固态发酵.doc

第十六章 固态发酵第一节 概述 固态发酵起源于中国，具有几千年的历史。近年来，由于固态发酵具有节水、节能的独特优势，属于清洁生产技术、逐步得到世界各国的重视。因此，本书从全新角度和从发展的观点来讨论固态发酵，以期使人们重新认识固态发酵。本着继承、发展和创新的观点，不仅对固态发酵基础理论进行分析，而且从固态发酵的典型应用过程上来说明。一、固态发酵的内涵 一般发酵工艺过程按照培养基物理性状不同，将发酵方式分为两大类：固态发酵和液态发酵。液态发酵主要有表面发酵和深层发酵 而一切使用不溶性固体基质来培养微生物的工艺过程，称之为固体基质发酵(so1id substrates fermentation)。按照这样的理解，既包括将固体悬浮在液体中的深层发酵，也包括在没有(或几乎没有)游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。而对于固态发酵来讲，是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程。由于人们对于固态发酵传统的认识是从固体基质开始，它既是微生物生长代谢的碳源能源，又是微生物生长的微环境，上述对于固态发酵的定义难以反映出固态发酵的科学内涵。从生物反应过程的本质考虑，固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程，与此相反，液态发酵是以液相为连续相的生物反应过程。从这个定义中可以充分认识固态发酵的特点以及液态发酵本质的区别（图1.1）。二、固态发酵的特点 固态发酵是气体作为生物反应过程中的O2、CO2、热量、营养和产物的传递介质，表现为O2、CO2扩散比较容易，热量传递困难，存在明显的营养梯度，并且无大量有机废水产生。三、固态发酵与液态发酵比较分析固态发酵与液态发酵本质区别是以气相还是以波相为连续相的差异，具体表现是固体发酵基质中游离水的多少。固态发酵中微生物生长在缺乏或几乎缺乏不可见液体水的颗粒之间，在固态发酵系统中，微生物可以从湿的基质颗粒中获得所需的水分。固体发酵基质的含水量可以有效控制在1280之间，大多含水量在60左右。与固态发酵相反，典型的深层液体发酵的发酵液中台有5左右的溶质，至少有95的水。当前发酵工业所使用的主要是深层液态发酵，尽管这种技术已经经过了较长期的使用和研究，但是，它仍然存在着许多难以克服的缺点，需要采用新的技术加以解决。表 1.1 固态发酵与液态发酵的比较续表1.1第二节 固态发酵的分类一、传统固态发酵与现代固态发酵虽然固态发酵与液态发酵相比，具有它独特的优势，但也存在着许多不足。特别是传统固态发酵是发酵工业中古老而又落后工艺的代名词。甚至，在发酵工程或生化工程的教科书中，也很少提到固态发酵。现代发酵技术的关键条件是纯种大规模集约化培养随着科学技术发展和可持续发展的影响，国内外逐步重视对固态发酵的研究开发，已取得了很大进展。因此，依据固态发酵过程中是否能实现限定微生物纯种培养，分为传统固态发酵与现代固态发酵。现代固态发酵是为了充分发挥固态发酵的优势，针对传统固态发酵存在的问题，使之适应现代生物技术的发展而进行的，可以实现限定微生物的纯种大规模培养。表1.2 现代固态发酵与传统固态发酵二、固态发酵的形式1，按微生物的情况和形成的产品条件不同分类 固态发酵可以以许多不同的形式进行，按照使用的微生物的情况和形成的产品条件不同，固态发酵可分为自然富集固态发酵、强化微生物混合固态发酵、限定微生物混合固态发酵和单菌固态纯种发酵。 自然富集固态发酵是指利用自然界中的微生物，由不断演替的微生物进行的富集混合发酵过程。典型的例子是传统酒曲和酱油、腌莱、烟草发酵、茶叶发酵、青贮、堆肥等。它不需要人工接种微生物，其所需发酵的微生物主要依赖于当地空气和物料中的自然微生物区系，多种微生物演替成最适于生长代谢或共生协作的小生态环境。其微生物富集区系不仅与当地空气和物料中的自然微生物区系有关，而且与小生态环境自然变化密切相关。强化微生物混合固态发酵是指在自然富集固态发酵的基础上，根据人们部分掌握的微生物代谢机制，人为强化接种微生物茵系不明确的富集培养物或特定微生物培养物所进行的混合发酵过程。强化微生物混合固态发酵除应用于沼气发酵、白酒发酵作用外，在石油采收、湿法冶金、食品发酵等领域同样显示其优势。人们在长期的科学研究和生产实践中却不断发现，不少生命活动及其效应是借助于两种以上的生物在同一环境中的共同作用下进行的，甚至是单独不能或只能微弱进行的。例如废物的处理，纤维索和本质素的降解，甲烷的产生和利用等。自然界的微生物没有一种是单独存在的，单靠纯培养很难反映它们的真实活动情况。因此，强化微生物混合固态发酵微生物资源具有非常广阔的应用前景。 限定微生物混合固态发酵是在对微生物相互作用和群落认识的基础上，接种混合培养的微生物是已知和确定的，通常使用两种或两种以上经过分离纯化的微生物纯种，同时或先后接种同一灭过茵的培养基中，在无污染条件下进行的固态发酵过程。人类对微生物的利用经历过天然混合培养到纯种培养两个阶段，纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面，能够不受干扰地对单一目的菌株进行研究，从而丰富了人们对微生物形态结构、生理和遗传特性的认识。但是，在长期的实验和生产实践中，人们不断地发现很多重要生化过程是单株微生物不能完成或只能微弱地进行的，必须依靠两种或多种微生物共同培养完成。虽然微生物混合培养在很多领域中的作用已得到充分肯定，部分成果己成功应用于实践，但对大多混合菌体系中菌间相互关系和作用机制的研究尚不够深入。因此，目前对于具有协同作用关系的菌株筛选和组合还是一个随机过程的，缺乏有效的理论指导，而且对于已经应用的混合培养体系也不能有效地协调菌间的关系，使其达最佳生态水平，发挥最大效应。这严重地阻碍了混合菌培养的发展和应用。因此，如果从生理、代谢和遗传角度对混合茵间关系和协同作用机制进行深入研究，对混合菌培养的理论和应用都将有巨大的突破。随着混合菌培养在各方面应用研究的深入，人们不再满足于传统的反应模式，已开始引人一些新兴的生物工程技术，使该领域的研究更具活力。采用固定化细胞技术固定混合菌可使反应系统多次使用，降低成本，增加效率，在实际应用中很有意义。利用细胞融合技术和基因工程技术由具有互生或共生关系的微生物构建工程菌，可使工程菌既具有混合培养的功能，又拥有纯培养菌株营养要求单一、生理代谢稳定、易于调控等优点，也是极有前景的研究方向。 单菌固态纯种发酵是在纯培养基础上建立起来的，对于选育良种、保持生理活性和代谢过程中的稳定起很大作用。它对于扩大固态发酵的应用范围和潜力的发挥起到非常重要作用，同时，也是固态发酵一个重要方向。2，按固态发酵固相的性质分类 根据固态发酵固相的性质，可以把固态发酵分为两种类型。一种是以农作物(如麸皮、豆饼等)为底物的固态发酵方式。这些底物既是固态发酵过程中的固相组成部分，又为微生物生长提供营养，在这里可以称这种发酵为传统固态发酵方式(或固体底物基质固态发酵)。另一种固态发酵方式是以惰性固态载体为固态发酵过程令的固相，微生物生长的营养是吸附在载体上的培养液，称这种发酵方式为惰性载体吸附固态发酵。 同体底物基质固态发酵利用的培养基是既充当固相，又为微生物生长提供营养的初级农作物产物，如麸皮、马铃薯、谷子、豆饼以及其他含淀粉和纤维素的农作物产品。第二种固态发酵采用的固体是惰性载体，这些载体可以是天然的，也可以是人工分成的。这些载体材料有大麻、珍珠岩、聚氨酯泡沫体、蔗糖渣和聚苯乙烯等。 固体底物基质固态发酵的一个主要的不足之处就是碳源是它们的结构组成部分，在微生物发酵生长过程中，培养基被分解了，底物容易结块，孔隙率也降低，结果底物的外形和物理特性都发生了变化，降低了发酵过程中的传质和传热。例如，麦片在发酵过程中由于淀粉的降解和水的挥发，会导致固体底物变形结块，结果使传质和传热受到影响。而具有稳定结构的固态载体充当固态发酵的固相可以克服这一缺点，从而更有利于微生物的生长和产物产量的增加。例如，采用聚氨酯泡沫体为载体吸附固态发酵核酸酶P1时，产量和活力分别比采用麸皮固态发酵提高9倍和4倍。 另外，惰性载体吸附固态发酵与固体底物基质固态发酵相比，还具有产物提取简便的优点。可以很容易地从惰性载体中提取到胞外产物，而且所得到的产物含有较少的杂质，载体还可以重复使用。例如，利用聚苯乙烯作为载体，以肋生弧茵产生L-谷氨酰胺酶时，产物比采用麦麸粉固态发酵时得到的产物黏性要低。另外，前者的产物不含蛋白质污染物，而后者含有多余的淀粉酶和纤维素酶等。与固体底物基质固态发酵相比，惰性载体吸附固态发酵还具有其他很多优点，如：能够对培养基营养成分进行合适的调节；容易了解产物中的各成分并进行分析，从而有利于发酵过程的控制以及动力学研究与模型建立等。第三节 固态发酵反应器 生物反应器提供生物生长的环境，可以阻止外物进人和内部物质的外溢，必须无毒、耐振动、不易腐蚀，有良好的搅拌、通气、散热、冷却系统，能够进行无菌操作。固态发酵不同于深层液态发酵，反应基质以固态形式存在，反应体系内的传递过程极其复杂，包括气固、气液、液固等形式，气相是其最主要的流动介质，因此固态发酵生物反应器与液体发酵反应器有着显著的区别，而目的限制固态发酵反应用于现代生物反应工程的一个重要因素就是适用的固态发酵反应器。 迄今为止已有许多类型的固态发酵反应器问世(包括实验室、中试、工业生产规模)。B.Lonsane曾经归纳出了九种不同形式的工业规模的固态发酵反应器；转鼓式，木盒式；加盖盘式；垂直培养盒式，倾斜接种盒式，浅盘式，传送带式；圆柱式；混合式等。K.E.Aidou也提出了十种不同形式的固态发酵反应器，但以基质的运动情况则可以分为两类：静态固态发酵反应器，包括浅盘式和塔柱式反应器；动态固态发酵反应器，包括机械搅拌的筒柱式、转鼓式反应器等。第一类反应器内发酵基质在发酵过程中基本处于静止状态。其优点是结构简单，操作方便，放大问题小；其明显的缺点是：由于发酵基质的相对静止，热量、氧气和其他营养物质的传递困难，从而导致基质内部温度、湿度、酸碱度和菌体生长状态的严重不均匀。第二类反应器中的基质处于间断或连续的运动状态而强化了传热和传质，设备结构紧凑，自动化程度相对较高，但由于机械部件多，结构复杂，灭菌消毒比较围难，固态基质的搅拌能耗过大，发酵物料的持续运动有可能会破坏菌丝体，从而影响菌体的生长与代谢。对于实验室规模的发酵过程，搅拌所起的作用(如促进物质传递，使发酵基质内部参数均匀)不一定十分显著，因而这种设备的放大是一个突出的问题。无论何种形式的固态发酵反应器，都必须考虑以下几个方面的问题：接种技术；灭菌方式；发酵基质的特性；供气手段；参数的测量和控制；取样分析技术；结构简单，操作方便。 固态发酵由于其基质以固态存在，所以不能像液体发酵那样可以用摇瓶进行大量的基础研究，而只能依靠设计合理、控制手段完备的固态发酵反应器。固态发酵反应器主要由两部分组成，即反应器主体和供气、控温、保温系统，后者的主要目的是保持发酵系统的需氧状态和调节发酵基质的温度和湿度。一、静态固态发酵反应器与动态固态发酵反应器1，静态固态发酵反应器 目前静态固态发酵反应器(见表1.3)在实验室研究中应用较为普遍，尤其是圆柱式的固态发酵反应器。文献报道的系统多是将一个或多个静态圆柱式反应器平行放在一个恒温箱中并通以饱和空气。其优点是：系统简单，廉价，操作方便；克服固态发酵无法用摇瓶法作大量基础研究的缺点，同时可作多条件的平行实验并且温度、湿度等条件均一；系统易灭菌。其缺点是：无法准确控制气体和物料的湿度，只能供饱和湿空气；无法取样分析；放大过程中难以消除床径扩大的影响。静态固态发酵反应器无论体积、高径比如何变化，其基本形式是不变的但供气、保温、控温系统却是千差万别的。完善的固态发酵供气、保温、控温系统应有以下持点：测量并控制进气组成、湿度及温度；测量尾气组成并反馈调节进气组成、湿度和温度；在较大规模应用时采用循环供气；完善的气体过滤设备。具体应用时，应根据研究目的加以简化，以求经济节约。表1.3 静态固态发酵反应器2，动态固态发酵反应器(1)转鼓式 其基本形式是将一个圆柱形(鼓形)容器支架在一个转动系统亡，转动系统主要起支撑及提供动力这两种作用。文献中报道的各类转鼓式发酵器转动速率一般为116rmin，甚至可以达到188rmin。这类反应器都有进、出气体设备，空气人口管装在容器底部，或者以多个支管分布于容器内各处，支管上有许多喷气口，有时还要在进气口的相对位置安装一个排气扇。空气进入发酵器之前先通人浓硫酸中，然后经过一个注有无菌水的增湿设备。(2)带机械搅拌的筒柱式 其特点是发酵器主体静止不动，而容器内的搅拌器使发酵过程中的物料处于连续的运动状态，在反应器的一端有取样、加料和通气口。灭菌方式为直接通气灭菌。 以上两类发酵器内微生物生长较快并且均一，放大过程中所遇到的困难是由于物料运动导致在生长过程中菌丝被伤害，这个问题的严重性随着发酵器容积的增大而增加。此外，在放大过程中还会存在发酵体系温度控制、保持不染菌、发酵基质聚集成球状而影响传质传热等诸多方面的问题。(3)搅拌运动的盘式固态发酵反应器 通常盘式反应器长2m，宽0.8m，深2.2m。三个并排的螺旋式搅拌器在以65cmmin的速度水平运动的同时，还以22rmin的转速自转。在搅拌器载车上还有两个喷口，用于补料加水。盘式反应器底部由两层金属网制成，过滤空气由底部均匀进入1m厚的发酵基质。其缺点是：不能用于无菌操作过程，只能用于自然发酵和混合发酵过程。本系统易于放大。表1.4动态固态发酵反应器类型及优缺点二、实验室固态发酵反应器、中试固态发酵反应器与工业级固态发酵反应器按照固态发酵反应器所承载的固体物料多少不同，可将固态发酵反应器分类为三大类：第一是实验室固态发酵反应器，可进行克级规模固体物料的固态发酵实验；第二类是中试固态发酵反应器，一般进行千克级固体物料的固态发酵试验；第三类是工业级固态发酵反应器，可应用于工业生产，承载吨级固体物料。三、固态发酵研究取得的主要进展1，由敞开式发酵到封闭式发酵敞开式发酵虽然投资少、操作方便，但大规模生产有散热困难、易污染等问题。Nishio等设计了转鼓式发酵罐；viesurs等人设计了一种特殊的卧式发酵罐。这类封闭式发酵罐可以彻底灭菌便于控制发酵罐中的温度。2，从经验发酵到控制发酵 液体发酵可实现电子汁算机控制，对发路过程中的参数实现预测。但在固态发酵中最近也取得了一定的进展。基质含水量是决定固态发酵成功与否的关键因素之一，起始含水量通常控制在3075范围内。在固态硫化床反应器中，培养基的水分依据硫化层内的电极和塔壁间静电容量值，从喷嘴喷出无菌水雾加以控制。在厚层通风池中固态发酵，其培养温度可通过继电器控制池内温度保持在30左右。在固态发酵中，真菌的菌丝穿插于基质之间，吸附性强。多数常规方法都无法使用。现常用间接测定方法，如；测定菌体蛋白质，测定氧摄人、二氧化碳的排出、ATP含量和葡萄糖胺含量，测定某些酶的活性(同菌体量成正比的酶)等方法。虽然pH值也是影响菌体生长代谢的关键因素之一，但固态发酵的某些基质的优良缓冲性能帮助减少对pH位控制的需要。3，从浅盘式发酵到机械化发酵 中国现在酿造业的固体曲制备以采用厚层通风池发酵，这些发酵设备占地面积大、劳动强度大。前苏联已研制出密闭的柱形固态发酵罐，完全机械化操作，日发酵1000Kg物料。中国己研制出可装料800kg的圆片制曲机，能半机械化连续操作。4，从固态单菌发酵到固态混合发酵 由于纯种培养技术的迅速发展而一度受到冷落的混合培养技术，现又逐步受到重视。在这些天然混合物和非均质的基质中，几种微生物能找到最适于发育和共生协作的小生态环境。由于同时利用不同菌株进行共同培养，增加了培养物的基因库容量、从而可以通过不同电极能力组合，完成单菌难以完成的复杂的转化过程，达到提高基质产率和生产效率等目的。并且，这样的工艺可以用来代替遗传工程菌来进行复杂的多种反应。这时的混合培养不再是粗放的、不加控制的系统，5，从堆积发酵到流化态发酵 固态生化反应器由简单浅盘发酵到机械化发酵罐，它们还都是堆积发酵。现日本已兴起流化床培养，活力可提高到510倍。6，从上游过程和下游过程分别操作到组合操作 发酵工业过程主要由发酵过程（也称上游过程）和产物分离过程(下游过程)两部分组成。现大多数工业是把发酵过程和产物分离纯化过程分别放在不同操作单元中完成，并前后连接成一个整体。若把发酵过程和产物分离纯化过程两者结合在一起，在同一单元操作中同时进行，则表现比许多优势。例如，可减少反应产物对反应的反馈抑制；打破反应的平衡态使反应不断地向生成产物的方向进行；可提高原料的利用率和转化率；提高发酵器生产能力；减少产物分离纯化的费用和降低生产成本等。李永泉等已进行肌昔发酵和分离组合过程优化条件的研究，使平均产甘率提高了65.2，基质利用串提高56.45。第四节 固态发酵的应用一、固态发酵的产品固态发酵可利用多种工农业残渣作为底物大量生产化学物质，如乙醇、单细胞蛋白、蘑菇、酶制剂、有机酸、生物次级代谢产物等高价值产品，所以固态发酵被认为是可再生性资源综合利用最有希望的途径。固态发酵产品主要涉及有机酸、生物燃料、生物活性物质、风味物质及其他物质。 1，有机酸有机酸是羧酸(RCOOH)、磺酸(RSO2OH)、亚磺酸(RSOOH)、硫代羧酸 (RCOSH)等的总称。很久以前人们已开始研究利用微生物发酵生产有机酸以代替从水果、蔬菜等植物中提取有机酸的方法，有机酸都是微生物的初级代谢产物，与人们日常生活、工业生产有着十分密切的关系，也是发酵工业小历史上最悠久、价格最低的产品。由于它们的原料是可再生物质，与化学合成相比，发酵更适合食品、医药等部门。近几年微生物育种和工艺方面的进步，使用固态发酵生产的传统发酵工业仍具有强大的生命力。乳酸、柠檬酸很久以前就达到了固态发酵工业化生产。近几年陆续有文献报道，人们开始利用固态发酵技术探索生产富马酸、草酸、亚麻酸等(见表16)。下面主要谈及乳酸与柠檬酸的研究进展状况。 乳酸是一种历史悠久的微生物发酵产物，酸奶可能是人类历史上第一个发酵食品。用丝状真菌或细菌菌株都可以进行固态发酵生产乳酸。其底物广泛，可用农作物(如树薯、甜菜等)，也可用残渣(如甘蔗渣、胡萝卜加工废渣等)。Soccol利用R.oryzae比较了固态与液态发酵生产乳酸，固态发酵惰性支持物由营养盐与甘蔗渣组成，结果证明固态发酵生产水平及生产率均高于液态发酵。Richter利用细菌L.paracasei比较乳酸固态及液态发酵，得到同样的结论。液态发酵乳酸浓度，产率，周期分别为88106gL，91，2432h与之对应固态发酵分别为90gkg，9195，120200h。 柠檬酸是十分重要的有机酸，它原来是从柠檬中分离得到的，广泛应用于食品、洗涤剂、医药工业。一般用黑曲霉(Aspergillus niger)或假丝酵母(Candida sp.)液态发酵生产。但固态发酵可用农业残渣作碳源，生产柠檬酸具有很大的潜力。利用固态发酵生产柠檬酸，几乎所有生产都利用农作物作底物，菌株为黑曲霉。发酵底料中加甲醇可大大提高柠檬酸的产量。Leangon研究了糖酵解率对柠檬酸及草酸的影响，指出柠檬酸过量产生与通过糖酵解流加葡萄糖有关，流加率较低时，柠檬酸聚集增加。2，生物活性物质所谓生物活性物质就是微生物在代谢活动过程中所产生的次级代谢产物。次级代谢产物是微生物在细胞分化过程中产生，往往不是细胞生长所必需的代谢产物，对细胞不具有明显作用而且通常由一簇结构相似的化合物组成。但微生物可产生的生物活性次级代谢产物拥有医疗作用，具有重要的工业价值。Balakrishnan等论述了利用固态发酵技术进行生产次级代谢产物不同策略与过程。尽管人们已实现了采用固态发酵技术生产高价值生物活性次级代谢产物，但是在商业化方面，还有许多工作要做。抗生素、霉菌素、细菌内毒素、植物生长素、免疫类药物、生物碱等都是重要的生物活性次级代谢产物，它们已成功利用固态发酵生产。抗生素包括：青霉素、头孢菌素、四环素、金霉素、土霉素、伊枯草菌素、枯草菌溶血素、放线菌紫素、次甲霉亲、单菌素及环孢素等。抗生素是人类使用最多的一类药物，已有100多种抗生素被商品化生产，为人类防治疾病作出了巨大贡献。近年来，有些研究集中在利用固态发酵生产抗生素，对以上抗生素研究大多用农业剩余物，仅少数用甘蔗渣或紫菜惰性支持物；伊枯草菌素、枯草菌溶血素用细菌类菌株，其他抗生素用丝状真菌菌株。伊枯草菌素是一种有力抗真菌类素有效地抑制植物病原体，固态发酵生产这种抗生素常用底物为麸皮或豆腐渣，固态发酵比液态发酵效率高68倍。Yang 等研究用纤维素作底物固态生产四环素，发酵周期8d，可得四环素1011mgkg底物。枯草菌溶血素是一种血纤维蛋白抑制剂，可用重组细菌固态发酵技术生产，固态发酵为液态发酵45倍。环孢素具有抗真菌、抗寄生虫、抗炎症及免疫抑制功能，是人类移植不可缺少的药物。环孢素绝大部分是用液体发酵生产，但现在国外开始研究用分离菌 (Tolypocladium sp.)作菌株固态生产环孢素，结果表明在最优条件下，环孢素可大量生产。3，风味化合物风味化合物是指具有芳香味的物质。大部分风味化合物是通过化学合成或天然物的萃取得到，但目前市场调查表明消费者偏爱贴有天然标志的食品。植物是食油、香料的主要源泉，但它们受天气、植物病等天然条件的制约。生产风昧化合物一个替代路线就是用微生物合成或转化。目前、已知道几种微生物(包括细菌、真菌)拥有合成不同风味化合物的能力。用这些微生物液态发酵生产风味化合物生产率低，不利于工业化，但固态发酵可能有高的生产率，引起不少国外学者的兴趣，发酵底物可为树薯残渣、甘蔗渣、咖啡壳等热带农业剩余物。Ferron等综述7微生物发酵生产风味食品的可行性，提倡用固态发酵生产，用自然物为底物固态生产可以将低成本、优质的产品服务于人类。然而，这种生产过程的困难在于分离、回收发酵目的物，至今在这方面仍无较大进展。吡嗪是杂环化合物、拥有坚果、烧烤风味，可作食品添加剂，特别是烷基吡嗪经常在食品中见到。可利用菌株B.natto或B.subtilis固态发酵底物大豆生产这些化合物。众所周知，脂是芳香化合物源泉。在ceratocystis类微生物中，甘薯黑疤病菌(C.fimbriata)具有台成脂的巨大能力，其固态发酵底物可为树薯残渣、苹果渣、大豆、咖啡渣等，生长迅速，接孢子能力强，可产多种风味化合物如菠萝味、水果味化合物。Medeirns等利用菌株马克期克鲁维酵母马克斯变种(Kluyveromyces maxianus)进行不同的底物(树薯残渣、麸皮、苹果渣、甘蔗渣、向日葵等)固态发酵生产风味化合物尝试，结果证实了树薯残渣、麸皮生产风味化合物的可行性。4，其他生物产品大量的文献表明，固态发酵应用于其他各种各样的产品生产，如生物表面活性剂、麸酸胺、色素、维生素、类胡萝卜素、黄原胶等。生物表面活性剂具有低毒、低降解率、利于环境等优点，因而引起学者们的关注。传统生产方法是微生物分解碳氢化合物，与化表面活性剂相比成本较高。但现在，可以利用固态发酵成功生产表面活性剂。这种方法利用残渣，成本大大下降，具有相当大的吸引力。利用一株短杆菌(Brevibacterium sp.)，以接种葡萄糖、尿素、维生素、食盐等物质的甘蔗渣为底物，可固态生产麸酸胺，产量高达80mgkgSDM(干发酵底物)。甘蔗渣作底物，也可用红曲霉(M purfureus)固态生产红、黄色素，转鼓培养比静态培养产量高得多。黄原胶、琥珀酰聚糖是外切糖类化合物。日前，国外对此类化合物研究进展相当快。固态发酵生产外切糖类化合物的底物相当广泛，如谷物废渣、苹果渣、葡萄渣、柑橘渣等。利用上述底物，固态发酵在生产糖类化合物方面，完全可以与液态发酵媲美。可利用微生物野油莱黄单胞菌(Xanthomonoas campestris)固态生产黄原胶。水溶性维生素(B2、B6、B1、核黄素、烟酰胺等)都可以用固态发酵方法生产，菌株可用少孢根霉，少根根霉Mf)、葡枝根霉等。二、固态发酵技术在资源环境中的应用研究随着人口增长及人类生产和生活活动的增加，人类的物质文明和精神文明得到了很大的提高，许多发达国家已提出绿色生产这一概念(即工业的生产不对环境造成危害或减小到最低的工业过程)。但是在人们对资源环境质量的要求越来越高的同时，资源环境受到的威胁及破坏也越来越严重。微生物在资源环境中扮演着十分重要的角色，在环境保护中作出了巨大的贡献。微生物在资源环境保护中的应用已从自然生态系统发展到活性污泥方法处理废水，并进一步扩大到工农业残渣转化、固体废物处理及生物修复等领域，这样固态发酵技术作为潜在的有力工具引起人们的密切关注。固态发酵是解决能源危机、治理环境污染的重要于段之一 ，是绿色生产的主要工具。农业、林业和食品等工业部门的许多废弃物，对环境造成了巨大的污染。但工农业残渣常含有丰富的有机酸它们可以作为微生物生长理想的寄生体，所以人们倾向于筛选工农业残渣作底物，对其加以综合利用不但可以使废弃物变为含经济价值的资源，而且可以减轻环境污染。本书主要述及生物燃料、生物农药、生物转化、生物解毒及生物修复研究方面等。1，生物燃料用工农业残渣固态发酵生产生物燃料主要为乙醇，即酒精。酒精是产量最大的发酵工业产品，是清洁燃料工业的代表，主要原料为各种可再生性糖类物质(如天然纤维素)。当前地球上“温室效应”增强的罪魁祸首是CO2，所以，如果能找到一种不增加大气CO2含量的燃料来代替化石燃料，那么就可以有效地控制“温室效应”目前能满足这种需要的就是燃料乙醇。乙醇是可再生性能源，利用固态发酵方法有许多优点，如：可消除糖的萃取过程，节省成本；发酵过程消除水的增加，降低发酵罐体积，无废水；降低能耗等。这是一个有潜力的生产乙醇路线，国外对其研究相当多，大多利用酵母菌发酵，们也有研究用代谢葡萄糖的细菌菌株如运动发酵单胞菌。纤维素原料是地球上最丰富的，并且每年可再生的有机物质。充分利用生物技术把再生资源转化为有高价值物质，完全可以减轻人类面临的能源、环境危机。很多学者从不同的角度研究利用苹果渣固态发酵生产乙醇，取得较好效果，发现酵母菌发酵生产乙醇优于苹果渣自然发酵，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最理想的菌种。Roukas利用稻壳作底物，发现底料有无灭菌不影响乙醇的产量，此种方法值得借鉴。也有一些学者利用淀粉作底物进行乙醇固态发酵、证明用Schwanniomyces castellii固态发酵可有效利用淀粉，提高生物积累量，促进淀粉水解，乙醇产量相应增加。淀粉底物可以是高粱、土豆、麦粉、玉米粉、可溶性淀粉等，但若用酿酒酵母作菌种，玉米粉、高粱固态发酵产乙醇效果最好。2，生物农药人们希望找到一种既不污染环境，又可杀死害虫的办法。最近，大量的文献表明，人们越来越重视利用昆虫病原休真菌及寄生真菌来控制害虫的方法。Deshpande综述利用固态发酵生产真菌杀虫剂的方法，与液态发酵相比不仅生产成本大大降低，而且药物对害虫的毒力极大的提高。筛选具有杀虫能力的真菌是开发可感染繁殖体(如分生孢子、芽粉孢子、衣原体孢子、卵孢子、受精卵孢子等)的第一步，对真菌与害虫的作用机理是生产有效生物农药的主要研究领域。soccol1与Desgranges都研究出种利用微生物固态生产可感染繁殖体球孢白僵菌的方法，这种繁殖体可以控制香蕉、甘蔗、大豆、玉米及咖啡上的虫子。silman R W等利用固态蛭石与似珍珠粒状琼脂混合固态发酵产生芹菜炭疽真菌 (一种威力极强真菌病原体除草剂)，其田间杀虫效率比Beauveria bassiana高25%。目前国内外一个热点就是苏云金芽抱杆菌（简称Bt ），该菌适合在廉价的培养基上大规模生产，对哺乳动物和其他脊椎动物无害，无致癌和无致畸作用。在国际上被列入现代农业三大组成之一，先后也被中国列入团家“863”计划，”七五”、“八五”、“九五”重点科技攻关项目，最近还被列入国家“火炬”计划。中国现在这一领域实现了突破中国科学院过程工程研究所发明的“压力脉动固态发酵反应器”已成功工业化生产Bt，Bt毒力达到10000IUmg，在国际上处于领先地位。现已在安微建立了示范工厂，通过了国家鉴定，并己成功地推广到山西、河南、吉林与山东等地区，年产值达l亿多元。3，生物转化 固态发酵其中一个重要应用领域就是利用微生物转化农作物及其废渣，以提高它们的营养价值，减小对环境的污染。牛物转化利用的菌株常为白腐菌。木薯是非洲、亚洲及南美洲地区人民最重要的食物之一。但它蛋白质、维生素、矿物质含量低，也缺乏含硫氨基酸。已有几种固态发酵方法可以改善其营养价值。soccol等对木薯及其残渣作了大量的研究，筛选了几种特别适于生长在木薯上的根霉菌(Rhizopus sp.)菌株。蘑菇是可食用丝状真菌十分典型的代表，拥有可把许多不能食用的植物或其剩余物降解转化为有食用价值的食物的能力。目前发现的可食用蘑菇大约有2000多种，其中大约80种已实现实验室成功培育，大约20种已利用固态发酵技术商业化。木质纤维素作物剩余物是动物饲料具有潜力的源泉，主要由纤维素、半纤维素及部分木质素组成，其蛋白含量低、难消化、味道差等特点限制了它们作为理想饲料的应用。要提高它们的利用价值，就必须改变其营养含量，可用物理、化学或生物方法等。但物理、化学方法能耗高、比较昂贵，所以人们更倾向于生物方法，在这一方面固态发酵特别有潜力。现在人们已成功利用白腐菌可把木质纤维素转化为蛋白含量较高的饲料，并利用菌株侧耳(平菇)及香菇(香聋、冬菇、椎茸对咖啡渣进行固态发酵，成功生产出蘑菇。 其他类作物残渣也可被用来生产高蛋白物质或单细胞蛋白，如：柑橘皮，黑麦，芒果与海枣工业废渣侧耳(平菇)，甜菜根，麦草（白腐菌）侧耳(平菇)，或苹果渣黑曲霉AM45er)与产朊假丝酵母共培。上述发酵成品提高了蛋白质含量，更利于动物消化。4，生物解毒 某些工农业残渣含对人体有副作用或可造成营养不良的化合物，如咖啡因、氰化氢、聚苯化合物、鞣酸等，对这些残渣有效利用十分困难。由于它们可导致严重环境问题，所以对它们的处理对加工业来说是十分头疼的事。最近，固态发酵已成为对木薯皮、油菜籽粉、咖啡皮、咖啡浆等残渣有效的解毒工具，并有一些成功的例子。Ofuya等研究了固态发酵对木薯皮有毒成分的影响，结果表明HCN降低95，可溶鞣酸减少了42，同时也研究6种菌株白地霉，总状毛霉，好食脉孢霉，米根霉 ，匍枝根霉及芽泡杆菌对木薯皮固态发酵的影响，得出结论：微生物的培养与活性对于木薯皮有毒成分降低程度起十分重要的作用，不同的微生物引起的效果相差较大。Bau研究了利用少孢根霉对脱脂油菜籽这种有毒物质进行的固态发酵。结果发现发酵24h就可以降解脂肪族芥子油苷大约58%吲哚族芥子油芥降低97。人们一般认为大麻味道美、有营养，好种植，但种子含有一种可造成神经中毒的氨基酸当这种物质过量食用时可导致无法医治的头脑性麻痹瘫痪这一点限制了这种食物的应用。Kuo等尝试先用黑曲霉进行固态发酵48h，再用污水生物发酵48h，以消除种子中这种有毒物质，结果发现除了改善种子其他成分质量外，有害氨基酸也降低了90%。在加工咖啡果过程中，会产生大量的咖啡肉桨与咖啡壳，这些物质含对生理有副作用的成分，如咖啡因、聚苯化合物、鞣酸等。为了处理上述物质人们尝试了许多方法，如把它们变为肥料、饲料、复合肥等。但是，它们仅仅利用部分物质且效率低。为了提高利用率，人们又进行了大量的探索，如利用这些物质生产酶、有机酸、调味品、胺类化合物及蘑菇等。咖啡因是自然界中最易令人上瘾的兴奋剂物质之一，若浆、壳中咖啡因含量大于13(以干重计)，会引起轻微的刺激作用。鞣酸通常被认为是造成营养不良的因素，动物饲料一般含鞣酸小于10。人们经常用丝状真菌固态发酵技术对咖啡壳进行去毒。Boccas F等利用咖啡壳琼脂培养基，筛选出三株根霉类菌株，并与两株担子菌黄孢原毛平革茵在降解咖啡因与鞣酸方面进行比较，结果发现这5株菌都生长相当好。但根霉类菌株发酵周期短且在最优发酵条件(PH值、湿度、接种量、温度及通风性等)下，降解咖啡因87，鞣酸65，而黄孢原毛平革菌降解率分别为70，60。一些细菌或丝状真苗如凝结芽孢杆菌，铜绿假单胞菌，恶臭假单胞茵，类地青霉，皮落青霉与侧耳等都有降解咖啡壳的能力。人们研究了微生物疣孢青霉在有或没有外界氮源情况下对咖啡浆的固态发酵。结果表明，尽管无外界氮源供应，微生物生长缓慢，但咖啡因降解十分完全，含氮化物的添加反而抑制咖啡因的降解。国外有学者研究青贮饲料咖啡浆生物降解，数据表明在不同条件下。咖啡因可降低1360、聚苯化合物降低2870，鞣酸降低5l%81。这证实利用青贮饲料固态发酵是处理咖啡桨中有毒物质的理想方法。5，生物修复生物修复是利用微生物及其代谢过程(其产物消除或在体内富集有毒物质)来修复被人类长期生活和生产所污染和破坏的局部环境，使之重现生机的过程。这是一个古老而新鲜的课题，由于目前环境污染日益严重，国外学者对生物修复研究相当投人。固态发酵生物技术是有毒化合物生物降解与环境生物修复的有益工具。如：把凤尾菇接种到棉花或麦草混合物k可以降解莠除净，这样可通过微生物降解来达到生物修复的目的。很久以前，Berry等就指出利用固态发酵技术可处理杀虫剂残留物。他们比较几种除去莠除净方法，发现固态发酵可大大降低杀虫剂生物利用率。wieschc等把污叉丝孔茵及侧耳接种到染有“14C芘的麦草上，研究芘的生物降解固态发酵两步法，结果表明可以把丝状真菌与土壤自然微生物结合起来，实现对芘进行生物降解。第五节 固态发酵发展趋势和应用前景固态发酵近几年在有机酸、酒精、生物活性物质、风味物质及其他类化合物领域的研究得到迅速发展及应用，但上述研究均处在实验室研究阶段。 固态发酵是解决当前人类所面临的“三大”危机的一个有效丁段。当前，许多工农业残渣、城市生活垃圾已成为人们的社会公害，对人类的生存外境均产生不利的影响。随着人们对固态发酵机理认识个断加深v现代固态发酵技术可以将这些材料进行降解、修复、转化为对人们有益或无害的物质。既无损于既定自然生态系统又可以成功解决环境问题、减轻资源危机。固态发酵应用具有巨大的潜能、但与液体发酵研究相比，固态发酵在传质、传热等方面缺乏有效的研究，难以实现工业化大规模的生产。其原因主要为：通风散热困难；易染茵；基质利用率低；缺少固态发酵反应器设计和放大的统一标准；缺少完善的传质、传热数学模型；检测手段不完备等。第十七章 发酵经济学第一节 引言在价格竞争的市场经济状态下，用发酵方法生产产品时，则所用的微生物，其最终产物应是预期的产品，并且有经济上的合理性和巨大的生产能力。一个成功的发酵过程，通常应具有下列九个基本条件：以最低的投资设置可靠的发酵罐极其附属设备；而且能应用于一定范围的产品种类的发酵过程；原料的价格尽可能的低，利用效率尽可能的高。即使对一个成熟产品的发酵原料，也应不断地予以研究和调整；所使用的微生物菌株的生产能力是最高的；尽可能少地使用劳动力，在适当的步骤中采用自动化；如果使用分批发酵法，要求在最短周期中，得到最大的产量；并尽量发挥设备的潜力。为达到这个目的，力争采用分批补料发酵；以最简单和快速的过程进行产品的回收和精制；废弃物的排放量应是最少的；热和动力的利用是时分充分的；厂房的占地面积最少，但仍留有可发展的余地。以上众多的要求，表明对一个具体的工艺过程来说，要进行彼此间的协调，任何一个工艺过程的关键是成本分析，从而得到最大的节约潜力。Nyiri和Charles对许多发酵工艺进行分析后认为可将发酵过程的成本分解为四个主要成分，按其重要性的顺序排列为：原料成本、维修费用、公用系统费用和人工费用。如果原料成本占总成本的主要比例时，培养基和菌种的改良，将是发展工作中的主要研究任务。如果将占总成本比例很小的项目作为发展工作的主要任务是不恰当的。本章中所引用的成本，只代表发表时的情况，因为近年来，所有的价格都在急剧上涨，而且增长的比例各不相同，所以难以据此表示现在的情况，所得的数据只是个近似值。考查某个发酵过程时，必需注意到投资成本和操作成本。它可以运用化学工程成本原理进行计算，确切的发酵工业成本，几乎是不发表的。政府的资助或课税，能决定许多发酵工业的生命力。例如当发酵工业在自由经济中失去竞争力时，美国农业资助规划将谷物和马铃薯等以低价供应给发酵工业，使它得以继续维持生产。1980年，欧洲共同体将碳水化合物的价格调低到只有产糖国所供应的糖蜜和甘蔗汁的价格一半。在战时，英国政府支持丁醇-丙酮和青霉素生产计划，使得它们在获得经济上可行性以前就能进行生产。第二节 分离有工业潜在价值的微生物从各种不同来源，特别是土壤中分离重要的工业微生物，作了许多工作。遗憾的是这些分离计划消耗了许多时间和十分昂贵的代价，似乎带有一定的冒险性，尤其是筛选新抗生素。如Pfizer公司，为了要筛选一个广谱抗生素而花费了1430000英镑，结果只得到土霉素。Merck，Sharp和Dohme研究所从一万株菌株中，只获得一株有用的微生物，Eli Lilly公司花了十年时间，从40万株微生物中发现了三个新抗生素。由于广泛地进行土壤筛选，已发现了大量能合成新抗生素的微生物群体，因而从1961年以来的抗生素筛选的成本效益和发现新抗生素的可能性不断下降。在美国，1961年就已达到转折点时期。至少已经有一个美国制药公司停止了他们的筛选计划，转而依赖日本的实验室的合同。这个政策上的变化，是由于日本的工作者有系统地筛选所发现的新抗生素所需的时间，仅为美国工作者的1/5到1/10。Arima查阅了在1929-1966年间所发现的新抗生素和在日本作为医疗用的新抗生素目录后，发现其中有40%是日本学者发现的。Yamada曾报道在日本发现了较多的抗生素，同时也表明日本的专家在进入70年代后，还继续发现新的、有用的抗生素。有些公司与日本实验室建立合同关系。另一些公司仍然指挥他们自己所拥有的具有广泛筛选基础的工作者，其工作重点则并不放在抗生素上。对一个已知的微生物生产过程，有可能设计出一个筛选方法，使筛选具有专一的目标，淘汰不合宜特性的菌株。这种类型的筛选，可以大幅度地提高投资效益和生产能力。在单细胞蛋白质的生产研究中，以经济学的观点，筛选适宜的微生物。Humphrey等选育得一株嗜热放线菌（Thermoactinomyces），因为：它的最适生长温度为55，可以节省冷却费用；在蛋白质中，甲硫氨酸含量较高，可以作为饲料蛋白质的添加剂；菌体呈丝状，可以简化从发酵液中获得菌体的过滤技术。Taylon和Senior曾报道ICI公司选用一株嗜甲烷甲烷单毛杆菌（Methylophilus methylotrophus）作为单细胞蛋白质的生产菌株。因为：它具有高度的同化甲醇作为碳源的能力；生长速度快；在连续培养时，遗传性稳定；含有高营养价值的蛋白质，不含毒素和致病物质。在酵母生产中的菌株筛选，Aunstrup的目标是：酶的产量高；遗传性稳定；微生物能生成酶的组成；微生物能有效地利用培养基中的组成。第三节 菌种改良利用诱变和选育以改良菌种，对一个已成熟的发酵工艺过程而言，其经济效益是十分可观的。利用诱变改良菌种，并结合培养基的改进，明显增加了青霉素的产量，它从1940年100U/ml上升到目前的80000U/ml左右。显然，在诱变和选育工作上的时间和金钱的投资额，需视生成规模而定。例如有一个发酵过程，其年产量为453600公斤，每公斤产值为23.5便士，如果使产量增加1%时只能增加1070英镑收入，因而不值得投资支持菌种选育计划。如果生成规模扩大十倍，即使也只提高1%产量，增加的产值就是10700英镑，这些收入足以支付菌种的研究费用。如果可提高10%产量，则可使产值增加到107000英镑，这时，经济效益就大大超过菌种选育的费用。另外一个例子是，发酵工厂的年产量为453600公斤，假设产品的销售价格为每公斤90便士。如果将生成提高10%，所提供的经济效益约为41000英镑，如果将其中的1/3投资作为研究费用是合理的。Calam认为只要为一个大学毕业生配备二名助手，就可以进行一个或二个抗生素产生菌的菌种诱变研究工作，并可获得有效进展。有许多公司，如Cetus公司，Panlab公司都聘请有专门技能的专家主持菌种发展计划，或改造菌种，使培养物适应工业上的要求。例如1973-1976年间，Pamlabs公司改善了产黄青霉的青霉素产量，（见下表）。表中所列的数据表明，在不同的生成规模中的生成能力上的差异。第四节 市场潜力市场的现状和估计所需要的数据，虽然不是发酵工艺师的首要任务，但必需对市场的潜力作出估计。MacLennan, Hepner以及Lawson和Sutherlang在这方面曾作过讨论。发酵产物生产可分为二大类，即低产值-大体积；高产值-小体积。只有少数产物的生产是属于低产值-大体积，如溶剂、有机酸和单细胞蛋白质。大约有100种十分重要的有机化合物是由微生物发酵生产的。例如：乙醇、正丁醇、丙酮、甘油和醋酸。利用微生物生产这些化合物都比化学合成法经济得多。一些化学分子结构复杂，或对热不稳定化合物利用微生物发酵进行生产，其全过程具有经济上的可行性。如采用多步骤化学合成法生产，则其成本是较昂贵的。抗生素、甾体、L型氨基酸、维生素等都属于高产值-小体积的范畴。Hepner曾对大规模的乙醇发酵生产的可行性作过考察。他认为用发酵法生产乙醇与从原油合成乙醇法竞争时，只有在当地能供应廉价碳水化合物时才有其生命力。如以1977年的价格为基础，原油每吨为100美圆，而初制蔗糖为109美圆时，则发酵法几乎没有竞争力，想要使发酵法具有优势，则必需采用每吨75美圆的糖蜜作原料。1975年巴西推行以蔗糖作底物生产乙醇的计划，目的是减少石油的进口。在1977年时乙醇的产量为7万M3，并期望在1979年时能达到15万M3。虽然巴西政府将乙醇的销售价格定为每4.5升为1美圆，仍高于进口石油的价格，但减少了外汇的支出。决定增加一个化合物的产量前，首先要对目前的和将来的市场作出估计。单细胞蛋白质的扩大生产前，曾作过类似的尝试。Taylor和Senior对主要的单细胞蛋白质工厂作过判断，这些工厂中，有的已经投产，有的正在计划中。他们估计了1