生物化学大实验.pdf

1 生物化学大实验 生物化学大实验 适用于生物技术 生物工程等相关专业 王吉中 冯昕编写 食品与生物工程学院 2004 年 5 月 8 日 适用于生物技术 生物工程等相关专业 王吉中 冯昕编写 食品与生物工程学院 2004 年 5 月 8 日 2 目 录 目 录 实验一 血清免疫球蛋白的提取分离 纯化及鉴定 1实验一 血清免疫球蛋白的提取分离 纯化及鉴定 1 I 血液及组织样品的制备 1 1 II 蛋白质的沉淀反应 4 4 III 总氮量的测定一微量凯氏定氮法 6 6 IV 透析 9 9 V 蛋白质含量测定 1010 VI 凝胶层析法分离纯化蛋白质 15 15 VII SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量 1717 实验二 血清白蛋白的分离与纯化 21 实验三 实验二 血清白蛋白的分离与纯化 21 实验三 种子蛋白质系统分析 24种子蛋白质系统分析 24 I 种子蛋白质含量测定 凯氏定氮法 24 24 II 种子蛋白质氨基酸组分分析 氮基酸自动分析仪法 2626 III 种子蛋白质组分分析 28 28 IV 种子蛋白质亚基分析 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 30 30 实验四实验四 果实菠萝蛋白酶的动力学测定果实菠萝蛋白酶的动力学测定 33 实验五 33 实验五 苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定 3838 3 实验一 血清免疫球蛋白的提取分离 纯化及鉴定 实验一 血清免疫球蛋白的提取分离 纯化及鉴定 I 血液及组织样品的制备 I 血液及组织样品的制备 分析组织中某种物质的含量 探索物质代谢的过程和规律 经常使用动物的肝 肾 脑 粘膜和肌肉等组织 也选用全血 血浆 血清或者无蛋白血滤液等血液样品 有时 也采用尿液 胃液等完成各种生化实验 掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法 是保证生化实验顺利进行的关键 一 血液样品 一 血液样品 一 采血 测定用的血液 多由静脉采集 一般在饲喂前空腹采取 因此时血液中化学成分含 量比较稳定 采血时所用的针头 注射器 盛血容器要清洁干净 接血时应让血液沿着 容器壁慢慢注入 以防溶血和产生泡沫 二 血清 全血及血浆的制备 1 血清的制备 血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体 制备方法是 将刚采集的 血液直接注入试管或离心管中 将试管放成斜面 让其自然凝固 一般经 3h 血块自然收 缩而析出血清 也可将血样放入 37 恒温箱内 促使血块收缩 能较快约析出血清 为了缩短时间 也可用离心机分离 未凝或凝固的均可离心 分离出的血青 用吸管 吸出置于另一试管中 若不清亮或带有血细胞 应重离心 加盖冷藏备用 2 全血及血浆的制备 取清洁干燥的试管或其它容器 收集动物的新鲜血液 立即与适量的抗凝剂充分混 合 所得到的抗凝血为全血 每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行 选择 但是用量不宜过大 否则将影响实验的结果 将已抗凝的全二于 2 000r min 离 心 10min 沉降血细胞 取上层清液即为血浆 血浆比血清分离得快而且量多 两者的差别 主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白 原 其它成分基本相同 3 抗凝剂 凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂 抗凝剂种类甚多 实验室常用 的有如下几种 可根据情况选择使用 1 草酸钾 钠 优点是溶解度大 可迅速与血中钙离子结合 形成不溶性草酸 钙 使血液不凝固 每毫升血液用 1 2mg 即可 配制方法 配制 10 草酸钾水溶液二吸取此液 0 1ml 放入一试管中 慢慢转动试管 泛草酸钾尽量铺散在试管壁上 置 80 烘箱烤干 若超过 150 则分解 管壁即 呈一薄层三色粉末 加塞备用 可抗凝血液 5ml 此抗凝血 常用于非蛋白氮等多种测定项目 但不适用于钾 钙的测定 对乳酸脱 氯酸性磷酸酶和淀粉酶具有抑制作用 使用时应注意 4 2 草酸钾 氟化钠氟化钠 是一种弱抗凝剂 但浓度 2mg ml 时能抑制血液内葡 萄糖的分解 因此在测定血糖时常与草酸钾混合使用 配制方法 草酸钾 6g 氟化钠 3g 溶于 100ml 蒸馏水中 每个试管加入 0 25ml 于 80 烘干备用 每管含混合剂 22 5mg 可抗凝 5ml 血液 此抗凝血 因氟化钠抑制睬酶 所以不能用于脉酶法的尿素氮测定 也不能用于淀 粉酶及磷酸酶的测定 3 乙二胺四乙酸二钠盐 简称 EDTANa2 EDTANa2 易与钙离子络合而使血液不凝 有效浓度为 0 5mg 可抗凝 lml 血液 配制方法 配成 4 EDTANa 水溶液 每管装 0 lml 80 烘干 可抗凝 5ml 血 液 此抗凝血液适用于多种生化分析 但不能用于血浆中含氮物质 钙及钠的测定 4 肝素 最佳抗凝剂 主要抑制凝血酶原转变为凝血酶 从而抑制纤维蛋白原形成纤 维蛋白而凝血 0 1 0 2mg 或 20 单位可抗凝 lml 血液 配制方法 配成 10mg ml 的水溶液 每管加 0 lml 于 37 56 烘干 可抗凝 5 10ml 血液 市售品为肝素钠溶液 每毫升含 12 500 国际单位 相当干 100mg 故每 125 国 际单位相当于 lmg 除上述抗凝剂外 还有柠檬酸钠 草酸铵等 因不常用 故不作介绍 三 无蛋白血滤液的制备 测定血液或其它体液化学成分时 样品内蛋白质的存在常常干扰测定 因此 需要 先做成无蛋白血滤液再行测定 无蛋白血滤液制备的基本原理是以蛋白质沉淀剂沉淀蛋白 用过滤法或离心法除去 沉淀的蛋白 现介绍几种常用的方法 1 钨酸法 原理 钨酸钠与硫酸混合 生成钨酸 Na2WO4 H2S04 H2W04十 Na2S04 血液中蛋白质在 pH 值小于等电点的溶液中可被钨酸沉淀 沉淀液过滤或离心 上清 液即为无色而透明 pH 约等于 6 的无蛋白滤液 可供非蛋白氮 血糖 氨基酸 尿素 尿酸及氯化物等项测定使用 制备方法 1 取 50ml 锥形瓶 1 只 加入蒸馏水 7 份 2 用奥氏吸管吸取抗凝血 1 份 擦去管壁外血液 将吸管插入锥形瓶底部 缓缓放出血液 放完血液后 将吸管提高吸 取上清液再吹入 反复洗管 3 次 充分混合 使红细胞完全溶解 3 加入 0 333mol l 硫酸溶液 1 份 随加随摇 充分混匀 此时血液由鲜红变成棕色 静置 5 10min 使其 酸化完全 4 加入 10 钨酸钠 1 份 随加随摇 5 放置约 5min 后 如振摇亦不再 发生泡沫 说明蛋白质已完全变性沉淀 用定量滤纸过滤或离心 2 500r min 10min 即得完全澄清无色之无蛋白血滤液 用此法制得的无蛋白血滤液为 10 倍稀释的血滤液 即每毫升血滤液相当于 0 lml 全血 试剂 1 10 钨酸钠溶液 2 0 333mol L 硫酸溶液 5 2 氢氧化锌法 原理 血液中蛋白质在 pH 大于等电点的溶液中可用 znZ 十来沉淀 生成的氢氧化 锌本身为胶体可将血中葡萄糖以外的许多还原性物质吸附而沉淀 所以此法所得滤液最 适作血液葡萄糖的测定 因为葡萄糖多是利用它的还原性来定量的 但测定尿酸和非 蛋白氮时含量降低 不宜使用此滤液 制备方法 1 取干燥 洁净的 50ml 锥形瓶或大试管 1 支 准确加入 7 份水 2 加入混匀的抗凝血 1 份 摇匀 3 加入 10 硫酸锌溶液 1 份 摇匀 4 慢慢加入 0 5mol L 氢氧化钠溶液 1 份 边加边摇 放置 5min 用定量滤纸过滤或离心 2 500 10min 除去沉淀 便得到完全澄清的无蛋白血滤液 此滤液亦为稀释 10 倍之血滤液 试剂 l 10 硫酸锌溶液 2 0 5mol L 氢氧化钠溶液 3 三氯醋酸法 原理 三氯醋酸为一有机强酸 能使蛋白质变性而沉淀 制备方法 取 10 三氯醋酸 9 份置于锥形瓶或大试管中 加 1 份已充分混匀的抗 凝血液 加时要不断摇动 使其均匀 静置 5min 过滤或离心 即得 10 倍稀释之清明 透亮的滤液 二 组织样品 二 组织样品 在生化实验中 经常利用离体组织研究各种物质代谢途径和酶系的作用 或者从组 织中分离 纯化核酸 酶以及某些有意义的代谢物质进行研究 但是 在生物组织中 因含有大量的催化活性物质 离体组织的采集必需在冰冷条 件下进行 并日需尽快完成测定 否则其所含物质的量和生物活性都将发生变化 一般采用断头法处死动物 放出血液 立即取出所需脏器或组织 除去脂肪和结缔 组织 用冰冷生理盐水洗去血液 再用滤纸吸干 称重后 按试验要求制成匀浆或者组 织糜 组织糜 迅速将组织剪碎 用捣碎机绞成糜状 或加入少量砂于乳钵中 研磨至糊 状 组织匀浆 取一定量新鲜组织剪碎 加入适量匀浆制备液 用高速电动匀浆器或者 玻璃匀浆器磨碎组织 由于匀浆器的柞头在高速运转中会产生热量 因此在制备匀浆时 需将匀浆器置于冰水中 常用的匀浆制备液有生理盐水 缓冲液和 0 25mol L 的蔗糖液等 可根据实验的要 求 加以选择 组织浸出液 上述组织匀浆液再经过离心分离出的上清液就是组织浸出液 6 II 蛋白质的沉淀反应 II 蛋白质的沉淀反应 1 实验原理 在水溶液中 蛋白质分子表面结合大量的水分子 形成水化膜 同时蛋白质分子本 身带有电荷 与溶液的反离子作用 形成双电层 因而每个蛋白质分子可形成一个稳定 的胶粒 整个蛋白质溶液就形成稳定的亲水溶胶体系 当某些物理化学因素导致蛋白质 分子失去水化膜或失去电荷 甚至变性时 它就丧失了稳定因素 以固态形式从溶液中 析出 这就是蛋白质的沉淀作用 蛋白质的沉淀作用分为两类 1 可逆沉淀作用 在发生沉淀作用时 虽然蛋白质已经沉淀析出 然而其分子内部结构并没发生明显 的改变 仍保持原有的结构和性质 如除去沉淀因素 蛋白质可重新溶解在原来的溶剂 中 因此 这种沉淀作用称为可逆沉淀作用 属于此类的有盐析作用 低温下丙酮 乙 醇使蛋白质沉淀的作用 以及利用等电点的沉淀 盐析作用 用大量中性盐使蛋白质从 溶液中析出的过程 在高浓度的中性盐影响下 蛋白质分子的水化膜被剥夺 同时蛋白 质分子所带的电荷被中和 因而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素 使蛋白质沉淀析出 但 中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质 因此 若除去中性盐或减低盐的浓度 蛋白 质就会重新溶解 有机溶剂沉淀蛋白质 在蛋白质溶液中加入适量丙酮或乙醇 蛋白质分子的水化膜被破 坏而沉淀 若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离 蛋白质沉淀则可重新溶解于水中 2 不可逆沉淀作用 一些物理化学因素往往会导致蛋白质分子结构 尤其是空间结构破坏 因而失去其 原来的性质 这种蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶剂中 重金属盐 生物碱试剂 过 酸 过碱 加热 震荡 超声波和有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉定 重金属盐 类 Cu 2 Ag Pb2 和 Hg2 等均能与蛋白质分子中的巯基等基团结合 生成不溶物而沉淀 生物碱试剂与蛋白质结合形成不溶物 使蛋白质沉淀 植物体内具有显著生理作用的含 氮碱性化合物称为生物碱 或植物碱 能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为 生物碱试剂 如鞣酸 苦味酸 磷钨酸等 2 试剂和器材 1 试剂 1 蛋白质氯化钠溶液 取 20ml 蛋清 加蒸馏水 200ml 和饱和氯化钠溶液 l00ml 充分搅匀后纱布滤去不溶物 加氯化钠的目的是溶解球蛋白 2 蛋白质溶液 取 5ml 蛋清 用蒸馏水稀释至 100ml 搅拌均匀后 用纱布过滤 3 饱和硫酸铵溶液 称固体 NH4 2SO4 加于 l000ml 蒸馏水中 在 70 80 下搅拌 促溶 室温中放置过夜 瓶底析出白色结晶 上清液即为饱和硫酸铁溶液 4 饱和苦味酸溶液 取 2g 苦味酸放入三角烧瓶 加蒸馏水 100ml 80 水浴约 10min 使之完全溶解 于室温下冷却后瓶底析出黄色结晶 上清液即为饱和苦味酸 此 液可存放数年 5 1 醋酸铅溶液 6 1 硫酸铜溶液 7 7 1 三氯乙酸溶液 8 0 5 磺基水杨酸溶液 9 1 醋酸溶液 10 5 鞣酸溶液 11 硫酸铵粉末 2 器材 试管及试管架 抽滤瓶 量筒 布氏漏斗等 3 操作方法 1 蛋白质的盐析作用 取 1 支试管加入 3ml 蛋白质溶液和 3ml 饱和硫酸铵溶液 混匀 静置约 10min 球 蛋白则沉淀析出 过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末 边加边用玻璃棒搅拌 直至粉末不 再溶解达到饱和为止析出的沉淀为清蛋白 再加水稀释 观察沉淀是否溶解 2 乙醇沉淀蛋白质 取 1 支试管加蛋白质溶液 lml 加晶体氯化钠少许 加速沉淀并使沉淀完全 待溶 解后再加 95 乙醇 2ml 混匀 观察有无沉淀析出 3 有机酸沉淀蛋白质 取 2 支试管 各加入蛋白质溶液约 0 5ml 然后分别滴加 10 三氯乙酸和 0 5 磺 基水杨酸数滴 观察蛋白质沉淀 4 重金属盐沉淀蛋白质 取 2 支试管各加蛋白质溶液 2ml 一管内滴加 1 醋酸铅溶液 另一管内滴加 1 硫 酸铜溶液 观察沉淀生成 5 生物碱试剂沉淀蛋白质 取 2 支试管各加蛋白质溶液 2ml 及 1 醋酸 4 5 滴 其中一管滴加 5 鞣酸 另一管 滴加饱和的苦味酸溶液 观察沉淀的形成 8 III 总氮量的测定一微量凯氏定氮法 III 总氮量的测定一微量凯氏定氮法 常用微量凯氏定氮法测定天然含氮有机物中的含氮量 含氮有机物与浓硫酸共热 被氧化成二氧化碳和水 而氮则转变成氨 氨进一步与硫酸作用生成硫酸铁 由大分子 分解成小分子的过程通常称为 消化 消化过程一般进行的比较缓慢 通常需要加入 硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点 消化液的沸点由 290 400 加入硫酸铜作为 催化剂 过氧化氢作为氧化剂 以促进反应的进行 硫酸铵与浓碱作用可游离出氨 借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中 硼酸吸收氨后使溶液中的 H 浓度降低 然后用标准无机酸滴定 直至恢复溶液中原来 H 浓度为止 最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量 NH4 2SO4 2NaOH 2NH4OH Na2SO4 NH4OH NH3 H20 H3BO4 H H2BO4 NH3 H H2B04 NH 4H2BO4 NH4H2BO4 HCI NH4CI H H2B04 一 试剂和器材 1 试剂 1 消化液 30 过氧化氢与硫酸与水的比例为 3 2 1 即在 1 份的蒸馏水中缓慢加 入 2 份的硫酸 待冷却后 将其加到 3 份的过氧化氢中 临用时配制 2 催化剂 硫酸铜 CuSO4 5H2O 与硫酸钾 K2SO4 以 1 3 配比研磨混合 3 40 氢氧化钠溶液 4 2 硼酸溶液 5 标准盐酸溶液 约 0 01O0mol L 6 混合指示剂 田氏指示剂 混合指示剂由 50ml 0 1 甲烯蓝乙醇溶液与 20Oml 0 1 甲基红乙醇溶液混合配成 贮于棕色瓶中备用 这种指示剂酸性时为紫红色 碱性时为绿色 变色范围很窄且很灵 敏 2 器材 消化管或凯氏烧瓶 凯氏定氮蒸馏装置 电炉 100ml 锥形瓶 5ml 酸式滴定管 一 操作方法 一 微量凯氏定氮仪的构造和安装 凯氏定氮仪由蒸汽发生器 反应室 冷凝管三部分组成 蒸汽发生器包括一个电炉 及一个 3 5 升容积的烧瓶 蒸汽发生器借橡皮管与反应室相连 反应室上边有二个小烧 杯 一个供加样用 一个盛放碱液 样品和碱液由此可直接到反应室中 反应室中心有 一长玻璃管 其上端通到反应室外层 下端靠近反应室的底部 反应室下端底部有一开 口 上有橡皮管和管夹 由此放出反应废液 反应所产生的氨可通过反应室上端细管经 冷凝管通入收集瓶中 反应室与冷凝管之间由橡皮管相连 安装仪器时 将蒸汽发生器 垂直地固定在铁架台上 用橡皮管把蒸汽发生器 反应室 冷凝管连接起来 橡皮管连 接的部位应在同一水平位置 冷凝管下端与实验台的距离以放得下收集瓶为准 安装完 毕后 不得轻易移动 以免仪器损坏 要认真检查整个装置是否漏气 以保证所测结果 的准确性 9 二 样品的处理 1 固体样品 随机取一定量研磨细的样品放入恒重的称量瓶中 置于 105 的烘箱 中干燥 4h 用增锅钳将称量瓶取出放入干燥器内 待降至室温后称重 随后继续干燥样 品 每干燥 lh 称重一次 恒重即可 2 血清样品 取人血 或猪血 放入离心管中 干冰箱中放置过夜 次日离心除去 血凝块 上层透明清液 即为血清 吸出 lml 血清加到 50ml 容量瓶中 用蒸馏水稀释 至刻度 混匀备用 溶液如果显浑浊 加少量氯化钠再混匀 三 消化 取 5 支消化管并编号 在 1 2 3 号管中各加入精确称取的干燥样品 注意 加 样品时应直接送入管底 避免沾到管口和管颈上 加催化剂 05g 混合消化液 3ml 在 4 5 号管中各加相同量的催化剂和混合消化液 若样品是液体时 还要加与样品等体 积的蒸馏水 作为对照 用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质 摇匀后 将 5 支消 化管放在通风厨内的远红外消煮炉上消化 先用小火加热煮沸 不久看到消化管内物质 碳化变黑 并产生大量泡沫 此时要特别注意 不能让黑色物质丘升到消化管的颈部 否则将严重地影响样品测定结果 当混合物停止冒泡 蒸汽与二氧化碳也均匀地放出时 适当加强火力 在消化时 应使全部样品都浸泡在消化液中 如在瓶颈 t 发现有黑色颗 粒 应小心地将消化管倾斜振摇 用消化液将它冲洗下来 通常消化需要 1 3h 对于那 些赖氨酸含量较高的样品需要更长的时间 待消化液变成褐色后 为了加速消化完成 可将消化管取出 稍冷 加 30 过氧化氢溶液 1 2 滴于管底消化液中 再继续消化 直 到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝绿色 消化即告成功 为了保证消化彻底 再继续加 热 0 5h 消化完毕 取出消化管冷却至室温 四 蒸馏 1 仪器的洗涤 仪器应先经一般洗涤 再经水蒸汽洗涤 目的在于洗去冷凝管中可 能残留的氨 对于处于使用状态的仪器 正在测定中的仪器 加样前使蒸汽通过 1 2min 即 可 对于较长时间未使用的仪器 必须用水蒸汽洗涤到吸收蒸汽的硼酸一指示剂混合液 中指示剂的颜色合格为止 洗涤方法如下 取 2 3 个 100ml 锥形瓶 加入 10m1 2 硼酸 2 滴混合指示剂 用表面皿覆盖备用 先煮沸蒸汽发生器 器中盛有 2 3 体积的用几滴硫酸酸化过的蒸馏水 样品杯中也加入 2 3 体积蒸馏水进行水封 关闭夹子使蒸汽通过反应室中的插管进入反应室 再由冷凝管 下端逸出 在冷凝管下端放一空烧杯以承受凝集水滴 这样用蒸汽洗涤 5min 左右 在冷 凝管下口放一个准备好的盛有硼酸 指示剂的锥形瓶 位置倾斜 冷凝管下口应完全浸泡 于液体内 继续用蒸汽洗涤 1 2 min 观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色 若不变 色 则证明蒸馏器内部已洗涤干净 下移锥形瓶 使硼酸液面离开冷凝管口约 1cm 继 续通蒸汽 lmin 最后用蒸馏水冲洗冷凝管外口 排废开始 用右手轻提样品杯中棒状玻 塞 使水流入反应室的同时 立即用左手关闭夹子 盖好玻塞 由于反应室外层中蒸汽 冷缩 压力降低 反应室内废液通过反应室中插管自动抽到反应室外壳中 再在样品杯 中加入 2 3 体积蒸馏水 如此反复三次即可排尽废液及洗涤液 打开夹子将反应室外壳 中积存的废液排出 关闭夹子再使蒸汽通过全套蒸馏仪 1 3min 可进行下一次蒸馏 10 2 样品及空白的蒸馏 取 5 个 100ml 锥形瓶 分别加入 2 硼酸 10ml 混合指示 剂 2 滴 溶液呈紫红色 用表面皿覆盖备用 把消化管中的消化液全部转移到样品杯中 用约 2ml 蒸馏水冲洗消化管 重复 3 次 把洗涤液都倒入样品杯中 打开样品杯的棒状 玻塞 将样品放入反应室 用少量燕溜水冲洗样品杯后也使之流入反应室 盖上玻塞 并在样品杯中加约 2 3 体积的蒸馏水进行水封 而后将装有硼酸一指示剂的锥形瓶放在冷 凝管口下方 打开存放碱液杯下端的夹子 放 10ml40 氢氧化钠溶液于反应室后 立即 上提锥形瓶 使冷凝管下口浸没在锥形瓶的液面下 反应液沸腾后 锥形瓶中的硼酸 指 示剂混合液由紫红色变为绿色 自变色时起计时 蒸馏 3 5min 移动锥形瓶 使硼酸液 面离开约 1cm 并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口外面 继续蒸馏 lmin 将锥形瓶取出 用表面皿覆盖以待滴定 排废和洗涤等操作与前面相同 排废洗涤后 可进行下一个样 品的蒸馏 每一个样品要同时做三份 以求得准确结果 待样品和空白消化液蒸馏完 毕后 同时进行滴定 五 滴定 全部蒸馏完毕后 用 0 0100mol I 标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量 直至硼 酸 指示剂混合液由绿色变回淡紫色 即为滴定终点 六 计算 样品的总氮含量 g 氮 A B 0 0100 14 100 C 1000 若测定的样品含氮部分只是蛋白质 如血清 则 样品中的蛋白含量 g A B 0 0100 14 6 25 100 C 1000 式中 A 为滴定样品用去的盐酸体积 ml B 为滴定空白用去的盐酸体积 ml C 为称量样品的量 g 0 0100 为盐酸的摩尔浓度 mol l 实际上 此项应按实验中 使用盐酸的实际浓度填写 14 为氮原子量 6 25 为系数 1 ml0 01mol I 盐酸相当于 0 14mg 氮 若样品中除有蛋白质外 尚有其它含氮物质 则样品蛋白质含量的测定要 复杂一些 首先 需向样品中加入三氯乙酸 使其最终浓度为 5 然后测定未加入三 氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含氮量 得出非蛋白氮量 从而计算 出蛋白氮 再进一步折算出蛋白质含量 蛋白氮 总氮 非蛋白氮蛋白质含量 g 蛋白氮 6 25 11 IV 透析 IV 透析 原理 透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质 使蛋白质和其它小分子物质 如无机盐 单糖等分开 常用的半透膜是玻璃纸或称塞璐玢纸 火棉纸或称塞璐锭纸盒 其他改型的纤维素材料 透析时把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里 放入透 析液 蒸馏水或缓冲液 中进行的 透析液可以更换 直至透析袋内无机盐等小分子物 质降低到最小值为止 一 试剂和器材 1 试剂 EDTA NaCO3 NaOH 2 器材 电炉 磁力搅拌器 500ml 烧杯 二 操作过程 1 透析袋的预处理 取 100ml 0 01mol l 的 EDTA 溶液 加入 1gNaCO3 溶解后用 NaOH 调 pH 值为 7 0 将透析袋剪成适宜长度 放入 EDTA 溶液中煮沸 10 分钟 然后用蒸 馏水冲洗 再用 EDTA 溶液煮 10 分钟 反复处理 4 5 次 在蒸馏水中与 4 保存备用 2 透析 将样品放入透析袋内 两端封闭 注意袋内不要留气泡 放入透析液中 在磁力搅拌器上透析 12 V 蛋白质含量测定蛋白质含量测定 一 双缩脲法测定蛋白质浓度一 双缩脲法测定蛋白质浓度 一 目的 了解并掌握双缩脉法测定蛋白质浓度的原理和方法 二 原理 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应 在碱性溶液中蛋白质与硫酸铜 形成紫色络合物 在 540nm 处有最大吸收 在一定浓度的范围内 蛋白质浓度与双缩脲 反应所呈的颜色深浅成正比 可用比色法定量测定 双缩脲法最常用于需要快速但不要 求十分精确的测定 三 实验仪器 容量瓶 试管 吸管 分光光度计等 四 实验试剂 1 标准蛋白溶液 5mg ml 准确称取已定氮的酪蛋白 干酪素或牛血清白蛋白 用 0 05mol l 氢氧化钠溶液配制 冰箱存放备用 2 双缩脲试剂 溶解 1 5g 五水硫酸铜 和酒石酸钾钠于 500ml 蒸馏水中 在搅拌下 加入 300ml10 氢氧化钠溶液 用水稀释到 1000ml 贮存于内壁涂以石蜡的瓶内 此试剂 可长期保存 3 样品血清 动物血清用水稀释 10 倍 置于冰箱保存备用 五 操作 1 标准曲线的绘制 将 7 只干燥试管编号 按下表加人试剂 试剂 ml 0 1 2 3 4 5 6 标准蛋白溶液 0 3 0 6 1 2 1 8 2 4 3 0 蒸馏水 3 02 7 2 4 1 8 1 2 0 6 蛋白质含量 g ml 0 0 5 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 A540 各管混匀后 分别加入双缩脲试剂 3 0ml 充分混匀 于 37 水浴 30min 在波长 540nm 处比色 以 0 号管调零点测定各管吸光度 以吸光度为纵坐标 蛋白含量为横坐标 绘 制标准曲线 2 样品测定 取未知浓度的蛋白质溶液 3 0ml 置试管内 加入双缩脲试剂 3 0ml 充分混匀 在 540nm 处测吸光度 对照标准曲线 求得未知溶液的蛋白质浓度 含量 在根据样品稀释倍数换算为 g 100ml 操作 1 2 应同时进行 此外还可用标准管法测定 可参见相关资料 二 福林 酚试剂法测定蛋白质浓度二 福林 酚试剂法测定蛋白质浓度 一 目的 熟悉并掌握福林 酚法测定蛋白质浓度的原理和方法 二 原理 蛋白质 或多肽 分子中含有酪氨酸或色氨酸 能与 Folin 酚试剂起氧化还原反应 生成蓝色化合物 蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比 可用比色法测定蛋白质浓度 13 此法也适用于酪氨酸或色氨酸的定量测定 三 实验器材 1 蛋白质及其水解产物 2 722 型 或 7220 型 分光光度计 3 试管 1 5cmx1 5cm 8 4 吸管 0 50ml 0 10ml O 2Oml 5 0 ml 四 实验试剂 1 福林 酚试剂 A 将 19 Na2CO3 溶于 50ml0 lmol lNa0H 溶液 另将 0 5gCuSO4 5H2O 溶于 100mll 酒石酸钾 或酒石酸钠 溶液 将前者 50ml 与硫酸铜 酒石酸钾溶液 lml 混 合 混合后的溶液一日内有效 2 Folin 酚试剂 B 将 100g 钨酸钠 Na2WO4 2H2O 25g 钼酸钠 Na2MoO4 2H2O 700ml 蒸馏水 50ml 85 磷酸及 10Oml 浓盐酸置于 1500ml 磨口圆底烧瓶中 充分混匀 后 接上磨口冷凝管 回流 10h 再加入硫酸锂 150g 蒸馏水 50ml 及液溴数滴 开口 煮沸 15min 驱除过量的溴 在通风橱内进行 冷却 稀释至 1000ml 过滤 滤液呈 微绿色 贮于棕色瓶中 临用前 用标准氢氧化钠溶液滴定 用酚酞作指示剂 由于试 剂微绿 影响滴定终点的观察 可将试剂稀释 100 倍再滴定 根据滴定结果 将试剂 稀释至相当于 1mol l 的酸 稀释 1 倍左右 贮于冰箱中可长期保存 3 卵清蛋白溶液 约 1g 卵清蛋白溶于 100 ml0 9 NaCI 溶液 离心 取上清液 用 克氏定氮法测定其蛋白质含量 根据测定结果 用 0 9 NaCI 溶液稀释卵清蛋白溶液 使其蛋白质含量为 2mg l 亦可用 2mg m1 的牛血清白蛋白溶液 将卵清蛋白溶液准确 稀释至 500ug l 五 操作 1 标准曲线的绘制 将 7 支干净试管编号 按下表顺序加人试剂 混匀 室温放置 10min 各管再加 Folin 酚试剂 B 0 5ml 30min 后比色 500nm 做吸光度 蛋白质浓度曲线 Folin 酚法测定蛋白质浓度 标准曲线的绘制 试剂 管号 0 1 2 3 4 5 6 卵清蛋白 ml 0 0 050 10 20 30 4 0 5 蒸馏水 ml 0 50 450 40 30 20 1 0 Folin 酚试剂 A ml 4 04 0 4 04 04 04 0 4 0 2 样液测定 准确吸取样液 0 5ml 置干净试管内 加入 4mlFolin 酚试剂 A 10min 后 再加试 剂 B 0 5ml 30min 后比色 对照标准曲线求出样液蛋白质浓度 三 紫外光吸收法测定蛋白质浓度三 紫外光吸收法测定蛋白质浓度 一 目的 1 了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理 2 熟悉紫外分光光度计的使用 二 原理 14 蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸 在紫外光 280nln 波长处有最 大吸收峰 一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比 故可用紫外分光光度计通过比色来 测定蛋白质的含量 由于核酸在 280nm 波长处也有光吸收 对蛋白质测定有一定的干扰作用 但核酸的 最大吸收峰在 260 处 如同时测定 260nm 的光吸收 通过计算可以消除其对蛋白质测定 的影响 因此如溶液中存在核酸时必须同时测定 280nm 及 260nm 的吸光度 方可通过计 算测得溶液中的蛋白质浓度 三 实验器材 1 UV 9100 型紫外可见分光光度计 2 容量瓶 50ml 3 试管 4 吸管 0 50ml 1 0ml 2 0ml 5 0ml 四 实验试剂 1 卵清蛋白标准液 准确配制 1mg 1 卵清蛋白溶液 2 未知浓度蛋白质溶液 用酪蛋白配制 浓度控制在 1 0 2 5ml l 范围内 3 0 9 NaCI 五 操作 1 直接测定法 在紫外分光光度计上 将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中 以生理盐水为 对照 测得 280nm 和 260nm 两种波长的吸光度 将 280nm 及 260nm 波长处测得的吸光度 按下列公式计算蛋白质浓度 C 1 45A280 0 74A260 式中 C 蛋白质质量浓度 mg ml A280nm 蛋白质溶液在 280nm 处测得的吸光度 A260nm 蛋白质溶液在 260nm 处测得的吸光度 本法对微量蛋白质的测定既快又方便 它还适用于硫酸铵或其他盐类混杂的情况 这时用其他方法测定往往较困难 为简便起见对于混合蛋白质溶液 可用 A280nm 乘以 0 75 来代表其中蛋白质的大致 含量 mg ml 2 标准曲线法 1 标准曲线的绘制 取 8 支干净试管 编号 按下表加人试剂 紫外吸收法测定蛋白质浓度 标准曲线的绘制 试剂 管号 0 1 2 3 4 5 6 卵清蛋白 ml 0 0 050 10 20 30 4 0 5 蒸馏水 ml 0 50 450 40 30 20 1 0 Folin 酚试剂 A ml 4 04 0 4 04 04 04 0 4 0 加毕 混匀 用紫外分光光度计测 A280 以吸光度为纵坐标 蛋白质浓度为横坐标作 图 15 2 样液测定 取未知浓度的蛋白液 1 0ml 加蒸馏水 3 0ml 测 A280 对照标准曲线求得蛋白质浓度 四 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度四 考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 一 目的 学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 二 原理 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合 这种结合具有高敏感性 考马斯亮蓝 G250 的磷酸溶液呈棕红色 最大吸收峰在 465nm 当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色 其 最大吸收峰改变为 595nm 考马斯亮蓝 G250 蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质 定量测定的高敏感度 在一定范围内 考马斯亮蓝 G250 蛋白质复合物呈色后 在 595nm 下 吸光度与蛋 白质含量呈线性关系 故可以用于蛋白质浓度的测定 三 实验器材 1 旋涡混合器 2 试管 3 吸管 0 IOml 0 50ml 1 Oml 2 Oml 5 0ml 4 722 型 或 7220 型 分光光度计 5 容量瓶 1000ml 6 量筒 100ml 7 电子分析天平 四 实验试剂 1 0 9 NaCI 溶液 2 标准蛋白液 牛血清白蛋白 0 lmg ml 准确称取牛血清白蛋白 0 2g 用 0 9 NaCI 溶液溶解并稀释至 2000ml 3 染液 考马斯亮蓝 G250 0 01 称取 0 19 考马斯亮蓝 G250 溶于 50ml 95 乙醇中 再加人 l00ml 浓磷酸 然后加蒸馏水定容到 1OOOml 4 样品液 取牛血清 白蛋白 0 lmg ml 溶液 用 0 9 NaCI 稀释至一定浓度 五 操作 1 标准曲线的制备 取 7 支干净试管 按下表进行编号并加入试剂 混匀 室温静置 3min 以第 l 管为空白 于波长 595nm 处比色 读取吸光度 以 吸光度为纵坐标 各标准液浓度 ug ml 作为横坐标作图得标准曲线 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白液 ml 0 1 0 20 30 40 6 0 8 0 9 NaCl ml 1 00 9 0 80 70 60 4 0 2 考马斯亮兰 ml 4 04 0 4 04 04 04 0 4 0 蛋白质浓度 ug ml 0 10 20 30 40 60 80 A595 2 样液的测定 16 另取一支干净试管 加人样品液 1 0ml 及考马斯亮蓝染液 4 0 ml 混匀 室温静置 3min 于波长 595nm 处比色 读取吸光度 由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量 注意 样品蛋白质含量应在 10 100ug 为宜 一些阳离子如 K Na Mg2 乙醇等物质对 测定无影响 而大量的去污剂如 SDS 等会严重干扰测定 17 VI 凝胶层析法分离纯化蛋白质凝胶层析法分离纯化蛋白质 一 目的 了解凝胶层析的基本原理 并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质 二 原理 凝胶层析也称凝胶过滤 凝胶过滤层析 分子排阻层析和分子筛层析 凝胶是具有 一定孔径的网状结构物质 凝胶层析是一种分子筛效应 主要用于分离分子大小不同的 生物大分子以及测定其相对分子质量 相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进人凝胶 颗粒的内部 而相对分子质量大的物质不能进人凝胶内部 被排阻在凝胶颗粒之外 随 着洗脱的进行 相对分子质量小的物质由于进人凝胶内部 不断地从一个网孔穿到另一 个网孔 这样 绕道 而移动 走的路程长 下来得慢 迁移速度慢 而相对分子质 量大的物质因不能进人凝胶内部即随洗脱液从凝胶颗粒之间的空隙挤落下来 走的路程 短 下来得快 迁移速度映 这样就可达到分离的目的 目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶 商品名 sephadex 聚丙烯酰胺凝胶 商品名 Bio Gel P 琼脂糖凝胶 商品名因生产厂家而不同 如瑞典的 Sepharose 美国的 Bio Ge1 A 其中最常用的是 sephadex sephadex 有各种不同型号 用于分离相对分子质量大小不同 的物质 三 实验器材 1 层析柱 1cm 90cm 2 恒流泵 3 紫外检测仪 4 部分收集器 5 记录仪 6 试管等普通玻璃器皿 四 实验试剂 1 待分离样品 胰岛素 牛血清白蛋白等 2 葡聚糖凝胶 Sephadex G 75 3 蓝色葡聚糖 2000 4 洗脱液 0 1lmol l pH6 8 磷酸缓冲液 五 操作 1 凝胶的处理 Sephadex G 75 干粉经蒸馏水室温充分溶胀 24h 或沸水浴中 3h 这样可大大缩短 溶胀时间 而且可以杀死细菌和排除凝胶内部的气泡 溶胀过程中注意不要过分搅拌 以防颗粒破碎 凝胶颗粒大小要求均匀 使流速稳定 凝胶充分溶胀后用倾泌法将不易 沉下的较细颗粒除去 将溶胀后的凝胶抽干 用 10 倍体积的洗脱液处理约 lh 搅拌后继续用倾泌法除去 悬浮的较细颗粒 2 装柱 将层析柱垂直装好 关闭出口 加人洗脱液约 Icm 高 将处理好的凝胶用等体积洗 脱液搅成浆状 自柱顶部沿管内壁缓缓加人柱中 待底部凝胶沉积约 Icm 高时 再打开 18 出口 继续加人凝胶浆 至凝胶沉积至一定高度 约 70cm 即可 装柱要求连续 均匀 无气泡 无 纹路 3 平衡 将洗脱液与恒流泵相连 恒流泵出口端与层析柱人口相连 用 2 一 3 倍床体积的洗 脱液平衡 流速为 0 5ml min 平衡好后在凝胶表面放一片滤纸 以防加样时凝胶被冲 起 柱装好和平衡后可用蓝色葡聚糖2 000 检查层析行为 在层析柱内加lml 2mg ml 蓝色葡聚糖 2 000 然后用洗脱液进行洗脱 流 0 5ml rnin 若色带狭窄并均匀下降 说明装柱良好 然后再用 2 倍床体积的洗脱液平衡 4 加样与洗脱 将柱中多余的液体放出 使液面刚好盖过凝胶 关闭出口 将 1 司样品沿层析柱管 壁小心加入 加完后打开底端出口 使液面降至与凝胶面相平时关闭出口 用少量洗脱 液洗柱内壁 2 次 加洗脱液至液层 4cm 左右 按上恒流泵 调好流速 0 5ml rn in 开始洗脱 上样的体积 分析用量一般为床体积的 1 一 2 制备用量一般为床体积的 20 一 30 5 收集与测定 用部分收集器收集洗脱液 每管 4ml 紫外检测仪 280nm 处检测 用记录仪或将检 测信号输人色谱工作站系统 绘制洗脱曲线 6 凝胶柱的处理 一般凝胶用过后 反复用蒸馏水通过柱 2 一 3 倍床体积 即可 若凝胶有颜色或比 较脏 需用 0 5mol l NaOH 一 0 5mol l NaCI 洗涤 再用蒸馏水洗 冬季一般放 2 个月无 长霉情况 但在夏季如不用 则要加 0 02 的叠氮钠防腐 19 VII SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量 一 目的 了解 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法的原理 并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子 质量 二 原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开 是由于这些大分子化合 物所带电荷的差异和分子大小不同之故 如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽 略不计的程度 这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量 SDS 是十二烷基硫酸钠的简称 它是一种阴离子去污剂 它能按一定比例与蛋白质分 子结合成带负电荷的复合物 其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷 也就消除或 降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别 这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一个 因素 就可根据标准蛋白质的相对分子质量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋 白质的相对分子质量 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 可以用圆盘电泳 也可以 用垂直平板电泳 本实验用目前常用的垂直平板电泳 样品的起点一致 便于比较 三 实验器材 1 直流稳压电泳仪 2 垂直平板电泳槽 3 移液器 1 Oml 200ul 20ul 4 微量注射器 20ul 5 烧杯 试管 滴管 直尺等 四 实验试荆 1 凝胶贮备液 丙烯酰胺 Acr 29 2g 亚甲基双丙烯酞胺 Bis 0 8g 加重 蒸水至 100ml 外包锡纸 4 冰箱保存 30 天以内使用 2 分离胶缓冲液 1 5mol lTris HCI pH8 8 18 15 Tris 三经甲基氨基甲烷 加约 80ml 重蒸水 用 lmol lHCI 调 pH 到 8 8 用重蒸水稀释至最终体积为 l00ml 4 冰箱保存 3 浓缩胶缓冲液 0 5mol lTris HCI pH6 8 6gTris 加约 60ml 重蒸水 用 lmol lHCI 调 pH 至 6 8 用重蒸水稀释至最终体积 为 100ml 4 冰箱保存 4 10 SDS 室温保存 5 两类样品缓冲液 l 2 倍还原缓冲液 0 5mol LTris HCI pH6 8 2 5ml 甘油 2 0ml 质量浓度 10 SDS 4 0ml 质量浓度 0 1 溴酚蓝 0 5ml 巯基乙醇 1 0ml 总体积 10ml 20 2 2 倍非还原缓冲液 重蒸水 1 0ml 0 5mol LTris HCI pH6 8 2 5ml 甘油 2 0ml 质量浓度 10 SDS 4 0ml 质量浓度 0 1 溴酚蓝 0 5ml 总体积 10ml 6 电极缓冲液 pH8 3 Tris 3g 甘氨酸 14 4g SDS 1 0g 加重蒸水至 1000ml 4 冰箱保存 7 低相对分子质量标准蛋白质 上海产 开封后溶于 200ml 重蒸水 加 200ul2 倍 样品缓冲液 还原缓冲液 分装 20 小管 20 保存 临用前沸水浴 3 5min 其相 对分子质量如下 标准蛋白质 Mr 兔磷酸化酶 B 97400 牛血清白蛋白 66 200 兔肌动蛋白 43 000 牛碳酸酐酶 31 000 胰蛋白酶抑制剂 20 100 鸡蛋清溶菌酶 14400 8 质量浓度为 10 过硫酸按 此溶液需临用前配制 9 1 5 琼脂 1 5g 琼脂粉加 l00ml 重蒸水 加热至沸腾 未凝固前使用 10 染色液 0 25g 考马斯亮蓝 R250 加人 91ml50 甲醇 9 ml 冰醋酸 11 脱色液 50ml 甲醇 75ml 冰醋酸与 875ml 重蒸水混合 12 待测相对分子质量的样品 五 操作 1 将垂直平板电泳槽装好 用 1 5 琼脂趁热灌注于电泳槽平板玻璃的底部 以防 漏 2 分离胶的选择和配制方法 l 按照蛋白质不同的相对分子质量选用不同浓度的分离胶 蛋白质相对分子质量的范围 分离胶的浓度 5 10 5 2 5 2 不同分离胶的配制方法 分离胶的浓度 20 15 12 10 7 5 重蒸水 ml 0 75 2 35 3 35 4 05 4 85 21 1 5mol LTris HCI pH8 8 ml 2 5 2 5 2 5 2 5 2 5 质量浓度为 10 SDS ml 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 凝胶贮备液 ml 6 6 5 0 4 0 3 3 2 5 质量浓度为 10 过硫酸铵 ul 50 50 50 50 50 TEMED ul 5 5 5 5 5 总体积 ml 10 10 10 10 10 3 分离胶的灌制 根据待测蛋白质样品的相对分子质量选择合适的分离胶浓度 本实验选用 12 的分 离胶 在 15ml 试管中依次加入重蒸水 3 35ml 1 5mol lTris HCI pH8 8 缓冲液 2 5ml 10 SDS 0 lml 凝胶贮备液 0 8ml 10 过硫酸铵 25ul 和 TEMED5ul 由于加 入 TEMED 后凝胶就开始聚合 所以应立即混匀混合液 然后用滴管吸取分离胶 在电 泳槽的两玻璃板之间灌注 留出梳齿的齿高加 Icm 的空间以便灌注浓缩胶 用滴管小心 地在溶液上覆盖一层重蒸水 将电泳槽垂直静置于室温下约 30 60min 分离胶则聚合 待分离胶聚合完全后 除去覆盖的重蒸水 尽可能去干净 4 浓缩胶的配制和灌制 一般采用 5 的浓缩胶 配制方法 重蒸水 2 92ml 0 5mol LTris HCI 缓冲液 pH6 8 1 25ml 10 SDS0 05rnl 凝胶贮备液 4 0ml 10 过硫酸铵 25ul TEMED5ul 在试管中 混匀 灌注在分离胶上 小心插人梳齿 避免混入气泡 将电泳槽垂直静置于室温下至 浓缩胶完全聚合 约 30min 5 样品的制备 1 标准蛋白质样品的制备 取出一管预先分装好的 20ul 低相对分子质量标准蛋白质 放人沸水浴中加热 3 5min 取出冷至室温 2 待测蛋白质样品的制备 a 10ulVEGF 约含 5ug VEGF 加 10ul 2 倍还原缓冲液 b 10ul VEJ 约含 5ug VEGF 加 10ul 2 倍非还原缓冲液 以上 a b 两管均同标准蛋白质样品一样 在沸水浴中加热 3 5min 取出冷至室温 6 电泳 1 待浓缩胶完全聚合后 小心拔出梳齿 用电极缓冲液洗涤加样孔 梳孔 数次 然后将电泳槽注满电极缓冲液 2 用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样 3 接上电泳仪 上电极接电源的负极 下电极接电源的正极 打开电泳仪电源开关 调节电流至 20 30mA 并保持电流强度恒定 待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约 Icm 时 停止电泳 7 染色与脱色 小心将胶取出 置于一大培养皿中 在溴酚蓝条带的中心插一细钢丝作为标志 加 染色液染色 lh 倾出染色液 加人脱色液 数小时更换一次脱色液 直至背景清晰 8 相对分子质量的计算 用直尺分别量出标准蛋白质 待测蛋白质区带中心以及钢丝距分离胶顶端的距离 22 按下式计算相对迁移率 相对迁移率 样品迁移距离 染料迁移距离 以标准蛋白