聚酯的基本优点 即尺寸稳定性 电绝缘性和耐化学品性 在合成纤维方面 p t t 不仅具有p b t 及尼龙纤维所特有的蓬松性和回弹性 同时还具有p e t 及聚 丙烯 p p 优良的抗污及抗静电能力 另外 由于p t t 纤维全色范围内染色无需载体 可以避免 因使用某些染色载体对环境造成的危害 井且不需加染色设备 可节省投资 王熙庭等2 0 0 0 z e n ge ta 1 2 0 0 2 t 众多的优点使得p t t 已拔公认为2 l 世纪最具前途的合成聚酯材料之一 圈1 ip e t p t t n y l o n 的台成路线比较 尽管p t t 具有如此多的优点 而且早在1 9 4 1 年研究p e t 树脂时就已成功地在实验室合成了 p t t 如图1 1 但直至2 0 世纪9 0 年代p t t 才实现规模化工业生产 究其根本原因就是制备p t 的主要原料1 3 一丙二醇单体低成本规模化工业生产比较困难 2 0 世纪9 0 年代 国际上几家大公 司相继在1 3 丙二醇合成新工艺上取得突破 这才使得p t t 这一优良的材料走进人们的日常生活 成为可能 2 中国农业大学硕士学位论文 文献综述 1 1 1 1 3 一丙二醇的性质 分子式 c 3 1 i b 0 2 相对分子量 7 6 1 0 结构式 h o c h 2 c h 2 c h 2 0 h 主要性状 在室温下是无色或淡黄色粘稠液体 略有刺激性的气味 与水 酵 酮 醚等溶 剂互溶 难溶于苯 四氯化碳 石油醚 毒理性质 无腐蚀性 微毒 小鼠口服l d 5 0 为1 4 1 5 一g k g 主要物理常数 沸点 1 0 1 3 k p a 2 1 4 2 熔点 3 2 2 相对密度 d 2 0 1 0 5 3 折射率 a 1 4 3 9 闪点 2 6 c 介电常数3 5 1 0 1 1 2 1 3 丙二醇的用途 l 3 一丙二醇是一种重要的化工原料 作为有机溶剂可用于化妆品 耐高压润滑剂 染料 油 墨 防冻剂 抗冻剂涂料等行业 显示出优良的性能 如1 3 丙二醇用于油墨可提高墨水的吸附 性 稳定性等 1 3 丙二醇既具有单醇的性质 又具有二醇的化学性质 1 3 丙二醇可用来合成 杂环以及药物中间体 朱丙田等2 0 0 0 z e n ge ta 1 2 0 0 2 但其最看好也是最主要的应用领域还是 用做新型聚醣原料 在高温下与羧酸缩合成醑 与异氢酸盐及酸性氯化物生成聚氨酯 在酸性催 化剂条件下与二元酸反应生成聚酯 杨菊群2 0 0 3 分而述之主要在如下几个方面 聚醢纤维 1 3 丙二醇和对苯二甲酸或对苯二甲酸 甲醋反应生成对苯二甲酸丙二醇醑 再 经缩聚反应生成聚对苯二甲酸丙二醇酯 p t t 最后经熔融纺丝而成的m 聚酯纤维 p i 饼维与 涤纶 p e t 尼龙 p a 6 p a 6 6 纤维的性能比较见表1 1 聚甬薄膜 1 3 丙二醇可与对苯二甲酸 己二酸 癸二酸发生缩聚反应 制成相应的聚醑薄 膜 这种聚醋薄膜具有可生物降解的特性 在土壤中可在自然界的微生物作用下逐步分解成碎块 因此 低生产成本工艺制造l 3 丙二酵必将在农用薄膜领域获得广泛应用 聚隧增塑和 作为高分子性能十分优良的聚酯增塑剂 其综合性能优于单体增塑剂如邻苯二 甲酸二辛酯 d o p 等 可以作为溶剂增塑剂在树脂成分中单独使用或者与增塑剂按常规结合使 用 用1 3 一丙 醇开发的聚酯增塑剂用于橡胶 塑料等材料中具有十分优异的增塑性能 是替代 i 0 p 的练台性能极为优异的绿色增塑剂新产品 特别适用于开发生物降解塑料的绿色增塑刘 中国农业大学硕士学位论文 文献综述 1 1 3 1 3 丙二醇的市场行情及生产现状 受1 3 丙二醇产量有限的影响 长期以来它的售价一直偏高 1 9 9 1 年其价格为3 6 5 l g 是乙 二醇 1 2 丙二醇 l 4 一丁二醇 2 3 丁二酵等其他二醇的十儿倍以至几十倍 当年的产量仅为1 0 0 吨 到1 9 9 5 年s h e h 公司首先实现了p t r 的商品化并在g e i s m a r 建有一套年产4 0 0 0 吨1 3 丙二醇的工 业装置 现在其年生产能力已经达到了7 5 万吨 另外d e g u s s a 公司也是世界上生产p t r 和i 3 一丙二 醇的大公司 具有年产5 万吨l 3 一雨二醇的能力 随着产量的大幅度增加 其价格降为3 5 翘 与此同时 中国 日本 韩国的一些大公司也积极参与到1 3 丙二醇的工业化生产研究中来 与 s h e n 公司和d e g i l s 女公司的化学法生产不同 尽管d u p o n t 公司早在1 9 9 8 年就获得d e g u s s a 公司的生 产技术 并已在德国和美国分别拥有2 t 2 万和1 2 万吨的年生产能力 但其并不把化学法作为生产 l 3 丙二醇的主要方向 而倾向于用经济可行的微生物发酵法进行生产 拟采用生物转化法生产 1 3 丙二醇 d u p o n t 公司正与世界第二大工业酶生产商g e n e n c o r i l l 际有限公司以及世界领先的原 料制造商 r a t e l y l ec r d c a c i d 公司 擅长加工玉米 小麦或糖 并通过技术实现对这些原料 的增值 联合开发用基因工程菌直接生产1 3 丙二醇实现大规模工业化生产技术 中试实验正在 进行当中 已得到的1 6 0g l 含l 3 一丙二醇发酵液 预计在2 0 0 6 年生物转化法生产1 3 丙二醇也将实 现大规模生产 根据美国咨询公司c o n d u x 的一项规划 近几年内p t r i f 产将达到百万吨 1 孓丙二醇的需 求量也会因此大大增加 近几年 1 3 丙二醇产量将进一步提高 但价格变化不会太大 至少不 会低于2 k g z e n g c ta 1 2 0 0 2 修志龙1 9 9 9 支目艳杰等2 0 0 2 我国的1 3 i 丙 醇产量非常少 2 0 0 2 年以前仅有少数几家化学试剂厂r 如北京化工厂 上海试 剂一厂等 用缩水甘油酸乙酯经氢化铝锂还原制得试剂产品 随着p l t 广阔良好的应用前景 越来 越多的企业加入到了1 3 丙二醇的大规模工业化生产的开发队伍中来 其中步伐最先的当数山东 邹平铜业有限公司下属的邹平铭波化工有限公司 该公司于2 0 0 2 年3 月底开发生产的化学合成l 3 丙二醇成功下线 随后在中嗣首家实现1 3 丙二醇的规模化工业生产 达到年产3 5 0 0 吨的产能 其产品报价为5 0 g 左右 为适应国内m 市场的预期需求 目前该公司再次扩大了l 3 j 丙二醇 的生产能力 预计三期工程竣工后其1 3 丙二酵的产能将达到6 5 吨 年 另外 由黑龙江辰能生 物工程有限公司与清华大学台作承担的国家高新技术产业化示范工程和国家 十五 科技攻关重 点项目 发酵法生产1 3 丙 醇项目也已完成以葡萄糖为底物两步法发酵生产l 3 丙二醇的中试 在5 m 3 的发酵罐中发酵 获得产醇量为6 0 7 0 9 l 其产业化运作目前正在进行之中 4 中周农业大学硕士学位论文 文献练述 1 1 4 1 3 一丙二醇的生产方法 1 3 丙二醇在p t t 生产过程中的关键性地位吸引了全球众多大公司参与到1 3 丙二醇生产研 发中来 目前己开发的具有工业应用前景的生产方法主要有三种 荷兰s h e l l 公司的环氧乙烷羰 基化法 德国d e g u s s a 的丙烯醛水解法和德国h e n k e l 美国d u p o n t 的微生物转化法 如图l 一 2 c a m e r o ne ta i 1 9 9 8 b i e b lc ta 1 1 9 9 9 c h o t a n ic ta 1 2 0 0 0 z e a ge ta 1 2 0 0 2 瞿国华等2 0 0 0 王熙 庭等2 0 0 0 薛丽梅等2 0 0 0 邵敬伟等2 0 0 1 2 0 0 2 冯婧微等2 0 0 2 刘艳杰等2 0 0 2 刘银乾等 2 0 0 2 杨菊群等2 0 0 2 a b 前两种方法近年已工业化 后一种方法也已经有公司完成了中试研究 最快可望在2 0 0 6 年实现规模化工业生产 现逐一简要介绍如下 盆芒等 d 1 1 8 鼹 介音 d u p o n t 口u n 将 弋 夕o 少 少矽l 叭 c m 州 1 f r oo h 一一 o h m e r o b k m l c r o u e r o b i c 一 坐 田1 21 3 丙二醇的生产方法 环氧乙烷羰基化法 自1 9 9 0 年以来s h e r 公司对该途径进行了系统深入的研究 使这种方法成为技术先进 经济合 理 率先实现工业化的一种重要技术 该技术从乙烯出发 催化氧化生成环氧乙烷 再羰基化经 由3 一羟基丙醛 3 h p a 最后催化加氢形成1 3 丙二醇 其反应步骤如下 第一步 环氧乙烷在催化剂作用下与c o 和h 2 反应生成3 掘基丙醛 c 2 h 4 0 c o 2 h 2 一h o c h 2 c h 2 c h o 5 玩 h 中国农业人学硕士学位论文 立 献综述 第二步 3 羟基丙醛经催化加氢生成1 3 一丙二醇 h o c h 2 c h 2 c h o h 2 一一h o c h 2 c h 2 c h 2 0 h 此生产方法的关键是催化剂的制各与选择 s h e l l 公司对此研究的最新文献表明 用改进的钴 双膦配体作催化剂和以酸加金属盐作助催化剂的催化体系 在9 0 c 1 0 3m p a 下 将环氧乙烷制成3 羟基丙醛 环氧乙烷的转化率迭5 8 以上 然后以n i 为催化剂对3 羟基丙醛进行加氢反应 反应 温度大于4 0 压力大于0 7 m p a 最后 经蒸馏提纯可得到合成聚醑级的1 3 一丙二醇 环氧乙烷羰 基化法原料比较容易得到 也易于储存和运输 产品成本价格低 但设备投资大 技术难度高 尤其是催化剂的制备和选用复杂 丙烯醛水合法 d e g u s s a 公司为技术持有人 并且也已实现工业化生产 此法以丙烯氧化生成的丙烯醛为原 料 在酸性催化剂或螯合型离子交换剂的作用下与水进行双键水合制得3 1 t p a 3 h p a 在ni 催化荆 或p t r u 催化剂的作用下 进行醛基加氢反应制得1 3 丙二醇 其反应步骤如下 第一步 丙烯氧化生成丙烯醛 2 c m c h c h 3 嘎一 2 c h c h c i i o 第二步 丙烯醛水合得到3 一羟基丙醛 a b 爿暑盼1 0 h 2 0 一一l l i c b 口k 既m 第三步 3 一羟基丙醛经催化加氢生成1 3 一丙二醇 h o 瑚z c 瞰臼1 0 一h c c i k m h 斌 该反应条件比较缓和 技术难度也不是很大 关键技术在于催化剂的选择上 但原料丙烯醛属剧 毒易燃易爆物品 难于储存和运输 徽生物发酵法 通常可以将微生物生产法分为两类 一是以德田h e n k e l 公司为代表的技术路线 用肠道细菌 厌氧或微好氧条件下直接将甘油在歧化转化为1 3 丙二醇 二是以美1 3 l d u p o n t 公w 雨l g e n e r c o r 公 司为代表的技术路线 用基因工程菌将糖首先转化为甘油 然后再转化为1 3 一丙二醇 与化学合 成法相比 它具有如下特点 1 可以利用成本较低的可再生资源 2 生产条件温和 节约能源 不需贵重金属催化剂 3 转化率高 选择性好 副产物少 易于分离纯化 4 环境友好等特点 微生物发酵法生产1 3 丙 醇目前尚处于实验室以及中试研究阶段 但它是以生物技术为特 征的 绿色工业 向传统石油化工提出的强有力的挑战 因而更具熏要实意义 正是基于杜邦突 破性地运用玉米糖发酵的生物技术实现了生物法制各1 3 丙二醇的先进工艺 美国环境保护机构 6 中嗣农业大学硕士学位论文 文献综述 向杜邦授予了2 0 0 3 年度的 绿色化学总统奖 有关微生物发酵法生产l 3 丙二醇的研究进展将在以下章节详细介绍 1 2微生物发酵法生产1 3 一丙二醇的研究进展 2 0 世纪8 0 年代由于西欧国家甘油的过剩以及对1 3 丙二醇潜在用途的开发 促进了发酵法生 产1 3 丙二醇的研究 德国的d e c k w e r 等人率先在菌种的筛选 微生物代谢机理 代谢过程 生产 潜力等方面都进行了深入的研究 尽管如此发酵法生产1 3 丙二醇醇仍未工业化 其产品仍处于 实验室阶段 还不能和化学产品相竞争 但随着菌种的性能改善 新工艺和新反应器的优化来逐 步提高产物浓度 转化率 生产强度以降低产品生产成本 提高发酵法生产1 3 丙二醇的市场竞 争力 进行大规模生产将是无疑的 1 2 1 生产菌种的选择 自1 8 8 1 年f r e u n d 发现巴斯德梭菌 c l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m 能发酵甘油产生1 3 一丙二醇以来 至今所发现的1 3 丙二醇生产菌均为细菌 主要有肠道细菌中的肺炎克雷伯氏杆菌 k l e b s i e l l p n e u m o n i a e 弗氏柠檬酸杆菌 c i t r o b a c t e r f r e u d i i 及成团肠杆菌 e n t e r o b a c t e ra g g l o m e r a n s 短乳 杆菌 l a c t o b a c i l l u s6 m t 澜布氏乳杆菌 l a c t o b a c i l l u sb u c h n e r o 丁酸梭菌 c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m 和巴斯德梭菌 k 们纰w p 蛔l 蛔l 等 它们只能利用甘油而不能由糖类等廉价碳源直接产生 1 3 丙二醇 i e b le ta 1 1 9 9 9 肺炎克氏杆菌 弗氏柠檬酸杆菌和丁酸梭菌具有较高的底物转化率 和生产强度 因而得到了较多关注 肺炎克雷伯氏杆蘸是一种革兰氏阴性菌 无荚膜 不运动 具有兼性厌氧的特性 国内外对 它的研究较多 其代谢机理 代谢途径及其涉及的酶 影响代谢因素等都研究得较为清楚 与梭 菌 厌氧菌 相比 生长快且比较菇控制 但因为肠道细菌都是条件致病菌 在培养进程中要有安 全防护措施 c a m e r o 吼e 1 1 9 9 8 b i e b le ta 1 t 9 9 9 就可达到的1 孓丙二醇终浓度而言 肺炎克氏 杆菌和梭菌相差不大 但由于肺炎克氏杆菌会产生一些诸如乙醇和乳酸的副产物 而副产物的产 生只提供很少或根本不提供还原力 故肺炎克氏杆菌在底物转化率上要低于梭菌 b i e b le t 蛆 1 9 9 9 肺炎克氏抒菌和丁酸梭菌与弗氏柠檬酸杆菌相比具有较高的甘油耐受力 发酵速度较快 1 2 2 微生物产生1 3 一丙二醇的代谢途径 1 3 i 氏j 醇是一种典型的甘油发酵产物 并未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来 d e c k w e r 1 9 9 5 b i e b le t 虹 1 9 蛸 甘油作为唯一碳源和能源名可以沿着氧化和还原途径发生歧化反应 氧 化途径中产物与糖类发酵产物一致 井产生供细胞生长所必需的a t p 在某些产物形成的同时释 放还原力n a d h v 还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力 生成1 3 一丙二醇 z e n g e ta 1 1 9 9 3 7 中国农业大学硕士学位论文文献综述 i 微生物厌氧代谢甘油途径如图1 3 还原途径包括两步反应 第一步 由依赖于辅酶b 1 2 的甘油 脱水酶催化甘油脱水生成班基丙醛 第二步 由l 3 丙二醇氧化还原酶催化3 一羟基丙醛还原生 成1 3 丙二醇 z e n g c ta 1 1 9 9 3 z e n g1 9 9 6 c a m e r o ne ta 1 1 9 9 8 b i e b le ta 1 1 9 9 9 氧化途径中生成 丙酮酸的反应在各菌中是相同的 丙酮酸的去向则因微生物种类而异 在肠道细菌中 丙酮酸被 丙酮酸甲酸裂解酶催化分解为乙酰c o a 和甲酸 甲酸往往又会分解为c 0 2 和h 2 乙酰c o a 在经 乙酰磷酸形成乙酸的过程中生成过量的a t p 而在经乙醛形成乙醇的两步反应中要消耗2 摩尔还 原力 在不控制p h 值的条件下 丙酮酸也可能经a 乙酰乳酸产生3 羟基丁醇并晟终转化为2 3 一 丁二醇 此外 肠道细菌发酵甘油的产物中还有乳酸和琥珀酸0 o m a n ne ta 1 1 9 9 0 s o e n i g ke t a 1 1 9 9 3 z e n gn a 1 1 9 9 3 1 9 9 4 m e n z e ie l 柏 1 9 9 7 b i e b le la 1 1 9 9 8 1 9 9 9 在丁酸梭菌中 有 两个典型的氧化途径产物 乙酸和丁酸 丁酸由两分子乙酰c o a 氧化2 个n a d h 2 后的一连串反 应生成 伴随着a t p 的产 4 z e n ge ta 1 1 9 9 4 s o l o m o ne ta 1 1 9 9 5 z e n g1 9 9 6 b i e b le ta 1 1 9 9 8 在巴斯德梭菌中丁醇成为氧化途径的主要产物 也有少量的乙醇产生f o a b r o e k1 9 9 2 b i e b le t a 1 1 9 9 9 b i e b l2 0 0 1 另外 如果假设平均细胞生物量组成为g h s 0 2 n 甘油比生物量更为还原 故细胞生长也可为1 3 丙二醇生成提供还原力 b i e b le ta 1 1 9 9 9 叵垂画圃匝囹 注 丁馥和n 丁醇只在援墓中产生 2 3 一丙二辞只在肠道细 中产生 乙酸和乙醇在这两个蓝群中均产生 囝1 3 微生物厌氯代谢甘油途径 b i e b le t i 1 9 9 9 8 中国农业大学硕士学位论文文献综述 1 2 3 代谢途径中关键酶和基因的研究 涉及到1 3 丙二醇形成的酶及其基因得到了广泛的研究 对肺炎克氏杆菌代谢甘油的调节机制 研究得比较清楚 涉及到厌氧甘油代谢豹系统f 扫d h a 调节子负责 它主要包括甘油脱水酶 甘油 脱氢酶 甘油激酶和l 3 丙二醇氧化还原酶 编码甘油代谢的酶的基因属于同一个调节子 f o r a g e 和l i n 1 9 8 2 b 称其d h 口调节子 其中甘油脱水酶l 扫d h a b c e 编码 1 3 丙二醇氧化还原酶由踟z 编 码 它们属于还原途径 催化1 3 丙二酵的生成 甘油脱氢酶由d h a d 编码 甘油激酶由d h a k 编 码 它们属于氧化途径 此外还可能存在一个调控基因踟r f o r a g ee ta 1 1 9 8 2 a j i ne ta 1 1 9 8 2 s p r c n g e re ta 1 1 9 8 9 t 0 n ge ta 1 1 9 9 l l u e me ta 1 1 9 9 7 a h r c n s e ta 1 1 9 9 8 m a c i se ta 1 1 9 9 8 s e i f e z l e ta l 2 0 0 1 s u ne ta 1 2 0 0 3 肺炎克氏杆菌和弗氏柠檬酸杆菌d h a 调节子中的基因已被克隆和测序 g e n b a n k u 3 0 9 0 3 和u 0 9 7 7 1 多数基因的功能也已知道 巴斯德梭菌的甘油脱水酶和1 3 丙二醇 氧化还原酶基困也已壳隆和测序 g e nb a n k a f 0 0 6 0 3 4 和a f 0 5 1 3 7 3 d h a t 基因是单个的开放阅读 框 d a n i e le ta 1 1 9 9 5 a l u e r s e t 0 1 1 9 9 7 而d h a b c e 由四个开放阅读框组成 其中三个为结构基因 在肺炎克氏杆菌中称作g z 翻 g l d b g l d c 在弗氏柠檬酸杆菌和巴斯德梭菌中称作踟b d h a c d h a e t o b i m a t s ue ta l l 9 9 6 s e y 醯dc ta 1 1 9 9 6 2 0 0 1 m a c i se ta 1 1 9 9 8 t o r a y a2 0 0 0 s u ne ta l 2 0 0 3 它们分别编码组成甘油脱水酶的d y b 三种亚基 d a n i e le ta 1 1 9 9 8 s e 洫ne ta l 2 0 0 1 綦文涛 等2 0 0 3 甘油脱水酶是l 3 丙二醇产生途径的关键限速酶 a b b a d a n d a l o u s s ic ta 1 1 9 9 6 a a i l r e n se t a 1 1 9 9 8 在催化过程中很快即被底物甘油失活 而幽口丑c e 基因中的另一个开放阅读框耐啊 瓦 p m m 妇冲 或幽卯 c 肝删和c p a s t e u r i a n u m 中 和g d r b 假p n e u m o n i a e 中 或d h a g c 加城f 和cp a s t e u r i a n u m 中 共同编码一个双组分的甘油脱水酶的激活酶 此酶可以激活被甘油失活的甘 油脱水i w m o r i e ta 1 1 9 9 7 d a n i e le ta 1 1 9 9 8 g a i i e ne ta 1 1 9 9 8 t o b i m a t s ue t0 1 1 9 9 9 2 0 0 0 s e i f e r t e ta 1 2 0 0 1 k a j i me ta l 2 0 0 1 g a j i u r a 等人 2 0 0 1 对此激活酶进行了比较深入的研究并提出了其激 活机制 如图1 4 首先 与激活因子结合的a t p 水解为a d p a d p 诱导激活因子从低亲和态变 为高亲和态 然后a d p 激活因子复合体与失活的甘油脱水酶全酶相结合引起全酶构象发生变化 并与其结合形成能量上更加稳定的三元复合体 同时释放出5 一脱氧腺苷和钴胺素 此时没有辅 酶的甘油脱水酶一激括因子 a d p 复合体即使添加了新的腺苷钴胺素a d o c b l 也是没有活性的 但游 离的a t p 可将a d p 置换下来并诱导激活因子成为低亲和态从而将没有辅酶的甘油脱水酶释放出来 此时其与a d o c b l 结合即成为具有活性的甘油脱水酶全酶 可以将底物甘油转化为3 一羟基丙醛 而 与a t p 结合的激活因子又开始水解a t p 进入下一次循环 甘油脱水酶的失活和激活并不是直接偶鞋 的而是协同发生的 t p 在此过程中具有双重功能 既作为使钴胺素从失活的全酶上释放出去的 9 中国杷业大学硕士学位论文 文献综述 a d p 的前体 又作为酶一激活因子复合体解离的变构因子 i a j i u r a2 0 0 1 r l 圈1 4 甘油脱水酶的激活机制承a j i u f ae tl i t i 2 0 0 1 s a i n t a m e n s 等人 2 0 0 1 曾发现丁酸梭菌v p i3 2 6 6 的甘油脱水酶不依赖于辅酶b 1 2 且对氧非常 敏感 最近 r a y n a u d 等人 2 0 0 3 对丁酸梭苗v p i1 7 1 8 的1 3 一丙二醇调节子的分子特性进行了研究 令人感兴趣的是 尽管其跏瑾因与肺炎克氏杆菌 弗氏柠糠酸杆菌和巴斯德梭菌的d h a 瑾因同 源性相当高 i d e n t i t y 7 6 8 5 蛋白同源性 s m i l a r i t y 与巴斯德梭菌更是达到9 2 其甘油脱水 酶与此前发现的依赖于辅酶b 1 2 的甘油脱水酶却显然不嗣 它是不依赖于辅酶b 1 2 的 而且对氧极 其敏感 而此前有人发现肺炎克氏杆菌在微好氧条件下也可将甘油转化为1 3 丙二醇 王剑锋等 2 0 0 1 z e n ge ta 1 2 0 0 2 1 2 4 培养基的优化 为了降低成本并给下游分离纯化提供方便 同时也减轻环境污染 在保证微生物正常生长代 谢的前提下 培养基应尽可能简化 维生素b 1 2 是甘油脱水酶的辅酶 f e 对丙酮酸脱氢酶和l 3 丙二醇氧化还原酶有激活作用 二者是1 3 一丙二醇发酵培养基中的重要成分 z e n ge ta l l 9 9 7 高 浓度n a 对甘油脱氢酶有抑制作用 k g h d 4 则对其有激活作用 目n h 的效果优于f 另外 l 是甘油脱水酶起催化作用所不可缺少的 l q h g 对甘油脱水酶和1 3 丙二醇氧化还原酶也有激活 作用 惨志龙2 0 0 1 王剑锋等2 0 0 1 因此 培养基中一价盐的选择和发酵过程中调节p 瞄的碱 的选择是1 3 丙二醇发酵过程中不可忽略的重要因素 惨志龙 王剑锋等人 2 0 0 1 做过一些优化肺 炎克氏杆菌连续培养和问歇发酵培养基的工作 朱丙田等a 2 0 0 0 通过正交实验发现对1 3 丙二醇 的产生和甘油转化率的影响程度依次为 初始甘油浓度 p h 值 磷 氮 邵敬伟等人 2 d 0 2 通过正 交实验优化了巴斯德梭菌产生l 3 丙二醇的发酵条件和培养基配方 r e i m a n n 等人 1 9 9 6 b 发现 在丁酸梭菌发酵过程中 添加甲基紫精 限铁和限磷会降低氢的产生而使1 3 丙二醇产量增加 c o l i i l 等人 2 0 0 1 发现 在丁酸梭菌发酵过程中 适量的外源乙酸可增加生物量和丁酸产量 却减 少了l 3 丙二醇产量 而适量的外源丁酸虽然减少了生物量 却同时减少了内源丁酸产量 增加 中图农业大学硕士学位论文文献综述 了1 3 丙二醇产量 甘油作为细菌唯一碳源和能源 在不产生h 2 的情况下 转化为1 3 丙二醇的理论摩尔转化率 为7 2 z e n ge ta 1 1 9 9 3 为了提高甘油的转化率 可以加入辅助底物作为还原力供体与甘油共 同发酵 葡萄糖虽不能直接转化为1 3 霞j 醇 但其代谢过程中产生的a t p 和n a d h 2 可用于细 胞生长和1 3 丙二醇形成 从而使甘油转化率大大提高 i i e b la n dm a r t e n1 9 9 5 张健等人 2 0 0 2 在肺炎克氏杆菌补料批式培养过程中以甘油为底物 流加葡萄糖作为辅助底物 甘油转化率提高 了5 3 4 生产强度提高了1 3 9 9 a b b a d a n d a l o u s s i 等 a 1 9 9 8 1 i f 究了连续培养条件下 丁酸 梭菌d s m5 4 3 i 以葡萄糖为辅助底物发酵甘油时的碳流和电子流 甘油转化率由单独发酵甘油时 的5 7 提高到9 2 9 3 m a l a o u i 和m a t c z a k 2 0 0 1 用野生型丁酸梭菌e 5 菌株和其烯丙基乙醇抗性 突变株m d 以葡萄糖为辅助底物发酵甘油 甘油摩尔转化率分别为8 9 和8 4 比仅用甘油作为 底物时均有提高 这些实验证明了有效还原力是1 3 一丙二醇发酵中的限制因素之一的假说 但由 于葡萄糖代谢产生的还原力不可能完全为1 3 n 醇的产生所利用 而部分甘油也会转化为生物 量和其他副产物 甘油摩尔转化率并没有达到理论最大值1 0 0 1 2 5 培养过程的优化 在发酵过程开发和优化方面 批式培养 补料批式培养 连续培养和二级连续培养等所有现 有的培养技术几乎都用到了 连续培养的生产强度要高于批式培养 但发酵液中的1 3 丙二酵浓 度却仅有批式培养的一半左右 g t t n e l 等人 1 9 9 1 分别用2 i 一搅拌式发酵罐和1 2 m 3 气井式发酵 罐研究了批式培养丁酸梭菌d s m 5 4 3 1 产生l 3 丙二醇的过程 1 3 丙二醇浓度可达5 0 巧8 9 l 生产强度达2 3 2 9 9 l m 在此实验中发现 通入惰性气体和改变转速对1 丙二醇的产生没有 明显的作用 反应器类型和规模也没有明显作用 但因为成本较低 气升式反应器的应用更受欢 迎 c r i n c r o l i 等人 1 9 9 8 用肺炎克氏杆菌a t c c2 5 9 9 5 在5 l 发酵罐中进行补料分批培养 1 3 丙 二醇浓度可达7 3 3g 儿 生产强度达2 5g a h m e n z e l 等人 1 9 9 7 j 田肺炎克氏杆菌d s m2 0 2 6 在 2 l 发酵罐中进行连续培养 1 3 一丙二醇浓度可达3 5 2 4 8 5g l 生产强度达4 9 8 8g t h 摩尔转 化率为6 3 p a p a a i k o l a o u 等人 2 0 0 0 分离到一株丁酸梭菌 利用工业甘油在一级连续培养中1 丙二醇浓度可达3 5 3 8g l 生产强度达5 5g 伽 在二级连续培养中1 3 丙二醇浓度可达4 1 4 6 g l 生产强度达3 4g 1 2 h a o e n i g l c 等人 1 9 9 3 q j 弗氏柠檬酸杆菌二级连续培养的方法 1 3 丙二 醇浓度达4 2g t 摩尔转化宰为6 2 但生产强度仅为2 1g 1 2 h 在扑料批式培养中 通过控制营养物质供应可以提高l 3 丙二醇的生产效率 s a i n t a m a h s 等人 t 0 0 4 用c 0 2 作为控制参数以确保在丁酸梭