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技术研究进展 吴 青 3 生物通 编辑部 北京 编者注 近年来的研究表明 一些小的双链 可以高效 特异地阻断体内特定基因表达 促使 降解 诱使细胞表现出特定基因缺失的表型 称为 干扰 也译作 干预或者干涉 研究表明它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机 制 由于可以作为一种简单 有效的代替基因敲除的遗传工具 可以毫不夸张地说 正 在功能基因组学领域掀起一场真正的革命 并将彻底改变这个领域的研究步伐 为此被 评为 年最重要的科研成果之一 收稿日期 2 2 3电子信箱 多年前 在对矮牵牛 进行的研 究中有个奇怪的发现 和同事将一 个能产生色素的基因置于一个强启动子后 导入 矮脚牵牛中 试图加深花朵的紫颜色 结果没看 到期待中的深紫色花朵 多数花成了花斑的甚至 白的 将这种现象命名为协同抑制 因为导入的基因和其相似的内源 基因同时都被抑制 开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象 后来 发现在其他许多植物中 甚至在真菌中也有类似 的现象 特别是在脉孢霉 中进行了详 细的研究 在这里被称为 现象 然而是什么原因导致这种基因沉默的现象 呢 尽管对于部分植物来说 转基因引发的基因 沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致 这被 称为 转 录 阶 段 基 因 沉 默 但确实有部分的植物中的基 因 沉 默 是 在 转 录 后 发 生 的 称 为 2 核转移实 验 2 表明同源转录本确 实有出现 但是很快在胞浆中被降解 没有积聚 转基因会引发 然而基因沉默也可能 被一些病毒诱发 一旦被引发 由一种可 扩散的反式作用分子介导 这首先在脉孢霉 中得到证实 和他的同事发现 基因沉默可以在异核体的细胞核之间传递 后 来 和同事进一步证实 在植物中 将出 现转基因导致基因沉默的植物嫁接到另一没有 基因沉默的植物中 同样可以诱发 在后 来线虫和果蝇的实验中我们知道导致植物中的 的反式作用因子是双链 1 在线虫中发现了 首次发现 能够导致基因沉默的线索 来源于线虫 的研究 年康乃尔大学的研究人员 和 尝试 用反义 去阻断 2 基因的表达以探讨该 基因的功能 结果反义 的确能够阻断 2 基因的表达 但是奇怪的是 注入正义链 作 为对照 也同样阻断了基因的表达 这个奇怪的现象直到 年后才被解开 华盛顿卡耐基研究院的 和马萨诸塞 大学 癌 症 中 心 的 首 次 将 双 链 正义链和反义链的混合物注入线虫 结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要 强得多的基因沉默 实际上每个细胞只要很少 几个分子的双链 已经足够完全阻断同源基 因的表达 后来的实验表明在线虫中注入双链 不单可以阻断整个线虫的同源基因表达 还 会导致其第一代子代的同源基因沉默 他们将 这种现象称为 干扰 第 卷第 期 中 国 生 物 工 程 杂 志 年 月 潜在的作用促使 和 继续 实验 将一种能够表达与 2 基因 同源的双链 的基因工程细菌喂食线虫 结 果线虫表现出类似 2 缺陷的表型 后继的 实验表明将线虫浸入双链 中同样可以诱导 基因沉默 这种技术使得大规模筛选线虫 诱导的功能缺失突变体成为可能 并引发 后继的大量针对这种模式生物基因敲除的研究 2 果蝇中的 在果蝇的研究中同样发现 尽管采用 能生产 的酵母喂食果蝇的实验以失败告 终 但是通过显微注射或者通过基因枪将 注入果蝇胚胎中 或者将带有反向重复序列的 导入果蝇中能够引发基因沉默 在过去的 几年中 技术在果蝇的研究中成为一种反向 遗传工具 用于鉴定功能缺失表型 注射的 如何引发基因沉默 在过去的 数年 中 多 个 研 究 小 组 进 行 了 不 懈 的 努 力 和 首先在发生协同抑制的植 物中鉴定出一些在没有发生基因沉默的植物中 并不存在的大约 个碱基大小的 这些 分别与沉默基因的正义和反义链互补 这 成为揭示 秘密的第一条关键线索 后来在果蝇细胞中的实验进一步揭示这个 秘密 在一系列著名的实验中 和同事发 现注入果蝇细胞的 被切割为 碱基 长短的 片段 他们同时发现 与 同源 的内源基因的 只在和 对应的部位 被切割成为 核苷酸长的片断 很快 的机制越来越清楚了 3 现有 机制模型 通过生化和遗传学研究 产生了现有的 作用机制模型 包括起始阶段和效应阶段 在起始步骤 加入的 被切割为 核 苷酸长的小分子干扰 片段 又被称为引导 证据表 明 一个称为 的酶 是 家族中特异 识别双链 的一员 能以一种 依赖的方 式逐步 切割由外源导入或者由转基 因 病毒感染等各种方式引入的双链 切割 将 降解为 的双链 每个片断的 端都有 个碱基突出 在 效应阶段 双链结合一个核 酶复合物从而形成所谓 诱导沉默复合物 2 激活 需要一个 依赖的将 解双链的过 程 激活的 通过碱基配对定位到同源 转录本上 并在距离 端 个碱基 的位置切割 尽管切割的精确机制现在 还是未知 研究表明每个 都包含一个 和一个不同于 的 酶 由于在一些生物中 的影响格外显著 有人提出在 途径中可能存在某个 信号 扩 增的步骤 这种扩增可能是复制外源注入的 从而产生更多的 也可能是直接扩 增 本身 这种扩增可能在 诱导沉默 复合物 形成过程进行 作为 形成的 补充 或者独立于 4 依赖的 聚合酶的潜在作用 对脉胞菌 线虫和拟南芥的基因筛查过程中 鉴定了几个显然对转录后基因沉默 和 过 程 起 关 键 作 用 的 基 因 其 中 包 括 2 2 2 和 2 在内的几个基因 都是编码 依 赖 的 聚 合 酶 2 的 这个现象很容易导致 依赖的 聚合酶活性是 所必须 的0这样一个结论 当然 如果真的存在聚合酶 扩增 或者 这一步的话 依赖 的 聚合酶的存在就有助于解释何以 诱导基因沉默有如此强大作用 但是这些基因 的突变体有不同的表型 这使得在 过程中 依赖的 聚合酶的作用难以确定 线虫 2 代表 2 0 突变体中 在肌肉细胞中正常出现 但在生殖系细胞中 也就是 2 主要表达的地 方 没有发生 在拟南芥 2 2 0代表 突 变体中 通过内源复制的 病毒引入 可以产生 但是通过转基因引入的 则不会产生 有人推断说可能是病毒本 第 期吴 青 等 技术研究进展 身的 依赖的 聚合酶 取代了拟 南芥突变体中的这些酶 虽然在果蝇和人类体 内还未发现 的类似物 近来的一篇文章报 道了在果蝇胚胎细胞中发现 活性 一种 称为随机降解 的模 型认为 以 为引物扩增模版 产生 底物提供给 酶 结果产生更多 的 在线虫的实验中找到了支持这种模 型的证据 但是同样在果蝇胚胎细胞的实验结果 则反驳了这种理论模型 5 的起始 两个线虫基因 2 和 2 0代表 0 据信是参与 的起始步骤 这些基因的突变体线虫即使注入 也不会 出现基因沉默 但是如果没有沉默缺陷的杂和亲 代将 传递到这种突变体中则会引发基因 沉默 线虫 2 基因属于一个大的基因家族 和脉胞菌 2 0代表 0 拟南芥 基因 0代表 0 早前 被鉴定参与拟南芥的发育 同源 尽管这些基因 在转录后基因沉默 中的作用不明 2 家族在哺乳动物中的一个成员已经被证实是一 个翻译起始因子 有趣的是拟南芥中的 突变体表现为协同抑制缺陷的同时也表现为叶 发育缺陷 所以 相关的一些酶或者过程 可能参与发育过程 6 的效应物 转录后基因沉默 的效应步骤的重要 基因包括线虫 2 和 2 基因 这些基因首 先是在一种杂和突变体线虫中发现的 这种杂和 突变体不能将 传递给他们的纯和子代 有 这两个基因突变的线虫表现为 缺陷 但是 引人注意的是他们同时表现出转座子活性提高 因此保持转座子沉默的某种机制看来与 和 相关 尽管 2 基因产物还未经识别 2 编码的蛋白有着和 的核酸酶结构 域同源的区域 以及一个人类 综合症 一 种快速老化的疾病 中出现的蛋白的同源区域 这个蛋白有可能是降解靶 所需要的核酸 酶 7 有着古老的根源 从遗传和生化的角度分别进行的研究同样 指出转录后基因沉默 可能在生命进化的 早期就存在 有人提出转录后基因沉默可能是 进化过程中一种抵御转座子或 病毒的防御 机制 可能在植物和动物分化之前就已经出现 有趣的是 许多研究人员都注意到 破坏 相关的基因通常导致严重的发育缺陷 这 个发现提示 与至少一个发育过程有着某种 联系 一组小分子 就是 可以通过对特定目标转录本的翻译抑 制来调控线虫的发育时钟 研究结果表明 线虫 2 和 2 是由那些大约 个碱基的 转录产物折叠成茎环节构后形成的 折叠的 分子被 酶 在线虫中称为 2 切割 成为 个碱基的 酶可以产生 和 表明 和 途径有一 个交叉点 最近 在果蝇 线虫和 细胞中有大约 个 新 的 大 约 个 碱 基 的 小 分 子 2 被鉴定出来 就像 2 和 2 这些 是在 前体分子折叠成茎 环二级结构后形成的 这些新发现的大约 个 碱基大小的 被认为是在基因表达调控过 程中起某种作用 其中至少有两个的产生已知 需要 酶参与 显然 在进化的过程中 利用 小分子 调控基因表达和 有共通之处 8 由长 引起的非特异基因沉默 在各种生物中 植物 原生动物 昆虫 线虫 中陆续发现了自然存在的 现象 哺乳动物 细胞中存在 的证据则费了一番功夫才找 到 将较长的双链 超过 个碱基对 转染 哺乳动物细胞会引起非特异的基因表达抑制 这 和在其他生物中的特异抑制不同 这种抑制可能 由于一种抗病毒应答反应 是通过以下两种途径 之一进行的 其中一条途径 长的 激活蛋白激酶 激活的 通过一系列的磷酸化使翻译起 始因子 失活 导致翻译抑制 在另外一个 中 国 生 物 工 程 杂 志第 卷 途径中 长 激活 导致非特异的 降解 多个研究小组证实在小鼠胚胎干细胞和至 少一个胚胎来源的细胞株中没有 介导抗 病毒应答 因此可能用长 在这些特定的 细胞中诱导特定的基因沉默 然而抗病毒应答 使得我们无法在多数其他哺乳动物细胞中用长 诱导 9 突破抗病毒应答的障碍 有趣的是不超过 个碱基的双链 并 不会激活 激酶途径 这个发现 再加上已 知在 线 虫 和 果 蝇 中 长 会 被 切 割 成 而 会诱导 促使研究人员研 究用 是否能诱导哺乳动物细胞的特定的 基因沉默 的确 通过瞬时转染导入的 能够以序列专一的方式有效诱发培养的哺乳动 物细胞的 的效率各有区别 最 有效的 能使靶 和蛋白水平降低 以上 最有效的 是 个碱基大小 端有两个碱基突出的双链 的序列 专一性要求非常严谨 与靶 之间一个碱基 错配都会显著削弱基因沉默的效果 不过 并非 所有符合条件的 都一样有效 其原因还不 清楚 可能是位置效应 的结果 尽管 和 的历史和机制都很吸引 人 但是大多数研究人员最感兴趣的 是 作 为强有力的研究工具在功能基因组学领域的巨 大应用潜力 由于 可以非常简单地代替基 因敲除来制备特定基因缺失表型的个体 从而研 究该基因的功能 并且可以大规模地开展研究 使得 成为当今研究领域最引人注意的技术 之一 现在 在果蝇 线虫和一系列植物的研究 中 技术已经广泛应用于探讨许多基因功 能的研究中 由于已知通过转染 可以在 哺乳动物细胞中诱发 更多的研究人员开 始用 作为一种工具研究人类 小鼠和其他 哺乳动物的细胞 特别是基因功能的研究 在植物 原生动物 昆虫 线虫中应用 技术相对是比较简单的 因为通过体外转录的方 法制备较长的双链 并不困难 但是在哺乳 动物 细胞 中 就麻 烦 多了 由于 超 过 的 会引起非特异基因沉默 实验表明 在哺 乳动物细胞内引发特异的基因沉默最有效的 是有 个碱基互补 两边 端各有 个 碱基突出 通常是 但是目前不清楚 对 的活性影响有多大 的一对 2 的 由于体外转录利用 聚合酶进行 体外扩增的时候 通常要求序列的为首 个碱基 为 或者 以提高合成效率 但是这两个额 外的碱基会大大降低 的活性 而且通常 体外转录很难高效合成这么小的 通常至少 要 以上 在较早的哺乳动物 实验中 是 通过化学方法合成的 除了老牌的 专业厂 家 公司可以提供高质量的 合成服 务以外 刚刚吞并了全球最大的 合成供应 商 和 合成供应商 的 公司 凭借 在 合成领域的雄厚实力 和声望 也开始提供 合成服务 化学合成 非常方便 简单 不受碱基的限制 但是合 成费用相当高 由于在哺乳动物细胞中不同的 的效率不一 一般一个靶基因需要至少设 计 对不同的 进行试点实验以确定 最有效的一个 这无疑提高了 的成本 通过改良的方法体外转录制备 相比 化学合成就比较经济 通过合成两段 2 的 作为模板 包括 个与 启动子引物 端 匹配的碱基 称为引导序列 和 个自行设计 序列的碱基 其中 个碱基 互补 末端带 两个碱基 分别进行体外转 录 转录产物混合成为 用特殊的单链专 一的核酸酶消化 的引导序列 由于该酶不能切 开 碱基也不能切双链 所以得到的产物 经过 纯 化 就 是 我 们 需 要 的 2 的 双 链 有 个碱基互补 端各有 个 突 出 一个试剂盒可以自行设计合成多个 灵活性和可控性都明显提高 特别是有多个 需要合成的时候 不失为一种经济的选 择 其中涉及的 合成的价格就便宜多了 即使是全球最著名的 合成供应商 也就是 块钱一个碱基 通过专用的 转染试剂 瞬时转染可以将这些 转入细 第 期吴 青 等 技术研究进展 胞内进行实验 到目前为止 注射和转染 到细胞或者 生物体内是运送 的主要方式 虽然基因 沉默效应可以持续好几天 也确实有例子可以传 给子代细胞 但最后还是会消失的 最近 有几 个研究小组开发一类表达载体 能够在瞬时转染 和稳定转染的哺乳动物细胞中持续表达 在载体上包含有 聚和酶 启动子 选用 启动子的原因在于这个启动子总是 在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成 遇到 个连续的 即终止 转录产物在 转录终止位点的第二个碱基处终止 非常精确 转录产物是没有 尾巴的 和一个 有 个 的转录终止位点 只要将编码一小 段对应目的基因特异序列的 其 能形成发 夹结构 就是回文结构 的 序列插入载体中 启动子的下游 转入哺乳动物细胞 载体 就能 表 达 出 发 夹 结 构 的 这种 很快在细胞中加工成为大 约 个碱基大小的类似 的分子 随后起 始 过程 引发基因沉默 这种能表达 的质粒确实能够下调特定基因的表达 抑 制范围包括外源基因和内源基因 采用这种方 法的优点在于 通过 表达质粒的选择标 记 载体能够更长时间地抑制目的基因表 达 当然还有一点 那就是由于