基因工程的基本操作程序.ppt

复习 1 基因工程中基本工具有哪些 2 基本工具的作用和特点分别是什么 3 限制酶 DNA连接酶分别作用于DNA的什么部位 4 基因工程的基本步骤是什么 5 获得目的基因的方式有哪些 目的基因 1 质粒是基因工程最常用的运载体 它的主要特点是 能自主复制 不能自主复制 结构很小 蛋白质 环状RNA 环状DNA 能 友好 地 借居 A B C D C 2 下列不是基因载体必须具备的条件的是 A 能自我复制B 有多个限制酶切点C 具有标记基因D 它是环状DNA D 真核生物的基因结构 前体信使RNA 成熟的信使RNA 第二节基因工程的基本操作程序 一 获得目的基因 二 构建基因表达载体 形成重组DNA分子 三 将目的基因导入受体细胞 四 目的基因的检测与鉴定 基因工程的基本操作程序 用DNA合成仪人工合成 利用PCR技术扩增 已知序列 从基因文库获得 未知序列 一 目的基因的获取 目的基因即我们所需要的基因 基因组文库 含某种生物的全部基因部分基因文库 含某种生物的部分基因 如cDNA文库 cDNA文库基因组文库 从基因文库中获取目的基因 鸟枪法 散弹射击法 构建基因组文库并获得目的基因 基因组DNA文库的构建将总DNA经过酶解 分离不同长短的DNA片段 包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上 转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库 逆转录法 构建cDNA文库并获得目的基因 根据已知氨基酸序列直接合成DNA 化学合成 人工合成 核苷酸序列已知 把将要合成的DNA序列输入到DNA合成仪 用化学方法直接人工合成 聚合酶链式反应 PCR PolymeraseChainReaction KaryB Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法 此技术获得1993年诺贝尔化学奖 PCR的反应体系模板 DNA原料 四种脱氧核苷酸 酶 Taq酶 TaqDNA聚合酶 嗜热细菌中分离得到引物 DNA片段Mg2 维持酶活性所必需 PCR缓冲液 维持PH恒定 保护Taq酶 PCR反应过程可分为三步 变性 退火 延伸 1 变性双链模板DNA解离为单链结构 90 95 DNA双链 DNA单链 变性 2 退火引物与模板互补成双链 55 60 由于引物浓度高 序列短 所以易与模板结合 PCR反应过程可分为三步 变性 退火 延伸 引物 PCR反应过程可分为三步 变性 退火 延伸 3 延伸在Taq酶作用下 合成特异DNA序列 70 75 延伸 变性 第二次循环 退火 第二次循环 延伸 第二次循环 PCR反应曲线 理论上 PCR反应产物呈指数增长 但这种增长形式在扩增25 30个循环以后便放慢直至停止 达到反应平台 此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长 PCR仪程序设定 PCR的应用 PCR具有省时 操作简便 特异性强 灵敏度高 效率高 应用范围广等特点 PCR技术在分子生物学 医学和案件侦破等领域得到广泛应用 实例1 1 下列获取目的基因的方法中需要模板链是 A 从基因文库中获取目的基因B 利用PCR技术扩增目的基因C 反转录法D 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 二 基因表达载体的构建 形成重组DNA分子 切割目的基因和质粒的限制酶是同一种限制酶吗 同一种 目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并遗传给下一代 使目的基因表达和发挥作用 目的基因进入受体细胞内 并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 称为转化 常用的受体细胞 大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌 酵母菌 动植物细胞等 将目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞 有大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌 酵母菌和动植物细胞等 主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 导入方式 三 将重组DNA分子导入受体细胞 导入微生物细胞 将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤 1 获得目的基因和质粒载体 2 形成重组质粒 3 制备感受态细胞 用重组质粒转化大肠杆菌细胞 4 培养大肠杆菌 让重组质粒形成大量拷贝 5 筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞 导入植物细胞 土壤农杆菌转化法 土壤农杆菌 具有趋化性 酚 感染双子叶植物和裸子植物 基因枪法 单子叶植物常用的一种基因转化方法 但成本较高 花粉管通道法 十分简便经济的方法 我国的转基因抗虫棉就是用此方法获得 将目的基因导入动物细胞 方法 显微注射法 程序 重组DNA提纯取卵 受精卵 显微注射受精卵发育新性状动物 转基因动物 1 筛选含有目的基因的受体细胞 通过检测标记基因的有无 来判断目的基因是否导入受体细胞 1 抗药性筛选法 菌株为某种抗生素缺陷型 而质粒上带有该抗性基因 如抗氨苄青霉素 抗卡拉霉素等 如何筛选出含有目的基因的受体细胞 这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出 四 目的基因的检测与鉴定 pBR322质粒结构 标记基因 进行筛选 限制性内切酶 识别序列 外源基因连接 2 DNA分子杂交 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组DNA 用含目的基因的DNA片段 单链 用放射性同位素等作标记 以此做探针 使探针和转基因生物的基因组杂交 若显示出杂交带 表明染色体已插入染色体DNA中 过程 利用DNA分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆 检测方法 DNA分子杂交技术 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段 将两种生物的DNA分子的单链放在一起 如果这两个单链具有互补的碱基序列 那么 互补的碱基序列就会结合在一起 形成杂合双链区 在没有互补碱基序列的部位 仍然是两条游离的单链 2 检测目的基因的表达 检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质 目的基因成功表达的标志 体现特定性状 检测性状 3 鉴定 个体生物学水平 1 检测目的基因是否转录出了mRNA 2 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 方法 分子杂交 方法 抗原 抗体杂交 过程 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交 若出现杂交带 表明目的基因转录出了mRNA 回答问题 1 基因工程的别名 2 操作环境 3 操作对象 4 操作水平 5 基本过程 6 结果 基