鸡β防御素1,6基因工程菌的构建及表达制备.doc

鸡-防御素-1,6基因工程菌的构建及表达制备鸡-防御素-1,6基因工程菌的构建及表达制备摘 要-防御素是鸡体内的一种重要抗菌肽，除了具有直接的杀菌、抗病毒作用外，它还参与机体免疫反应，有重大的开发利用潜力，当前生物医学的研究热点之一。本研究以鸡 -防御素 Gal-1 和 Gal-6 为研究对象，运用分子生物学技术，从安徽三黄鸡骨髓 RNA 中克隆出 Gal-1 和 Gal-6 基因片段，并分别构建 pET-28a-Gal-6 原核表达载体和 pPIC3.5K-Gal-1 真核表达载体。研究了重组 Gal-6 在大肠杆菌系统中高水平表达、重组蛋白的纯化和抗菌活性以及在酵母系统中重组 Gal-1 的高拷贝菌株筛选。本研究分两部分：1. 重组 Gal-6 在大肠杆菌中高水平表达、纯化和抗菌活性研究从安徽三黄鸡骨髓中提取总 RNA，利用设计的引物 P1/P2 从RNA 中扩增 Gal-6 基因片段，大小约为216 bp。将目的基因克隆到pMD-18-T 载体中，构建 pMD-18-Gal-6 克隆载体，转化大肠杆菌DH5，挑取阳性克隆进行测序。经 GenBank 的 BLAST 比对，同源性达到100 %。利用 PCR 技术从重组质粒 pMD-18-Gal-6 中扩增目的片段，并用 Sac I 和 Hind III 进行双酶切，与同样双酶切的质粒 pET 28a (+) 进行连接，从而构建重组表达质粒 pET-28a-Gal-6，并在 BL21 中进行融合表达。Tricine SDS-PAGE 电泳表明，表达的 Gal-6 融合蛋白分子量约为15 kD，主要以包涵体形式存在。加入诱导剂1 h 时，开始检出有蛋白的表达，在5 h 时其表达水平已接近最大量；诱导剂 IPTG 在0.2-1.0 M 范围内，对重组蛋白的产量没有明显影响。融合表达蛋白经过初步分离、变性、复性、镍柱亲和层析纯化，得到纯化蛋白的浓度为0.053 mg/mL。对纯化的融合蛋白进行生物学活性检测，结果表明对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌都产生抗菌活性。2. Gal-1 真核表达质粒的构建和高拷贝菌株筛选利用设计的引物 P3/P4 从总 RNA 中扩增 Gal-1 成熟肽基因片段，大小约为123 bp。将目的基因克隆到 pMD-18-T 载体中，构建 pMD-18-Gal-1 克隆载体，转化大肠杆菌 DH5，挑取阳性克隆进行测序。经 GenBank 的 BLAST 比对，同源性达到100 %。利用 PCR 技术从重组质粒 pMD-18-Gal-1 中扩增目的片段，并用 BamH I 和 EcoR I 进行双酶切，与同样双酶切的质粒 pPIC3.5K 进行连接，构建重组表达质粒 pPIC3.5K-Gal-1。用 Sac I 将 pPIC3.5K-Gal-1 线性化后，电击转入毕赤酵母 GS115 中。通过 G418 和实时定量 PCR 筛选高拷贝转化子，并通过 PCR 证明其表型。关键词：鸡 -防御素；克隆；基因重组；蛋白表达GENE ENGINEERING BACTERIA CONSTRUCTION OF -DENFENSIN-1,6 AND EXPRESSIONABSTRACTBeta-defensin, an antimicrobial peptide in poultry, shows antimicrobial and antiviral activity and function of enhances immunity. It is one of the focus for many scholars. The study mainly applied molecular biology and molecular cloning technology. The fragments of Gal-1 and Gal-6 were cloned from the marrow of Three Yellow chicken. The prokaryotic expression vector of pET-28a-Gal-6 and eucaryotic expression vector pPIC3.5K-Gal-1 were constructed respectively. High-level expression, purification and primary biologic activity of recombinant Gal-6 in Escherichia coli were investigated. High copy screening of recombinant Gal-1 in Pichia was investigated meanwhile.This study is divided into two parts:1. High-level expression, purification and primary biologic activity of recombinant Gal-6 in Escherichia coliTotal RNA from chicken marrow was extracted. A pair of primer P1/P2 was designed to amplify Gal-6 gene. A 216 bp fragment was obtained. The fragment was cloned to pMD-18T to construct cloning vector of pMD-18-Gal-6, which was transformed into DH5. The positive clone was sequenced and compared by BLAST of . The highest degree of identity in nucleotide was 100%. The 216 bp fragment was gained from recombinant pMD-18-Gal-6 plasmid by PCR amplification, digested with Sac I and Hind III enzymes and ligated into the Sac I / Hind III-digested pET-28a plasmid. This recombinant plasmid was transformed into the E. coli BL21 cells, used for expression of the fusion protein. The molecular weight of fusion protein showed about 15 kD in Tricine SDS-PAGE analysis. The cultivation parameters of the strain harboring expression plasmid were optimized to produce the fusion protein. The optimal conditions were determined as following: cultivation at 37 in LB medium, induction with 0.2mM IPTG, and post-induction expression for 5 h. The fusion protein was purified by immobilized Ni2+-charged affinity chromatography. The analysis of spectrophotometer revealedthat concentration of purified fusion protein was 5.3mg/L. Antimicrobial assays demonstrated that fusion protein had antimicrobial property against Escherichia coil and Staphylococcus aureus.2. Construction of eukaryotic expression vector and screening of high copy screeningA pair of primer P3/P4 was designed to amplify Gal-1 gene from total RNA. A 123 bp fragment was obtained. The fragment was cloned to pMD-18-T to construct cloning vector of pMD-18- T-Gal-1, which was transformed into DH5. The positive clone was sequenced and compared by BLAST of . The highest degree of identity in nucleotide was 100%. The 123bp fragment was gained from recombinant pMD-18-Gal-1 plasmid by PCR amplification, digested with BamH I and EcoR I enzyme and ligated into the BamH I/ EcoR I-digested pPIC-3.5K plasmid. The obtained recombinant plasmid was linearized by Sac I, and then transformed into GSI15 by electroporation. The high copy transformants were obtained by G418 and Real Time PCR screening. The phenotype of transformant was verified by PCR.These results provide scientific guidance for development and application of antibiotic of defensin in animal husbandry. Zheng Huilin (bioengeering) Supervised by Professor Zhang XingqunKEY WORDS:Gallinacin; Clone; Recombinant; Expression.目 录摘要1ABSTRACT3综述部分71 防御素的生物学活性及其作用机理71.1 防御素的生物学活性71.2 防御素的作用机理82 -防御素的研究进展102.1 -防御素的分子结构和分布102.2 -防御素的基因工程研究进展123 防御素的应用现状133.1 在医药行业的应用133.2 在食品行业的应用133.3 在农业上的应用143.4 在畜牧业上的应用144 主要研究内容154.1 Gal-6原核工程菌的构建及表达制备154.2 Gal-1真核工程菌的构建及高拷贝筛选15第一部分 重组Gal-6在 E.coli 中的表达、纯化和抗菌活性研究161实验材料161.1 实验动物161.2 菌株与载体161.3 主要工具酶及试剂盒161.4 其他相关试剂161.5 主要溶液及培养基的配制161.6 仪器设备172 实验方法182.1 Gal-6的克隆182.2 表达载体的构建232.3重组质粒转化BL21242.4 融合蛋白的表达和纯化243 实验结果273.1 总RNA的提取273.2 Gal-6基因片段的RT-PCR273.3 pMD-18-Gal-6克隆载体的构建283.4 pET-28a-Gal-6表达载体的构建293.5 融合蛋白的表达303.6 融合蛋白的纯化333.7 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度343.8 活性检测344 讨论354.1 Gal-6的克隆354.2 重组蛋白的表达形式354.3 融合蛋白的表达条件探索354.4 融合蛋白的变复性354.5 融合蛋白的纯化364.6 活性检测36第二部分 Gal-1真核表达载体的构建及高拷贝的筛选371实验材料371.1 实验动物371.2 菌株与载体371.3 主要工具酶及试剂盒371.4 其他相关试剂371.5 主要溶液及培养基的配制371.6 仪器设备372 实验方法382.1 Gal-6的克隆382.2 表达载体的构建402.3 质粒的大量抽提和单酶切402.4 GS115感受态的制备和电转化412.5 高拷贝重组子的筛选422.6重组子表型的鉴定433.实验结果433.1 Gal-1基因片段的RT-PCR433.2 pMD-18-Gal-1克隆载体的构建443.3 pPIC3.5K-Gal-1表达载体的构建443.4 重组质粒的电转化453.5 高拷贝重组子的筛选453.6 重组子表型的鉴定474 讨论474.1 Gal-1的克隆474.2 表达载体的选择474.3 重组质粒的线性化474.4 电转化474.5 高拷贝重组子的筛选484.6 重组子表型的鉴定48参考文献49已发表或已录用的主要学术论文 .55致谢.56综述部分抗生素的发现和在医学中的广泛应用极大提高了人类的健康水平，提高了人类的生活质量化，但是近年来由于抗生素的滥用引发的问题也日益引起人们广泛关注，例如：长期使用抗生素会导致耐药菌株的产生，为动物疾病的控制与治疗带来了麻烦 Kim A. Brogden et al. Antimicrobial peptides in animals and their role in host defences. International Journal of Antimicrobial Agents, 2003, 22: 465-478.；抗生素在动物性产品中的残留，可能导致人类基因发生突变，引起多种疾病2 Marwick C. Animal feed antibiotic use raises drug resistance fear. Journal of the American Medical Association, 1999, 282: 120-122.；抗生素的滥用还会破坏动物和人类体内的微生态环境，使免疫力下降，受感染机会增多，这类感染既可能是内源性感染又可能是外源性感染3 Gorbach SL. Antimicrobial use in animal feed-Time to stop. New England Journal of Medicine, 2001, 345: 1202-1203.,4 Arthur M, Reynolds P, Courvalin P. Glycopeptide resistance in enterococci. Trends Microbiol, 1996, 4: 401-407.,5 Jacoby,G. A. Antimicrobial-resistant pathogens in the 1990s. Annual Review of Medicine, 1996, 47: 169-179.。鉴于此，许多国家已经立法严格管理或限制部分抗生素的使用。因此寻找抗生素的替代品，成为当前的研究热点。国内外大量研究表明，动物防御素具有代替传统抗生素的潜力，主要表现在：抗菌谱广，免疫原性无或低，对人畜无毒副作用，无残留，无耐药性，热稳定性和溶解性良好，对较高离子强度或较大pH变化耐受性较好6 李斌, 云才, 肖永仁. 抗菌肽及其在畜牧生产中的应用. 吉林畜牧兽医, 2005, 10: 15-17.。因此，防御素越来越受到研究人员的关注。1 防御素的生物学活性及其作用机理防御素是一类碱性阳离子抗菌肽，相对分子质量为3500-4500左右，分子中含有6-8个保守的半胱氨酸残基，形成3-4对分子内二硫键，并通过半胱氨酸分子间二硫键使肽环形成反向平行的 -片状结构7 D. Yang, et al. -Defensins: Linking Innate and Adaptive Immunity Through Dendritic and T Cell CCR6. Science, 1999, 286: 525 -528.。根据其分子内半胱氨酸的位置和连接方式及前体性质的差异可分为 -防御素、-防御素、-防御素、昆虫防御素和植物防御素8 Ganz T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nature Review Immunology. 2003, 3: 710-720.。防御素具有广谱抗微生物作用，包括各种细菌、真菌和一些具膜病毒9 Yanjing Xiao, et al. A genome-wide screen identifies a single -defensin gene cluster in the chicken: implications for the origin and evolution of mammalian defensins. BMC Genomics, 2004(5): 56.，为机体抵御外界微生物侵袭的第一道屏障，在机体先天性免疫防御中发挥着重要作用10 Yang, D.Biragyn, A., Kwak, L.W., Oppenheim, J.J. Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal. Trends Immunol, 2002, 23:291296.。1.1 防御素的生物活性1.1.1 抗菌作用防御素对细菌、真菌等都具有广泛的杀伤活性11 Wu Z, Powell R, Lu W. Productive Folding of Human Neutrophil Alpha- Defensins in Vitro without the Pro-peptide. J.Am.Chem.Soc., 2003, 125(9): 24022403.。在体外浓度为10-100 g/mL 时即对大肠杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、嗜血流感杆菌、绿脓杆菌和真菌等具有一定的抗菌活性12 Alltcheva, N., M.Boniotto, I. Zelezetsky, et al. Effets of positively seleeted sequence variations in human and Macaca fascicularis -defensins2 on antimicrobial activity. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48:685-688.-13 Quinones-Mateu ME, Ledennan MM, Feng Z. et al. Human epithdial beta- defensins 2 and 3 inhibit HIV-1 replication. AIDS, 2003, 17(16): 39-48.，且研究发现防御素对革兰氏阳性菌的杀伤力明显要强于革兰阴性菌，这可能是因为革兰氏阴性菌的细胞壁会妨碍防御素与细胞膜的接触14 Bals R, Goldman MJ, Wilson JM. Mouse beta-defensin is a salt-sensitive antimicrobial pepfide present in epithelia of the lung and urogenfial tract. Infect Immun , 1998, 63(3): 1225-1232. 。植物防御素能广泛抑制真菌生长，被认为是真菌生长的有效抑制剂。-防御素和 -防御素也都有较强的抗真菌作用，兔 -防御素 Rab NP-1和 Rab NP - 2均可以在数分钟内以很低的浓度杀灭白假丝酵母菌15 刘媛媛, 赵宝华. 防御素的研究进展和应用前景, 中国医药生物技术, 2009, 4(4): 303-306.。牛的 -防御素 TAP、LAP 对白假丝酵母有抑制作用；企鹅 -防御素 Sphe-2可明显抑制真菌如白假丝酵母、热带白假丝酵母、烟曲霉菌和红色面包菌的生长16 余兴邦, 郭锁链, 乌翠兰等. 防御素研究进展. 动物医学进展, 2006, 27(8): 47-51. 。昆虫防御素对真菌无作用。1.1.2 抑制病毒和抗肿瘤作用防御素具有较强的抗病毒活性17 赵风立, 朱连勤, 乔彦. -防御素的研究进展. 饲料工业, 2007, 28 (10): 6-8.，能杀灭一些被膜病毒，如 HIV、流感病毒、疱疹病毒、水泡型口炎病毒，但对无衣壳病毒无效，这与其膜依赖性抗菌机制有关。Sihna 等用兔中性粒细胞防御素-1(RNP-l)处理单纯疱疹病毒-2 (HSV-2) 后，使病毒的感染力下降98 %以上18 Sihna S, Cheshenko N, Lehrer RI, et al. Np-l, a rabbit alpha-defensin, pervents the entry and intercellular spread of herpes simplex virus type 2. Antimicorb.Agents Chemother., 2003, 47(2): 494-500.。Biragyn 等把艾滋病毒-1(HIV-l)糖蛋白基因与 -防御素-2(BD-2)等树突状细胞的趋化剂融合后，能激发高滴度的病毒中和性抗体19 Biragyn A, Ruffini PA, Coscia M, et al. Chemokine receptor-mediated delivery directs self-tumor antigen effieiently into the class processing pathway in vitro and induces protective immunity in vivo. Blood., 2004, 104(7): 1961-1969.。人 -防御素 hBD-2 和 hBD-3 能有效降低口腔内艾滋病病毒感染，hBD-2 除了能直接灭活 HIV 外，还可抑制 HIV 在细胞内的复制20 Sun L L, Finnegan C M, Tina K C, et al. Defensins suppress human immunodeficiency virus infection: potential role in mucosal protection. Journal of Virology, 2005, 79: 14318-14329.。-防御素和 -防御素对病毒有抑制作用，而其它几类防御素对病毒是否具有抑制作用则未见报道。国内外大量研究表明：防御素可以趋化未成熟的树突状细胞与记忆性 T 细胞，增加免疫系统对肿瘤细胞的识别，还可以促进体内免疫因子的大量分泌和活化，引起机体的免疫应答，从而增强机体对肿瘤细胞的免疫监视作用21 Biragyn A, Rnflqni PA. Toll-like receptor 4-dependent activation of dendritic cells by -defensin-2. Science, 2002, 298(5595): 1025-1029.-22 Biragyn A, Coscia A, Nagashima K, et a1. Murine -defensin 2 promotes TLR-4/MyD88-mediated and NF-KB-dependent atypical death of APCs via activation of TNF -2. Leukoc Bio, 2008, 83: 1-11.。研究表明，防御素对艾氏腹水瘤 EAC、直肠癌 HR8340、肝癌细胞 BEL27402、人的官颈癌细胞 Hela、人的髓样白血病细胞 K552 株等都有杀伤作用23 韩玉萍, 翟朝阳. 抗菌肽的抗肿瘤作用. 生命的化学, 2006, 26(2): 181-183. ，对肾癌 SWl56、前列腺癌 DUl45、PC-3 和 LNCaP、膀胱癌 TSU-Prl、巨嗜细胞淋巴瘤 U937、淋巴细胞白血病 L121、人髓样白血病细胞 K562等多种离体癌细胞均有抑制作用24 Carrie Q, Sun L, Amold R, et a1. Human -defensin-1, a potential chromosome 8p tumor suppressor: control of transcription and induction of apoptosis in renal cell carcinoma. Cancer Res, 2006, 66(17): 8542-8549. -25 Reis E, Sousa C. Toll-like receptors and dendritic cells: for whom the bug tolls. Semin Immunol, 2004, 16: 27-34. ，且在相同剂量下，防御素只杀死肿瘤细胞，对正常细胞无毒性作用26 Hanson HL, Donermeyer DL, Ikeda H, et a1. Eradication of established tumors by CD8+T cell adoptive immunotherapy. Immunity, 2000, 13: 265-276. ，但这种抗肿瘤机制目前还不是很清楚。人和兔的粒细胞防御素在体外能介导肿瘤细胞的裂解27 Moser C, Weiner DJ, Lysenko E, et al. -defensin 1 contribuets to pulmonary innate immunity in mice. Inefet Immun., 2002, 70: 3068-3072.，这也从侧面证明了防御素的细胞毒作用。1.1.3 免疫促进作用动物源性防御素能激活重要的免疫细胞如记忆性的T细胞和树突状细胞，从而把非特异免疫作用与机体的特异性免疫机能有效的结合起来，高效率的发挥着抗感染作用。-防御素(1-3)有很多种免疫活性，可以诱导 Mast 细胞释放组织胺，是单核细胞、树突状细胞、T 细胞和多形核中性粒细胞的化学诱导剂，并且可以促进产生 TNF 和 L-128 方向明. -防御素-2研究进展. 浙江大学学报, 2006, 35 (6): 581 -584.。除此之外，防御素还具激素调节，以及对炎症、创伤及神经损伤的修复等作用29 Nozdrachev A D, Kolosova L I, Moiseeva A B, et al. The role of defensin NP-1 in restoring t he functions of an injured nerve t runk. Neurosci Behav Physiol, 2006, 36(3): 313-315.。1.2 防御素的作用机理1.2.1 抗菌机理防御素种类多种多样，抗菌谱也各不相同。不同的防御素的作用方式可能不同，同一种防御素与不同微生物作用时机理也可能不同。目前研究显示防御素的杀菌机理主要有以下几种：1. 破坏细胞膜，形成离子通道传统抗生素是通过消除微生物生长或生存的必要条件来达到杀菌的目的，如使酶失活变性，但是这种方式的缺陷是细菌只要改变一种基因就足以抵抗此类抗生素的攻击。而防御素则是通过中和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用以穿透细胞膜从而杀灭细菌就极大的减少的细菌耐药性的可能30 朱颐申, 王卫国等. 海洋抗菌肽研究进展. 高技术通讯, 2004(2): 105-110.。防御素的抗菌机制主要是由防御素的双亲结构和所带的正电荷引起的。防御素分子的氨基酸大都带正电荷，它可以与细菌细胞膜上带负电荷的膜磷脂分子形成静电吸附，从而使防御素分子结合到细菌脂质膜上。然后防御素分子的疏水端插入到细胞膜中并引导整个分子进入质膜。防御素分子具有水脂两性结构，它能破坏质膜上原有蛋白质和脂质的排列方式，从而改变膜的构象。这样，多个防御素分子相互聚集作用就形成了离子通道31 Wieprecht T, Apostolov O,Beyermann M, et al. Membrane Binding and Pore Formation of the Antibacterial Peptide PGLa:Thermodynamic and Mechanistic Aspects. Biochemistry, 2000, 39(2): 442452.，离子通道的形成会引起细胞内水溶性物质的大量流失，细胞因不能维持正常的渗透压而死亡。防御素可以通过电荷间的相互作用与细胞膜外层结构结合，普遍认为的作用方式有“穿桶式(barrelStave)”模式和“毯式(carPet)”模式(如图1)。“穿桶式”模式主要指防御素在生物电的作用下，结合在细胞膜表面，分子的疏水基因插入到磷脂双分子层的疏水部分，与膜表面垂直排列，在细胞膜中防御素聚合形成多聚体，形成横跨细胞膜的离子通道。“毯式”模型主要是防御素与细胞膜上带负电的细胞膜结合，平行的排列在细胞壁表面，形成类似“毯子”的结构。防御素的疏水部分在疏水作用和分子张力作用下，能够改变细胞膜的流动性和厚度，从而使细胞膜上出现孔洞，导致细胞质外渗或细胞外的物质进入到细胞内，严重时会引起细胞膜崩解，导致细胞死亡32 Shai Y, Oren Z. From“carpet” mechanism to do-novo designed diastereomeric cell-selective antimicrobial peptides. Peptides, 2001, 22(10): 1629-1641.。然而近来的研究又发现，仅仅是细胞膜的物理破坏不能杀死某些微生物，因此防御素必然还存在其他的杀菌机理33 Hancock RE and Chapple DS. Peptide antibiotics. Antimicrob Agents Chemother, 1999, 43: 1317-1323.-34 Matsuzkai K, Nakamura A, et a1. Modulation of magainin2-lipid bilayer interactions by Peptide charge. Biochemistry , 1997, 36: 2104-2111.。图1. 毯式和穿桶式模式示意图左图为毯式学说: A: 阳离子氨基酸末端亲水区结合到细胞膜表面, B: 出现孔洞, C: 膜崩解;右图为穿桶式学说: A: 防御素聚集在细胞膜表面, B: 插入脂质层出现孔洞2. 抑制胞外大分子的合成防御素对肽聚糖、几丁质及一些生物大分子合成、交联的抑制也可能是其重要的杀菌机理之一。例如，肽聚糖的合成依赖于细菌细胞膜的完整性和功能性，防御素对于肽聚糖前体的运输，膜上定位以及合成交联的影响使得细菌的生长受到抑制35 Chitnis SN and Prasad KS. Seminalplasmin, an antimicrobial protein frombovine seminal plasma, inhibits peptidoglycan synthesis in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett . 1990, 60:281-284。Harder36 Harder J, Bartels J, Christophers E, et al. Isolation and Characterization of Human Beta-Defensin-3,A Novel Human Inducible Peptide Antibiotic. Biol. Chem, 2001, 276(8): 57075713.等发现，人 -defensin-3能抑制细菌细胞壁的形成，使细菌不能维持正常的细胞形态而使生长受阻，并能使细胞壁穿孔，从而导致细胞死亡。3. 抑制胞内功能目前一些研究发现，防御素也能够破坏某些重要的胞内过程，从而促进细胞死亡。在某些实验中发现微生物能够在膜不完整的情况下存活更长的时间，这就预示着防御素可能有非膜破坏杀菌机制的存在。Fehlbaum 等37 Fehlbaum P, Bulet P, Chernysh S, et al. Structure activity Analysis of Thanatin, A21-residue Inducible Insect Defense Peptide with Sequence Homology to FrogSkin Antimicrobial Peptides. Proc.Natl.Acad. Sci.USA, 1996, 93(3): 12211225.发现用40 M 的thanatin 处理大肠杆菌1 h后，细胞的呼吸作用明显减弱，处理6 h后呼吸作用完全停止，从而推断 thanatin 可能是通过抑制细胞的呼吸来杀灭细菌。Mai38 Mai JC, Mi Z, Kim SH. A Proapoptotic Peptide for the Treatment of Solid Tumors. Cancer Res, 2001, 61(21): 77097712.等研究发现，将防御素 DP1 局部注射到小鼠的体瘤内，DP1 可以迅速诱导肿瘤细胞凋亡，因此诱导细胞凋亡也能是防御素作用机制中的一种。1.2.2 抗病毒机理近年来许多国内外研究结果表明，防御素抑制和杀伤肿瘤细胞的机制与杀菌的机制不尽相同，它比杀菌机制更为复杂。一方面，它能通过其细胞毒性，主要是对细胞膜、核膜、线粒体、细胞核染色体和细胞骨架等的损伤来达到杀伤肿瘤细胞的效果；另一方面，防御素能通过调动机体免疫机能，从体液免疫方面来抵抗癌细胞的入侵。最近有报道，防御素可以通过刺激体内的细胞因子来抑制肿瘤生长39 Biragyn A, Ruflqni PA. Toll-like receptor 4-dependent activation of dendritic ceels by -defensin-2. Science, 2002, 298(5595): 1025-1029. ,40 Boniotto M, William J, Jordan, et a1. Human -defensin-2 induces a vigorous cytokine response in peripheral blood mononuclear cells. Antimicmbial Agents and Chemotherapy, 2006, 50(4): 1433-1441. 。国内外研究表明，防御素对艾氏腹水瘤 EAC、肝癌细胞 BEL27402、直肠癌 HR8340、人髓样白血病细胞 K552株等均有杀伤作用41 韩玉萍, 翟朝阳. 抗菌肽的抗肿瘤作用. 生命的化学, 2006, 26(2): 181-183.。而且在相同剂量下，防御素只能杀死肿瘤细胞，却对正常细胞无毒性作用，这种抗肿瘤机制目前还不是很清楚。2 -防御素的研究进展2.1 -防御素的分子结构特点和分布-防御素一般由是由59-80个氨基酸组成，成熟肽大多由38-42个氨基酸组成，信号序列和前导序列是22-32个氨基酸残基，分子质量约为4-6 kD。-防御素的最大特点是含有6个保守的半胱氨酸, 分别以1-6、2-4、3-5连接形成3个二硫键，构成稳定的反相平行的3股反向平行的 -片层结构。二硫键和 -片层结构可以使小分子防御素紧密的联结，以抵抗蛋白酶的水解，使得其能在富含蛋白的吞噬溶酶体环境中保持其特性，这也是防御素与其它抗微生物肽的主要区别之处42 ENNO K LB VER, K NUT ADERMANN, AXEL SCHULZ. Synthesis and structure-activity relationship of -defensin 3,multi-functional peptides of the immune system. Journal of Peptide Science, 2006, 122: 243-357.-43 KRI SHNAK UMARIV, SHARADADEVIA, SI NGH S, et al . Single disulfide and linear analogues corresponding to the carboxyter minal segmen of bovine -defensin-2: Effects of introducing the -hair pin nucleating sequence D-pro-gly on antibacterial activity and biophysical properties. Biochemistry, 2003, 42: 9307 9315.。-防御素的基因中含有2个外显子和1个内含子，第1个外显子编码5端非翻译序列、信号肽和部分前导片段，而第2个外显子则编码部分前导肽、成熟肽和3端非翻译序列，终止密码子一般位于成熟肽的末端。图2. -防御素基因结构示意图1994 年 Harwing S. S.等44 Harwig S S ,Swiderek K M ,Kokryakov V N, et al. Gallinacins :cysteine-rich antimicrobial peptides of chicken leukocytes. FEBS Lett, 1994, 342(3): 281-285.在鸡嗜中性粒细胞中首次发现并分离出鸡 -防御素(Gallinacin)，得到3种相似的抗菌肽 Gal-1、Gal-1、Gal-2。1995年 Evans 等45 Evans E W, Beach F G, Moore K M, et al. Antimicrobialactivity of chicken and turkey heterophil peptides CHP1, CHP2, THP1 and THP3. Vet Microbiol, 1995, 47(324): 295-303.又从鸡和火鸡嗜中性粒细胞中分离纯化得到另外四种抗菌物质 CHP-1、CHP-2、THP-1 和 THP-3。Xiao 46 XiaoY, et al. A genome-wide screen identifies a single -defensin gene clusterIn the chicken:implications for the origin and evolution of mammalian defensins. BMC Genomics, 2004, 5: 56.等用生物信息学的方法，展开对哺乳动物防御素起源和进化规律的研究，并从鸡基因库中搜索到10个新的鸡 -防御素基因，并依次命名为 Gal-4 到 Gal-13。最近 GenBank 上又有新的 Gal-14 的注册登录。鸡 -防御素广泛的分布于机体的各种组织和器官中(图3)。Gal-1、Gal-2主要在骨髓和肺脏里表达；Gal-3主要在骨髓、舌、气管和法氏囊中表达；Gal-47主要在骨髓中表达；Gal-813可以在肝脏、肾脏、肇丸、卵巢及雄性和雌性的生殖系统中表达。图3. 鸡 -防御素在不同组织中的分布(引自陈燕姗，2005)47 陈燕珊. 禽类的重要免疫因子-鸡-防御素. 生命的化学,