兰花试管开花.doc

目前全世界兰科（Orchidaceae）植物约有800 属，2500030000 种。在中国，习惯把兰花分为国兰和洋兰。其中，国兰主要有春兰（Cymbidium goeringii）、蕙兰（Cymbidium faberi）、建兰（Cymbidium ensifolium）、寒兰（Cymbidium Kanran）、墨兰（Cymbidium sinensis）五大类；与之相对，洋兰则主要有：卡特兰属（Cattleya）、蝴蝶兰属（Phalaenopsis）、石斛兰属（Dendrobiun）、文心兰属（Oncidium）、万代兰属（Vanda），拖鞋兰属（Paphiopedilum）等1。花的形成是一个高度复杂的生物学过程，植物生理学和遗传学的研究已表明花的形成是高等植物所特有的一种生理现象，受到许多因子的调控2。而采用试管开花的技术，对于弄清各因子对花形成的作用具有一些显著的优点。目前，试管开花的研究主要围绕2 个方面：开花诱导和成花决定的表达。开花诱导是通过控制培养条件和培养基组成，诱导处于营养生长期的试管苗开花。成花决定的表达是从处于生殖生长的植株上采取花序、花柄、苞叶等作外植体，研究外部因子对花芽再生的影响3。在兰花离体培养中，常有试管开花现象的报道；离体培养开花系统，是研究兰花花的分化和发育的理想系统，可以用来探明兰花从营养生长向生殖生长的转变机制。通过研究各种因素对兰花试管开花的影响，进而阐明其调控机理，这在理论和应用上都具有重要的意义。1 兰科植物试管开花概述最早进行兰科植物试管开花研究的是法国的Julien Costantin4，他发现兰花在离体培养条件下缺少菌根可以促进开花。利用激素调控兰花试管开花方面，一直是研究的突破口，Goh C J5在研究单茎型杂种兰花整体植株花芽诱导和发育的调节作用时，发现了石斛兰整体植株的花芽发端，而且通过添加6-BA还可以促使花芽发育成熟并开花。冯莹等6在研究适宜春石斛开花的培养基中同样认为6-BA 有促进花芽的诱导，但是不能正常开放。随后李璐等7-8对春石斛试管开花进一步研究证实了冯莹的观点，并认为N、P、K比例、NH+-N：NO3-N、TDZ、PP333、椰汁对春石斛开花有显著影响；而且在铁皮石斛成花诱导率上获得显著提高。这与王再花等9的研究结果一致。在光周期途径诱导成花中，Kerbauy G B10以文心兰为材料进行试管开花试验，结果表明不同的光强和光周期有可能加快其开花进程。王熊等11探讨了素心建兰生长发育及花芽形成规律，并成功诱导出素心建兰的试管开花。Duan J X等12在离体条件下诱导了Doriella Tiny（五唇兰属Doritis pulcherrima Kingiella philippinensis）花芽的形成。随后，陆续有兰科植物试管开花的研究报道出现。目前为止，已成功诱导试管开花的兰科植物有：建兰11、寒兰13-14、春兰大花蕙兰杂种15、大根兰、蝴蝶兰16-17、Doriella Tiny12、文心兰10、Psygmorchispusilla18-19、Epipogium roseum20、Cymbidiumniveo-marginatum Mak.21、Bulbophyllum auricomumLindl22、Doritaenopsis and Phalaenopsis23以及石斛属中的部分品种（如春石斛7-8,24-25、铁皮石斛8,26、细茎石斛9、金钗石斛27、霍山石斛28、叠鞘石斛29、报春石斛30、Dendrobium Madame Thong-In31-32、Dendrobium Sonia1733、Dendrobium Chao Praya Smile34、FriedericksDendrobium35等）。2 兰科植物试管开花的成花调控2.1 植物生长调节剂对试管开花的影响植物生长调节剂是一类由人工合成的具有类似植物激素生理活性的化合物。植物花芽的分化与内源激素水平关系密切，因此可通过施用外源激素解除休眠、促进花芽分化达到提早开花。2.1.1 细胞分裂素的影响细胞分裂素具有诱导器官分化的作用。在研究兰科植物试管开花时，通过调节细胞分裂素比例，诱导其花芽形成和开放。Duan J X等12 在研究Doriella Tiny ( 五唇兰属DoritispulcherrimaKingiella philippinensis)的试管开花中，发现6-BA对花芽的形成有重要作用，在VW培养基中通过添加适量的BA 和蔗糖比例，可促进花芽的形成。另外，研究还发现在没有添加6-BA 的H培养基中，花芽能正常开放，而加入了6-BA后，花芽则不能开放；随后，Duan J X16在蝴蝶兰的试管开花中也得出类似结论。说明6-BA可诱导花芽形成，但对其开花起抑制作用。朱国兵等13在对寒兰的快繁和试管成花研究中发现，随着6-BA浓度的提高其花芽的诱导率呈抛物线状变化，当6-BA 浓度为2.0 mg/L 时，且蔗糖浓度为3.5%时，花芽诱导率达最高。冯莹等6-8在对春石斛离体开花研究中发现，6-BA必须在高浓度下才可以促进春石斛顶端花芽发育成熟并开花，但是高浓度6-BA会导致培养基出现不同程度的褐化，从而影响植株的各种代谢活动，间接影响试管苗开花；随后，进一步研究发现TDZ可高频诱导铁皮石斛试管开花；同时对春石斛试管开花有重要促进作用，提高TDZ浓度可促进其花芽诱导率，但会导致畸形花增多。在进行多因素试验中发现当TDZ 为0.1 mg/L 时，正常花数量增多。SimG E 等31-32 利用石斛兰杂交种Dendrobium MadameThong-In 诱导试管开花，发现6-BA可以促进花柄和花芽的形成；通过进一步研究发现，在液体培养基中添加6-BA、CW、腺嘌呤和腺苷可诱导其开花。另外，6-BA还可诱导其他石斛属植物（如：春石斛、铁皮石斛、报春石斛、Dendrobium Madame Thong-In、DendrobiumSonia 17、Dendrobium Chao Praya Smile 等）离体开花中花芽的形成6-7,26,32-34。2.1.2 其他激素的影响除了上述所举激素外，其他激素对兰科植物试管开花也有一定的作用。在试管开花过程中，TDZ和PP333也对兰科植物试管开花起着重要的作用。Ferreiraa W d M等36研究指出，在石斛兰的离体培养中，细胞分裂素和生长素对石斛兰花芽诱导有一定的作用，将经过细胞分裂素和IAA处理的材料转接至添加有TDZ的培养基中，花芽的诱导率显著提高。Wang Z H等24研究春石斛实生苗的高频率试管开花，发现添加适量PP333或TDZ 可诱导出花芽，而且PP333与TDZ以适宜的浓度配比使用，可大大提高其花芽诱导率，促进其开花。同样，李璐等8在研究中也获得类似结果。王熊等11在研究素心建兰的试管开花中发现NAA对试管开花有一定的作用，但是必须配合其他激素同时使用。Kostenyuk. I 等在Cymbidiumniveo-marginatum Mak 试管开花的研究中发现，NAA和6-BA 配合使用有助于花芽的形成；另外，研究还发现2,3,5-三碘苯甲酸会抑制蕙兰的试管开花，GA3会延缓开花，而PP33（3 一种抗GA3试剂）能够完全抑制细胞分裂素或修剪对诱导成花的作用21,37-38。Te-chato S等35在研究石斛兰（Friedericks Dendrobium）的试管开花时发现，PP333与花芽的诱导有关，而且可使其开出的花均为正常花。Than M M M等22在研究豆兰试管开花时，在MS中添加6-BA和NAA可促进其开花。Wang G等26在研究铁皮石斛的试管开花中发现，如果先将原球茎接于0.5 mg/L ABA的培养基上培养15 天，再转移到含有BA的MS培养基上，花芽诱导率明显提高，可达到82.8%，而且每株植株花的数目增加。王琳27、王再花等9在研究金钗石斛和细茎石斛试管开花的过程中，将实生苗经PP333和ABA预处理后，转移至含有PP333和TDZ的改良MS培养基中，诱导出的花芽开正常花比例较低；通过调整预处理时PP333与ABA的浓度和转接后PP333与TDZ的浓度，可大大提高花芽诱导率和正常花开放率。郑立明等15在研究春兰大花蕙兰杂种的试管开花时也发现类似结论。说明ABA在试管开花过程中对诱导花芽形成有明显影响，经过适宜的浓度以及适当时间的预处理，再转入含有6-BA的培养基上，对花芽诱导有促进作用39-40。2.2 培养环境对试管开花的影响2.2.1 温度和光照对兰花试管开花的影响春化作用途径和光周期途径是诱导植物成花的2 大重要途径。温度和光照对植物的开花有一定的影响。兰科花卉一般都需要经过春化过程诱导花芽的形成，所以在诱导其试管开花时适当的加以低温处理可能会促进其开花。Kerbauy G B10在研究文心兰试管开花时发现，不同的光强和光周期有可能促进其开花进程。Vaz A PA等18在研究光周期和温度对扇叶兰属植物离体生长和开花的影响时发现，长日照可促进其生长，而且对花芽形成有利，但是光照时间过长会影响其花芽发育，抑制开花，减短花期。Wang Z H等24在研究中发现，试管苗在25温度下培养，出现畸形花，而通过控制昼夜温差(23C/18C，白天/黑夜)进行培养，则可获得发育完整的花。可见，培养温度和昼夜温差对诱导兰科植物的正常试管开花有一定的作用，通过变温有利于试管花的形成，并可提高试管花的平均诱导率。适当的低温预处理有助于植物的开花诱导，并促进其开花；此外某些植物还要通过调整日照长短来调控其开花41-45，陈达菊等14以小桃红寒兰、仁化白小桃红为材料进行兰花试管花的诱导及成花机理探讨认为，短日照比长日照有利于试管花的形成和发育。这与扇叶兰属和寒兰等植物开花有一定的差异，说明不同种类、不同基因型兰花的试管开花对温度和光照的要求有所不同。2.2.2 营养条件的影响在离体培养中糖类既可以作为碳源，又可以调节培养基渗透压，对兰科植物试管开花有重要的影响。Limpanavech P 等46、Kananont N等47在研究壳聚糖对石斛兰试管开花的影响中发现，壳聚糖能促进花芽的形成，而且能够诱导植物提前开花并提高其花序的数量。朱国兵等13在寒兰试管成花研究中，通过调整B5培养基中N、P 及其糖的含量调控花芽的形成；当B5（1N，3P）、蔗糖浓度为3.5%时，为花芽诱导最佳培养基。王琳27、王再花等9在研究金钗石斛和细茎石斛时也调整了基本培养基MS的N、P、K比例，促进其开花。另外，调整铵态氮与硝态氮的比例，对试管开花也有一定的影响。Tee C S 等33通过调整培养基中N、P 含量发现：提高P 离子浓度并降低N离子浓度，对诱导开花有利；反之，则促进了根的形成。VazA P A 等18通过改变总的无机盐浓度（如N（NH4+ 和NO3-）、P、K、Ca 浓度的变化）时发现，总的无机盐浓度与形成的花芽数量呈负相关；低浓度N刺激花的形成，在培养基中铵态氮对植物生长和发育起重要作用，而缺少硝态氮会抑制其开花；高浓度的铵态氮有利于试管花的诱导，低浓度的铵态氮有利于试管花的发育；低糖无激素的培养基和低温有利于试管花的发育和正常开花14。另外研究还发现，P、K含量的减半可增加成花的数量。冯莹等6,8在研究中通过调整N、P、K比例和NH+-N 与NO3-N 比例，可促进春石斛试管苗开花；另外在其研究中还发现，通过添加适量的椰子汁，可提高培养基中的糖浓度和培养基的渗透压。综上发现对于调控N、P、K比例来诱导试管花的各项研究结果是一致的，说明铵态氮和硝态氮对开花确实有重要影响。总之，适宜的C/N比可促进兰花试管开花，从而也证实了碳水化合物途径诱导植物成花。3 兰花试管开花的分子机理及相关基因研究通过研究成花分子机理，可以了解兰花花发育过程中的基因表达模式和功能。目前，对花发育的研究已深入到分子水平，人们利用基因工程和组织培养技术产生突变体并克隆与成花有关的基因，已初步构建起了花器官发育的遗传模型。根据花发育过程的特点，可分为成花诱导、花的发端和花器官的发育三个过程，其中兰花试管开花主要研究它的成花诱导过程，该过程包括春化作用、光周期诱导、GA诱导、自主途径和碳水化合物诱导等多条调控途径48-50。在兰科植物中，DOH1 基因对植物的形态建成起关键作用，过量表达可完全抑制茎的形成和发育51；DoMADS1 是在过渡的茎顶端分生组织表达的一个标记基因，对调节兰花花期起重要作用52。Yu H等53利用其建立的石斛兰属品种Madame Thong-In离体开花系统，结果表明有5 个基因可能与花的转变有关；随后，Yu H等54通过进一步研究发现了一些与花发育有关的基因，如控制花芽的形成和提早开花的DOH1 基因，与花器官的形成有关的DoMADS1、DoMADS2 和DoMADS3 基因；Hsu H-F 等55 通过研究文心兰AP3-like MADS 基因OMADS3 调控花芽的形成和发生。随后，又将文心兰中克隆的AGL6-like 基因OMADS1 在拟南芥中进行异位表达，发现转基因拟南芥和烟草都有相似的表现型，即减小植物体积，开花明显提早以及失去无限花序56。邵寒霜等在研究LfycDNA高效单子叶植物表达载体（pBIL-1)的构建及转化兰花中，成功获得了一些卡那霉素抗性克隆57。郭滨等58从蝴蝶兰中克隆出pPI9 基因，结果表明该基因只在植株的生殖器官中表达，而在营养器官中不表达，推测其可能参与花形态建成过程的调节。此外与蝴蝶兰开花有关的基因中，PeMADS 基因也与花的形态建成有关，而且对兰花的寿命和子房发育也起着重要作用59-60。Phal-ACS 基因则是对蝴蝶兰授粉后的子房发育起作用，具有改变兰花花期的功能61。近年来，发现LRR-RLK 基因与植物成花有重要关系，Acevedo 等62 对野生型拟南芥的研究发现FLOR1 是植物特有的细胞内LRR，和AGAMOUS 有直接的相互作用，FLOR1 mRNA在花形成过程中的时空表达模式为：在特定的花序分生组织、花分生组织、雄蕊和心皮中表达，这与AGAMOUS 类似。为确认FLOR1 在分生组织、雄蕊和心皮中的转录及表达，研究了变异的花分生组织和花器基因（LEAFY，APETALA1，CAULIFLOWER，AGL8，APETALA2 和APETALA3）中的mRNA 表达模式，利用免疫定位试验表明FLOR1 转录物和蛋白有着相似的表达模式；李璐等8以春石斛原球茎为材料，克隆出LRR-RLK 基因的保守区序列和3端序列，经拼接得到1034 bp 的cDNA，并得到一个由531 个碱基组成的开放阅读框，编码176 个氨基酸；随后进行荧光定量表达分析发现，LRR-RLK 基因在原球茎阶段表达量较高，原球茎分化成幼苗时表达量逐渐升高，而到形成花芽阶段表达量降到最低，当花芽转变成花时，LRR-RLK 基因的表达量又逐渐上升。说明LRR-RLK 基因可能在春石斛花芽分化及花芽成熟过程中发