（林木遗传育种专业论文）仙客来种质核型及其分类的研究.pdf

厂r q l l l llll l lll lii iii iiii 符号说明 y 17 8 6 2 17 缩写中文名称英文名称 克 毫升 升 小时 分钟 厘米 毫米 微米 摩尔 长染色体 中长染色体 中短染色体 短染色体 中部着丝粒染色体 中部着丝粒染色体 近端部着丝粒染色体 端部着丝粒染色 g r a m m i l l i l i t e r l i t e r h o u r m i n u t e c e n t i m e t e r m i l l i m e t e r m i c r o m e t e r m o l e l o n g m e d i u m l o n gc h r o m o s o m e m e d i u m s h o r tc h r o m o s o m e s h o r t m e t a c e n t r i cc h r o m o s o m e s u b m e t a c e n t r i cc h r o m o s o m e a c r o c e n t r i cc l l r o m o s o m e t e l o c e n t r i cc h r o m o s o m e g “ 。 h 口 锄 栅 岬 m l m s m 吾| 吼 o 山东农业大学硕i ：学位论义 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 1 引言1 1 1 仙客来的研究进展1 1 1 1 仙客来的发展1 1 1 2 仙客来的起源研究1 1 2 染色体研究进展2 1 3 核型分析方法研究进展3 1 3 1 手工核型分析法4 1 3 2 图像分析系统法。4 1 4 细胞分类学研究进展4 1 5 仙客来核型及分类研究进展5 1 5 1 仙客来的原始种分类5 1 5 2 仙客来的栽培品种分类7 1 5 。3 仙客来的核型分析研究7 1 6 研究目的意义8 1 7 本研究的内容。8 2 材料与方法9 2 1 实验材料9 2 2 实验方法9 2 2 1 药品配制9 2 2 2 染色体制片1 0 2 2 3 核型分析1 2 2 2 4 亲缘关系与分类的分析1 5 3 结果与分析1 6 仙客米种质核型分析及j e 分类的研究 3 1 仙客来制片技术的优化分析1 6 3 1 1 取材1 6 3 1 2 预处理l6 3 1 3 固定1 6 3 1 4 解离1 6 3 1 5 核型分析1 6 3 2 仙客来核型分析1 7 3 2 1 仙客来种质核型分析1 7 3 2 2 仙客来种质的核型比较5 6 3 2 3 不同产地仙客来种质的核型特点5 9 3 3 仙客来种质的聚类分析6 l 4 讨论6 3 4 1 仙客来制片与核型分析技术6 3 4 2 仙客来种质核型特点与育种研究分析6 4 4 3 仙客来的分类6 4 4 4 仙客来种质核型与其植物形态的关系6 5 5 结论6 6 5 1 仙客来染色体制片技术的优化6 6 5 2 仙客来核型的特点6 6 5 3 不同产地仙客来核型的特点6 6 5 4 仙客来的聚类分析6 7 6 本研究的主要创新点6 7 参考文献6 8 致谢7 3 攻读学位期间发表论文情况7 4 山东农业大学硕j 二学位论文 l 摘要 本文以山东省泰安市泰山林业科学研究院实验基地来自法国、美国、 比利时、日本和中国共计2 0 个仙客来种质为试材，对常规压片法进行了 改良，对其体细胞染色体进行了分析研究，一一鉴定其染色体倍性与数目， 分析其染色体形态，提供仙客来的细胞学基础资料。主要研究结果如下： 1 研究出仙客来简单高效的制片方法。以旺盛生长的仙客来幼芽为试 材，在每天的上午1 0 时1 2 时或下午2 时 - - 5 时取仙客来幼芽，采用饱 和对二氯苯溶液预处理4 小时，选用卡诺固定液( 冰醋酸：无水酒精= l ：3 ) 固定1 2 小时，1 n 盐酸溶液解离4 5 分钟，改良卡宝品红染色、压片。 2 本研究选取的2 0 个仙客来种质染色体实际长度变异于1 4l am ，仙 客来属于小染色体类型。2 0 个仙客来种质都是2 倍体，平均臂比变化范 围为1 1 5 1 5 9 。核型不对称系数变幅为5 3 0 3 6 1 7 8 。核型类别多数是1 a 和1 b 类型，极少数为2 a 、2 b 类型，是较稳定的品种。相对长度组成上， 法国国旗红、比利时白色、比利时镭射只有中长染色体m 2 和中短染色体 m l ，其他种质染色体相对长度均由长染色体l 、中长染色体m 2 、中短染 色体m l 、短染色体s 组成。核型主要由中部着丝点染色体( m ) 组成， 少数品种品种由近中部着丝点染色体( s m ) 和中部着丝点染色体( m ) 组 成。 3 本研究选取的5 个不同产地仙客来种质染色体均小于4 p , m ，属小染 色体类型；体细胞染色体均为二倍体，无多倍体和非整倍性变化，同本和 美国的品种染色体数目均为4 8 ，国内浙江和比利时的品种染色体数目均 为8 4 ，法国除彩云为8 4 外其余均为4 8 。平均臂比和核型不对称系数差异 较小；比利时和国内浙江种质核型类型相同，为1 a 类型，美国种是1 b ， 法国种深粉和彩云是l b 类型，白色和国旗红为1 a 类型。相对长度组成 上，其中法国深粉、美国浅粉、同本的n p 9 、p f 一9 的相对长度长度组成 仙客) i 乏种质核型分析及其分类的研究 相同，都为8 l + 1 6 m 2 + 1 6 m l + 8 s ：而美国彩蝶、日本s c 5 7 的相对长度公 式为8 l + 1 4 m 2 + 1 8 m i + 8 s ；同本n p 7 、p 5 、p 4 的相对长度公式为 6 l + 1 8 m 2 + 1 6 m l + 8 s ；其余品种各不相同。法国、比利时、美国种质染色 体均由中部着丝点染色体( m ) 组成，国内浙江和日本的品种则由近中部 着丝点染色体( s m ) 和中部着丝点染色体( m ) 组成。 4 采用l r 、m a r 、a s k 和a l 四因子主成分分析，据d i j 2 q 型聚类 发现，本研究选取的2 0 种仙客来种质可分为5 类，第一类，法国彩云； 第二类，利时镭射，比利时白色，法国国旗红；第三类包括法国白色，s c 5 7 ， 法国深粉，美国浅粉，美国彩蝶；第四类浙江国旗红；第五类包括n p 7 ， n p 9 ，n p 1 0 ，p 5 ，p 4 ，p f 9 ，p f 1 0 ，v b f 1 0 ，k 4 ，k 6 6 。 关键词t 仙客来；核型分析；分类； 山东农业人学硕上学位论义 a b s t r a c t t h et w e n t yc y c l a m e ng e r m p l a s mf r o mf r a n c e ，t h eu n i t e ds t a t e s ，b e l g i u m ，j a p a n a n dc h i n ao ft a i s h a nf o r e s t r ys c i e n c ei n s t i t u t ew e r et a k e na st h ee x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s i nt h i s p a p e r t h e c o n v e n t i o n a l s q u a s h e d m e t h o dw a si m p r o v e da n dt h e s o m a t i c c e l l c h r o m o s o m e so fc y c l a m e nw e r es t u d i e d t h r o u g hi d e n t i f i c a t i o no f c h r o m o s o m en u m b e r s ，a n a l y s i so fk a r y o t y p e sa n de x p l o r a t i o no fe f f e c t i v ea p p r o a c ho f k a r y o t y p ea n a l y s i so fc y c l a m e ng e r m p l a s m s ，t h ea i mo ft h i sp a p e rw a st op r o v i d et h e b a s i cc y t o l o g yd a t ao fc y c l a m e ng e r m p l a s m s t h em a i ns t u d yr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 as i m p l ea n de f f i c i e n tp r o d u c t i o nm e t h o do fc y c l a m e nw a se x p l o r e d t h ef l o u r i s h c y c l a m e nb u d sw e r ec o l l e c t e di nc l e a rd a y sf r o m10 ：0 0a m t o12 ：0 0a mo r2 ：0 0 p mt o 5 ：0 0 p m t h ey o u n gl e a v e ss h o u l db ed i v e s t e d t e n d e rt i s s u e sw e r ep r e t r e a t e dw i t h s a t u r a t e d1 , 4d i c h l o r o b e n z e n es o l u t i o nf o r2 3 h f i x e di nf r e s h l yp r e p a r e dc a r n o y sf i x e d l i q u i d ( 1 ：3a l c o h o l - a c e t i c ) f o r1 2 h h y d r o l y z e di nt h e1 nh c lf o r1 0m i na t r o o m t e m p e r a t u r ea n ds t a i n e dw i t hi m p r o v e df u c h s i ns o l u t i o n 2 t h ec h r o m o s o m e sa c t u a ll e n g t ho ft h et w e n t yc y c l a m e ng e r m p l a s mi nt h i ss t u d y w e r ev a r i a t e df r o mlt o4 胛t h ec h r o m o s o m e sb e l o n g st os m a l lc h r o m o s o m e s a l lt h e c h r o m o s o m e so ft h et w e n t yc y c l a m e ng e r m p l a s m sw e r ed i p l o i d ，a v e r a g ea r mr a t i ov a r i e d f r o m1 15t 01 5 9 k a r y o t y p ea s y m m e t r yi n d e xr a n g e df r o m5 3 0 3 61 7 8 m o s to ft h e g e r m p l a s m sw e r eia a n dibt y p e ，v e r yf e ww e r et h e2 a 、2 b ，t h a ti ti sm o r es t a b l es p e c i e s a st or e l a t i v el e n g t h ，t h ef r e n c hf l a go n l yw a sm 2c h r o m o s o m ea n dm lc h r o m o s o m e ，t h e o t h e rg e r m p l a s m sw e r elc h r o m o s o m e ，m 2 c h r o m o s o m e ，m l c h r o m o s o m e ，sc h r o m o s o m e t h em a i nm e m b e ro fk a r y o t y p ew a smc h r o m o s o m ea n do n l yaf e wc h r o m o s o m e sa l s o h a v es mc h r o m o s o m e s 3 t h ec h r o m o s o m e so f c y c l a m e ng e r r n p l a s mf r o mf i v ed i f f e r e n ta r e a sw e r el e s st h a n 4 1 t m i tb e l o n g st os m a l lc h r o m o s o m e s ；a l lt h ec h r o m o s o m e sw e r ed i p l o i d ，p o l y p l o i da n d a n e u p l o i dw e r en o tf o u n d t h ec h r o m o s o m en u m b e ro fj a p a na n dt h eu n i t e ds t a t e s g e r m p l a s mw a s4 8 ，t h en u m b e ro fz h e j i a n ga n db e l g i u mg e r m p l a s mw a s8 4 ，a n dt h e f r e n c hg e r m p l a s mw a s4 8e x c e p tc a i y u n t h ea v e r a g ea r mr a t i oa n dk a r y o t y p e a s y m m e t r yc o e f f i c i e n th a das m a l l e rd i f f e r e n c e ；b o t ht h eb e l g i u ma n dz h e j i a n gh a v et h e s a m et y p ea s1a ，a n dt h eu n i t e ds t a t e sw a sib ，t h ef r e n c hk i n do fd e e pp o w d e ra n d c l o u d sw e r e1b ，w h i t ea n dr e df l a gw e r eia t h ef r e n c hd e e pp o w d e r , t h eu n i t e ds t a t e s p a l e 。j a p a nn p 9 ，p f - 9h a dt h es a m ec o m p o s i t i o no fr e l a t i v el e n g t ht h a tw a s8 l + 1 6m 2 l l i 仙客米种质核型分析及其分类的研究 + 1 6m i + 8s ；w h i l et h eu n i t e ds t a t e sc a i d i e ，j a p a ns c 一5 7 w e r e8 l + 1 4m 2 + 1 8m l + 8 s ； j a p a nn p 一7 ，p 一5 ，p 4w e r e6 l + 1 8m 2 + 1 6m l + 8s ；o t h e rv a r i e t i e sw e r ed i f f e r e n tf r o m e a c ho t h e r t h em e m b e ro f k a r y o t y p eo ff r a n c e ，b e l g i u m ，t h eu s w e r em c h r o m o s o m e a n dz h e j i a n ga n dj a p a ng e r m p l a s ma l s oh a v es mc h r o m o s o m e s 4 u s i n gl r ，m a r ，a s k a n da la st h ef o u rp r i n c i p a lc o m p o n e n t sf a c t o r , w e m a d ead i j 2 qc l u s t e ra n df o u n dt h a tt h et w e n t yc y c l a m e ng e r m p l a s mc a nb ed i v i d e di n t o f i v ec a t e g o r i e s ，t h ef i r s tc a t e g o r y ：f r a n c ec l o u d s ；t h es e c o n dc a t e g o r y ：b e l g i u ml a s e r , b e l g i u mw h i t e ，f r e n c hr e df l a g ；t h et h i r dc a t e g o r yi n c l u d e sf r a n c e ，w h i t e ，s c 5 7 ，f r a n c e d e e pp o w d e r , t h eu s 1 i g h tp i n lt h eu n i t e ds t a t e sc a i d i e ；t h ef o u r t hc a t e g o r y ：z h e j i a n g r e df l a g ；t h ef i f t hc a t e g o r yi n c l u d e sn p 一7 ，n p - 9 ，n p - l o ，p - 5 ，p - 4 ，p f - 9 ，p f - 10 ，v b f - 10 ， k 4 k - 6 6 k e y w o r d s ：c y c l a m e n ；k a r y o t y p ea n a l y s i s ；c l a s s i f i c a t i o n ； i v 瞪 山东农业人学硕i j 学位论文 1 引言 1 1 仙客来的研究进展 1 1 1 仙客来的发展 仙客来( c y c l a m e np e r s i c u m m i 们又名一品冠、兔子花、兔耳花、萝卜 海棠，为报春花科( p d m u l a c e a e ) 仙客来属( c y c l a m e n ) 多年生草本球根植物， 原产于地中海沿岸的希腊、土耳其、意大利、以色列、黎巴嫩、塞浦路斯、 法国南部等国家和地区。因其叶片浓绿并具美丽斑纹、花型独特且绚丽多 彩、花期长而深受人们喜爱，已成为国际著名笳花之一。仙客来作为观赏 植物和笳栽花卉，其栽培生产历史悠久，4 0 0 年以前在欧洲就开始引种栽 培( 张芹等，2 0 0 5 ) 。最早是在1 5 9 6 年进入英国庭园的，1 6 6 5 年出现在 法国，1 7 3 1 年以后又从英国传到了世界各地，1 7 3 9 年荷兰应用于花园。 日本是从1 9 世纪引入原种仙客来和园艺品种进行栽培的。到了1 8 世纪中 叶，英、法、德的园艺家开始了仙客来新品种的培育，至今己培育出数千 个园艺品种，并推广到世界各地( 康黎芳等，1 9 9 35 张芹等，2 0 0 5 ) 。仙 客来在全世界的销量5 0 年来一直排名前十位，在荷兰花卉市场上，仙客 来被列为十大简花之一，占花卉年销售额的7 左右。在日本市场上，仙 客来的需求量是仅次于兰花的第二大盆花，平均每9 人就占一盆，单价可 达l 万日元。我国是在上世纪二三十年代丌始从日本引入仙客来进行栽培 的，仙客来盆栽花卉是近几年来在我国大面积发展的花卉品种，是十大畅 销花卉之一，年销售量高达6 0 0 万7 0 0 万箍，市场潜力非常大( 于杰， 2 0 0 3 ) 。 1 1 2 仙客来的起源研究 仙客来的起源复杂，有证据表明仙客来是史前幸存的早期类型植物之 一，因为它的许多重要特性均存在于6 0 0 力年前的第三纪地质时代。此外， 从其分布来看也是在地壳运动过程中当陆地表面分离转移时，从一个原始 种发展而成的不同类型。 1 9 8 9 年m a t st h u l i n 报道产于热带非洲的索马里仙客来( c y c l a m e n s o m a l e n s e ) 属于第三纪地层的孑遗植物，此新种与仙客来关系密切，为 地中海植物区系的间断分布区( m a t st h u l i n ，1 9 8 9 ) 。2 0 0 0 年g e l l yl 等 仙客来种质核型分析及其分类的研究 根据对叶绿体中尿腺腺苷( l a a ) 内含子序列变异的研究，提出地中海沿岸 的希腊、土耳其、意大利、以色列、黎巴嫩、塞浦路斯、法国南部等国家 和地区是仙客来原产地。 2 0 0 1 年g i e l l y 应用叶绿体基因t m l 内含子片段获得了希腊南部两地 理隔离种群系统发育谱，指出第一种群由来自伯罗奔尼撒的波叶仙客来亚 种p e l o p o n n e s i a c u m 和来自克利特岛的克里特仙客来组成，第二种群由克 罗地亚、意大利、法国南部、科西嘉岛、撒丁岛和西西旱岛的波叶仙客来 亚种r e p a n d u m 及来自巴利阿里、法国南部的巴利阿旱仙客来组成。认为 在克利特岛的- - 4 , 区域内波叶仙客来种群已渗入残遗的巴利阿旱仙客来 种群中。 2 0 0 3 年m a r t i n s 等用内转录间隔区d n a 片段分析法( i t s ) ，研究了报 春花科3 4 个种的系统发育状况，用仙客来作外类群，表明它与紫金牛属、 珍珠菜属关系不密切( l m a r t i n s ，2 0 0 3 ) 。 1 2 染色体研究进展 核型分析( k a r y o t y p ea n a l y s i s ) 又称组型分析，是观察分析染色体 的方法之一，是指每种生物染色体的数目、大小、形态等特征的总和，它 代表了一个个体，一个种甚至一个属或更大类型的特征，对于研究生物遗 传变异、生物系统的演化、物种之间的亲缘关系、某些生物的起源、远缘 杂交及染色体工程等有重要意义( 李国珍，1 9 8 5 ) 。 染色体是与遗传信息从一个世代转移到另一世代有关并依次释放这 些信息以控制细胞功能和发育的一组生物大分子( 龙华，2 0 0 6 ) ，是物种 主要遗传物质的载体，同时染色体也为生物的变异提供了基础( 李国珍， 1 9 8 5 ) 。自1 8 4 8 年w h o f m e i s t e r 在观察紫鸭趾草的花粉母细胞时发现了染色 体，1 8 8 8 年w a l d e y e r 正式提出染色体这一术语，至今已经历了一百多年的 历史。 染色体研究技术在国内外广大细胞遗传学工作者的共同努力下取得 了一个又一个的新突破，为细胞遗传学研究开拓了一条极为宽广的道路 ( 虞世嘉，1 9 8 7 ) 。本世纪五十年代以前，出于研究技术上的障碍，染色 体的发展速度和应用范围受到了一定的限制。上世纪初，s u t t o n 提 2 一；箬 护 山东农业人学硕l ：学位论义 体是遗传物质载体的假说，后f l ：l m o r g a n 、e m e r s o n 等学者的卓越工作所证 实，为染色体研究的进一步发展提供了理论基础。1 9 2 1 年，b e l l i n g 仓 立的 染色体压片技术，成为植物染色体研究中最广泛采用的常规技术，推动了 染色体的广泛研究，染色体计数工作开始迅速发展了。除了染色体数目外， 2 0 世纪3 0 年代开始发现染色体形态和大小具有很大的分类价值。1 9 5 6 年， 美籍中国学者徐道觉发现低渗溶液有促使中期细胞膨胀、染色体分散的作 用。低渗液作用的发现，被认为是染色体研究技术从逾越前一阶段的障碍 跨人本阶段的一个重要的标志，它使三十多年来关于人类染色体数争论不 休的局面才有可能宣告结束( 虞世嘉，1 9 8 7 ) 。5 0 年代还有许多方法学方 面的突破是染色体研究史上的第一次技术革命，它推动了细胞遗传学研究 向纵深发展。六十年代，染色体显带技术问世，使染色体研究深入一大步， 因为它揭示了许多按常规技术不能显示的种间差异，更能显示种内的染色 体分化。七十年代后，研究染色体的新技术不断涌现，从此染色体的研究 跨入了一个完全崭新的时期。 国内，2 0 世纪7 0 年代术期以前，除台湾省以外自己进行的野生植物 染色体研究只有个别报道，涉及个别植物。中国植物区系中的一些植物是 由外国人采走种子，由外国人研究报道的。例如英国人w i l s o n 和f o r e s t 在2 0 世纪初从中国西南地区采去大量杜鹃花，引种于英国爱丁堡阜家植 物园，多达4 0 0 种。由j a n a k im m a l 等( 1 9 5 0 ) 研究报道了其中近3 0 0 种的 染色体数目。因此1 9 7 6 年前，中国的细胞分类学研究除台湾省外尚属空 白。在这一年，江苏省植物研究所薯蓣组发表了薯蓣属的染色体。这与世 界细胞分类学起步几乎相差7 0 年( h i s h i z a k a ，2 0 0 3 ) 。当然，近2 0 年来 我国在染色体方面的研究所取得的成果是令人瞩目的。我国在川麦冬、中 国水仙、金鱼草、三倍体杨树、野生燕麦、紫萁、百合、紫花苜蓿、卫茅、 山楠等植物上进行了染色体的核型分析，提出了其核型公式及所属类型， 为传统的植物形态描述分类提供了细胞学依据( 梁国鲁，1 9 9 8 ：王瑞等， 时丽冉，蔡华，2 0 0 7 ；何子灿等，邓永会等，张为民，2 0 0 6 ) 。 1 3 核型分析方法研究进展 目前，常用的核型分析的方法主要有两种：手工核型分析法和利用 仙客米种质核型分析及其分类的研究 图像分析系统法。 1 3 1 手工核型分析法 选取数目完整、分散良好、形态和缢痕清晰的细胞进行显微摄影，将 照片放大后将染色体逐条剪下，以染色体长度和着丝点位置两个参数为依 据，进行同源染色体的人工“配对”，测其长臂、短臂及臂比，并求出它们 的平均值和相对长度，然后绘制出核型图和核型模式图。这种方法相当费 工、费时，测量的误差也较大，在一定程度上影响了染色体核型分析的正 确性( 洪德元等，1 9 8 6 、1 9 9 1 ) 。 1 3 2 图像分析系统法 随着计算机应用的普及与发展，新的软件的开发与应用，核型分析中 也有了专门的染色体图像分析软件，能将染色体的特征( 如长度、带型等) 用数字描述分析，将染色体的形态、特征进行定量分析。同本学者f u k u i ( 1 9 8 6 ) 首先建立了专门适用于植物染色体的图像分析系统c h i a s ( c h r o m o s o m ei m a g ea n a l y z i n gs y s t e m ) 。随后在计算机领域开展了应用该类分析 软件( g r a h a m ，1 9 9 4 ) ，可在短时间内获得染色体的大量数量化资料，减少 了人为测量与分析出现的误差，大大提高植物染色体核型的速度与精确度 ( 李相育，2 0 0 3 ) 。不过这种分析系统价格昂贵，在实践中还没有普遍应用。 但随着技术的更新，这种系统必将更加趋于完善，应用将更加广泛。 1 4 细胞分类学研究进展 细胞学，特别是染色体和分类学的结合丌始于1 9 世纪末期。1 9 世纪末 发现了染色体，并证明它是遗传信息的携带者，染色体的重组常常导致新 种的出现，h u x l e y ( 1 9 4 2 ) 甚至称进化就是选择压力与染色体变化互相作用 之结果，染色体在一定程度上能反映生物的本质。因此，许多学者认为染 色体特别重要，以染色体数目、大小、形态、行为为主要特征的核型是物 种稳定的遗传性状，可以作为生物分类的重要特征。 细胞分类学( c y t o t a x o n o m y ) 是利用细胞学特征进行生物分类的学科。 实质上是仅仅基于染色体的数目、结构与行为的分析，所以有些学者干脆 称其为染色体分类( c h r o m o s o m a lt a x o n o m y ) ( 洪德元，1 9 9 0 ) 。1 9 2 1 年， b e l l 矗。i 。一- - 。压片技术，染色体计数工作急剧上升。r o s e n b e r g1 9 0 9 年对茅 4 山东农业大学硕l 学位论文 膏菜属d r o s e r a 两个种进行分析时发现，圆叶茅膏菜d r o t u n d i f o l i a 的染色体 数目为2 n = 2 0 ，而d a n g l i c a 为2 n = 4 0 ，体细胞染色体数目不同。此外，2 0 世纪3 0 年代开始发现染色体形态和大小也具有很大的分类价值。这方面研 究的开拓者是b a b c o c k 和他在还阳参属c r e p i s 研究中的合作者h o l l i n g s h e a d 和c a m m e r o n 以及原苏联以g a l e v t z k y 并l l m s n a v a s h i n 为首的许多研究 者。他们全都认识到染色体结构重排的重要性，并根据这样的变化解释该 型差异( h i s h i z a k a ，2 0 0 3 ) 。 细胞分类学可以解决常规形念分类难以解决的问题，是现代综合分类 的重要组成部分。目前，在许多动、植物类群中，染色体数据( 包括染色 体数目、核型分析、染色体带型分析、染色体组分析等) 己同形态特征一 样成为标准分类的基本数据。迄今，至少2 万种以上被子植物和1 3 0 0 种蕨 类植物已有染色体的研究资料。w h i t e ( 1 9 7 8 ) 对染色体的工作提出了5 个不 同级别的研究进程：a 、b 、y 、级。a 级核型最为基础，只限于 对染色体进行计数和大小、染色体长短的测量；1 3 级是在q 级的基础上研 究着丝粒的位置，染色体臂的形念、对称性分析等；y 级是在b 级的基础 上做染色体的分带研究；、级则是在y 级的基础上做更加精细的研究 工作。目前的分类研究多见于1 3 级和y 级，而y 级以上的工作则很少。 1 5 仙客来核型及分类研究进展 1 5 1 仙客来的原始种分类 仙客来的起源比较复杂，有证据表明它是从一个原始种发展成不同类 型成为多个原始种( 张敬方，1 9 9 3 ) 。据记载它有1 7 个不同类型的原始种 ( 姜世平等，1 9 9 9 ) 。另一说为1 6 个原始种( 程金水，2 0 0 1 ) 。以下为这1 6 个原始种。 仙客来( c p e r s i c u mm i l l ) ：现有的栽培品种大部分出该种选育而出， 花色多样，具芳香气味。 欧洲仙客来( c p u r p u r a s c e n sm i l l ) ：叶绿色，上布银色网状斑纹，花色 多为紫色，可四季开花。 小花仙客来( c c o u mm i l l ) ：叶布有浅绿色戟状图案或斑点，花冠小， 瓣短，以红白两色为主。 仙客米种质核型分析及其分类的研究 非洲仙客来( c a f r i c a n u mb e i s se tr e u t e r ) ：耐寒性极差；属仙客来中叶 子最大的种：叶缘与众不同，具有突起的浓密小点：叶花同时从顶端抽出， 花色为白色、粉色和红色，初开时具芳香气味。 巴利阿里仙客来( c b a l e a r i c u mm i l l ) ：叶较大而薄，蓝灰色上具银色 斑纹；花色以白色为主。 西西里仙客来( c c i l i c i c u mb o i s se th e l d r ) ：耐寒性强：叶有银色边； 花色为淡粉色。 克旱特仙客来( c c r e t i u mh l d b r ) ：叶片前端尖角形，花通体白色，微 香，花瓣狭窄细小。 塞浦路斯仙客来( c c y p r i u mk o t s c h y ) - 叶为暗绿色，花初为粉色后为 白色，有浓香气味。 希腊仙客来( c g r a e c u ml i n k ) ：叶色如鲜明大理石般白色或银色至灰 绿色；花以白色为主。 帕尔夫洛仙客来( c p a r v i f l o r u mp o b e d ) ：是仙客来中最小型的种，花 冠长度仅为0 5 1 0 c m ，非常珍贵；常春藤叶状，深绿色；花通体暗粉紫 色，花梗仅超出叶丛；花期1 2 3 月份。 地中海仙客来( c h e d e r i f o l i u ma i t o n ) ：耐寒性及抗热性都强；生长期 大于15 0 年；叶色从全绿色至银色，有的叶中心淡黄色，边缘黑绿色；花 淡玫瑰红色，花量丰富；种内有两个变种。 黎巴嫩仙客来( c 1 i b a n o t i c u mh l d e b r ) ：耐寒性弱；染色体数2 n = 3 0 ； 绿色叶面上布有橄榄色宽带，叶背为浅红色；花以粉色具芳香气味为主， 少有红色和深红色：花梗长1 5 c m ，花期2 - 4 月份。 假西班牙仙客来( c p s e u d i b e r i c u mh l d e b r ) ：抗寒性很强；染色体数 2 n = 3 0 ；花亮粉色，具芳香气味，基部有1 对白色斑被褐紫色所包围；花 期最早( 1 _ 4 月) 。 波叶仙客来( c r e p a n d u ms i b t h ) ：典型林地植物；抗寒性很强；花深 粉色；种内有3 个变种。 罗尔夫斯仙客来( c r o h l f s i a n u ma s c h e r s ) ：不耐寒，是珍贵的秋花种； 染色体数差异很大；叶大部银灰色，少量为绿色，幼叶全缘，柄上覆有褐 粉色绒毛；花深粉色，具芳香气味，花瓣扭曲。 6 山东农业大学硕i ：学位论义 木拉贝拉仙客来( c m i r a b i l eh l d e b r ) ：喜光耐寒性弱；染色体数 2 n = 3 0 ：仙客来的祖先( 张敬方，1 9 9 3 ) 。 这些原始种中，罗尔夫斯仙客来分布十分广泛，研究认为仙客来起源 的那个原始种一定类似于它，认为欧洲仙客来是地中海仙客来的一个分离 的尚存活的祖先，而地中海仙客来又是非洲仙客来的祖先。 1 5 2 仙客来的栽培品种分类 研究认为近代的栽培品系都是由仙客来( c p e r s i c u mm i i i ) 的野生种 突变而来，而且大多数是4 倍体植株( 2 n = 9 6 ) ( 张敬方，1 9 9 3 ) 。现在 的仙客来品种大部分是从原种仙客来经多年培育改良而来，该原种有两个 变种，即大花形变种( v a r g i g a n t e u mh o r t ) 和暗红色变种( v a r s p en d e n s h o r t ) ( 姜世平，1 9 9 9 ；程盒水，2 0 0 1 ) 。仙客来的园艺品种繁多，其 品种分类至今没有统一的标准，多以花型分类，分为阜冠型( 此类型为仙 客来标准花型) 、平瓣型、洛可可型( r o c o c o ，又称灯笼型) 、大花型( 为栽 培品种的代表花型和重瓣型，多为不育类型) ( 陆绮人，1 9 9 2 ) 。2 0 0 2 年杜春山提出应用花色、花朵大小、花瓣形态、花瓣边缘性状、花朵气味 及叶片纹理六项指标，对仙客来品种进行分类。陆绮人依据花色、花型、 瓣型与香气进行分类( 杜春山，2 0 0 2 ) ，用来衡量仙客来的观赏价值。 但许多仙客来育种工作者常常根据自己的实际育种工作，把品种分成了多 个系列，如法国莫莱尔公司的“a t ina ”，“h a l lc s ”和迷你型“n e t i s ” 系列( 康黎芳，1 9 9 3 ；张敬方，1 9 9 3 ) 。 毒 1 5 3 仙客来的核型分析研究 在细胞学研究中，以仙客来的原始种为研究对象，有报道仙客来( c p e r s i c u m ) 是二倍体，染色体为4 8 ，但其野生种因基因突变或种内自然杂 交形成了许多四倍体( 2 n = 4 x = 9 6 ) 或非整倍染色体( 2 n = 9 0 、9 2 、9 4 和9 5 ) 的 栽培变种( h i s h i z a k a ，2 0 0 3 ) 。大部分仙客来的染色体数2 n = 4 8 、6 8 、 8 4 、9 6 ，以仙客来( c p e r s i c u m ) 、：- t l e 沙i t 仙客来( c a f r i c a n u m ) 、希腊仙客来 ( c g r a e c u m ) 、罗尔夫斯仙客来( c r o h i f s i a n u m ) 为主，其特点是耐寒性较 弱而耐热性较强。也有品种的染色体2 n = 2 0 、3 0 ，以西西里仙客来 ( c e i l i c i c u m ) 、小花仙客来( c c o u m ) 、塞浦路斯仙客来( c e y p r i u m ) ；为代表， 其中有的极不耐寒、有的不耐高温、有的不耐阳光等( 傅新生等，2 0 0 1 ) 。 7 仙客来种质核型分析及其分类的研究 国内9 0 年代傅新生等曾对引进的6 0 余种仙客来染色体进行研究，结果表明 不同品种染色体数目在2 0 9 6 条之间不等。 车代弟等利用r a p d 技术对2 0 个现今栽培的名优仙客来品种的分类 和亲缘关系进行研究，通过聚类分析将各品种材料分为4 个类群，证实了 目前栽培的仙客来绝大部分来源于仙客来( c y c l a m e np e r s i c u m m i l l ) 这个 种，各品种问的亲缘关系比较近( 车代弟等，2 0 0 2 ) 。但迄今大多数栽 培品种或经人工杂交选育成的品种( 系) 的染色体数和倍性还不清楚。 1 6 研究目的意义 仙客来是一种国际著名笳花，品种繁多，变异性大、中间类型多。国 内外许多学者对仙客来的起源、品种分类、栽培等方面进行了研究工作， 但是在细胞水平上对仙客来进行分类的研究还鲜有报道，迄今大多数栽培 品种或经人工杂交选育成的品种( 系) 的染色体数和倍性还不清楚，因此， 对仙客来进行核型分析，找出不同系列内、问的亲缘关系，对于仙客来良 种选育、品种分类等都具有重要的意义。 核型分析是观察分析染色体的方法之一，对于研究生物遗传变异、生 物系统的演化、物种之间的亲缘关系、某些生物的起源、远缘杂交及染色 体工程等有重要意义。而选材及分析方法是核型分析研究的关键，不同类 型的植物，其选材和分析方法千差万别。选取最适宜的方法进行核型分析， 才能得到最佳的实验效果。因此，在研究过程中，通过不同试验条件的尝 试，探索出一套适合仙客来核型分析的方法，可对仙客来核型分析的研究 提供一定的参考和依据。 1 7 本研究的内容 本研究以日本、美国、法国、比利时和中国5 个产地的2 0 个仙客来 种质为试材，结合常规制片技术，对仙客来制片技术条件进行了优化，研 究了不同种质的染色体形态、倍性、数目、核型特性等，分析了不同产地 仙客来染色体的一致性和差异性，利用聚类分析对染色体进行了分类，以 期为仙客来的起源、品种鉴定及优良品种的选育提供科学依据。 8 。 惫 山东农业大学硕1 j 学位论文 2 材料与方法 2 1 实验材料 本研究材料取自山东省泰安