抗体的人源化.ppt

抗体的人源化 2 基因工程抗体 基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为平台 制备的生物药物总称 由于目前制备的抗体均为鼠源性 临床应用时 对人是异种抗原 重复注射可使人产生抗鼠抗体 从而减弱或失去疗效 并增加了超敏反应的发生 因此 在80年代早期 人们开始利用基因工程制备抗体 以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能 3 基因工程抗体优点 降低抗体的免疫原性 通过基因工程改造技术 可以最大程度地降低抗体的鼠源性 降低甚至是消除人体对抗体的排斥反应穿透力强 基因工程抗体分子一般比较小 更容易到达病灶的核心部位可以根据需要 制备多用途的新型抗体成本降低 可采用原核细胞 低等真核细胞和植物等多种系统表达 4 5 优点 鼠单抗对人而言有较强得免疫原性 可以产生较强的人抗鼠抗体 HAMA 反应缺点 生产成本比较高 难以大规模普及应用 鼠源性单克隆抗体 6 改造鼠源性单克隆抗体的目的 一是降低免疫原性二是降低相对分子量 增加组织通透性 7 Ig分子的结构模式图 8 原理 抗体同抗原结合的功能 决定于抗体分子的可变区 V 同种性免疫源性 决定于抗体分子的稳定区 C 9 一 人 鼠嵌合抗体 chimericantibody 在基因水平上将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的宿主细胞中表达 这种抗体称为人 鼠嵌合抗体 10 构建嵌合抗体的大致过程是 将鼠源单抗的可变区基因克隆出来 连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件 如启动子 增强子 选择标记等 的表达载体上 在哺乳动物细胞 如骨髓瘤细胞 CHO细胞 构中表达 11 二 改形抗体 Reshapingantibody 将鼠单抗的CDR区移植到人单抗的骨架区 就可能使人单抗获得同鼠一样的抗体特异性 并可以最大限度地降低鼠单抗的异源性 这样就得到了改行抗体 这种改造过的抗体也称CDR移植抗体 12 鼠单抗可变区人源化抗体 1 改形抗体2 表面氨基酸残基的人源化 镶面抗体将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中改成人源的 就成为了镶面抗体3 表位印迹选择表位印迹选择是一种与高效筛选噬菌体抗体库技术相结合的人源化抗体的方法 可以通过数轮筛选得到完全人源的抗体 13 小分子抗体 小分子抗体是完整免疫球蛋白的一部分 分子量比较小 小分子抗体包括Fab Fv或ScFv 单域抗体及最小识别单位等几种 14 小分子抗体有很多优点 可以用细菌发酵生产 成本低 分子小 穿透力强 不含Fc 没有Fc带来的效应 在体内循环的半衰期短 易清除 利于解毒排出 易于与毒素或酶基因连接 便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等 15 Fv ScFv 单区抗体 最小识别单位 Fab 16 三 Fab和Fv抗体 由完整的轻链和Fd组成 大小为完整分子的1 3 把Fab与细菌的前导肽相连 在前导肽的作用下Fab进入质周腔 装配折叠后 它具有结合抗原的活性 1 Fab 17 Fv ScFv的大小约为全分子的1 6 Fv ScFv 连接肽 2 Fv或ScFv 18 四 单链抗体 singlechainantibodySCA或singlechainFV SCFV 单链抗体 具有有分子量小 穿透力强 免疫原性小特点 可与效应分子相连接构建新功能的抗体分子 是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件 19 五 单域抗体和分子识别单位 1 单域抗体 由VH VL 单个可变区组成的 只有抗体分子的1 12 而且表面疏水性强 与抗原非特异结合能力也强 2 分子识别单位 MRU 是由单个CDR区构成的小分子抗体 亲和力较低 20 多功能抗体及其制备 一 双功能抗体二 多功能抗体三 抗体融合蛋白 21 一 双功能抗体 双功能抗体就是双特异性抗体 biospecificantibody bisFvs 一种非天然性的抗体 其结合抗原的两个臂具有不同的特异性 具有与两种抗原位点结合的能力 VLA linker VHB 22 应用 1 治疗作用 一条链针对抗原 一条针对免疫球蛋白 可与Ig结合 恢复抗体的全部功能 2 免疫诊断 例 全血凝集试剂免疫阻断抗体 细胞免疫组化抗体 23 二 多功能抗体 在单链抗体 ScFv 基础上发展了结合性能良好的多聚体 二聚体 三聚体和四聚体等 优点 克服了ScFv在体内清除过快的不足高亲和性能 可同时与细胞膜上相邻的两个或多个靶抗原结合 24 三 抗体融合蛋白 抗体融合蛋白 从广义讲应属于双功能抗体范畴 1 配基 配基型融合蛋白 如CD4 Fc 2 配基 Ig型嵌合抗体 如IL 2 Ig 3 配基 FV型嵌合蛋白 如CD4 FVCD3 4 受体 FV型融合蛋白 5 酶 抗体型融合蛋白 abeneyme 抗体酶 25 其中较为成熟的是配基 Ig型嵌合蛋白而酶 抗体型融合蛋白 即抗体酶 abeneyme 在药物治疗中应用前景广阔 它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物 避免对正常组织的伤害 此法称为抗体介导的酶前体药物治疗 抗体和酶的融合蛋白定位在肿瘤部位后再给予前体药物 提高了肿瘤区域药物的浓度 降低了对正常细胞的毒性 26 抗体工程 抗体研究进展的三个阶段 1890年Behring发现白喉抗毒素为代表 特点 用抗原免疫动物来获得多克隆抗体1975年Kohler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表1994年Winter以基因工程方法制备抗体为代表 27 一 噬菌体抗体库技术 获取目的基因 抗体库技术的载体 淘筛 表达与鉴定 28 二 噬菌体抗体库技术的特点 模拟天然全套抗体库 避开了人工免疫和杂交瘤技术 可获得高亲和力的人源化抗体 29 三 基因工程抗体的表达 原核细胞表达 真核细胞表达 转基因植物表达 转基因动物表达 30 抗体诊断试剂 抗原抗体特异性结合呈现某种反应 在体内体外均可发生 随着免疫学的发展 逐渐形成了三大类抗体诊断药物 即清学鉴定用的抗体制剂 免疫标记技术用的抗体制剂和体内导向诊断药物 31 一 血清学鉴定用的抗体试剂 血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型 主要用于疾病病原菌诊断和血型鉴定 包括 鉴定病原菌的抗体试剂乙型肝炎病毒表面抗原 HBsAg 的反向被动血凝诊断试剂妊娠诊断试剂 32 鉴定病原菌的抗体试剂 常用诊断血清的品种和用途 沙门氏菌属诊断血清 志贺氏菌属诊断血清 病原性大肠埃希氏菌诊断血清诊断血清的制备步骤 制备细菌抗原 免疫动物和制备抗体血清诊断血清诊断方法常用直接凝集反应 在细菌 红细胞等颗粒性抗原中加入相应抗体 在适量的电解质存在下 能形成肉眼可见的凝集块 33 34 妊娠诊断试剂 用乳胶试剂测定HCG的方法乳胶的致敏方法 35 抗ABO血型系统血清 36 二 免疫标记技术用的抗体试剂 给抗体标记放射性核素 荧光素或酶活性 能将抗原抗体反应放大 使常规不能观察的反应得以显现 可对微量抗原进行定性定量测定 灵敏度提高 结合显微镜技术 还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定 除临床诊断外 还能为探讨发病机制提供手段 类型 免疫荧光技术 免疫酶技术和放射免疫技术 37 一 荧光抗体诊断试剂 荧光抗体的制备荧光抗体 荧光色素如异硫氰酸荧光素 FITC 等标记抗体球蛋白 目的 诊断或定位 免疫荧光测定方法有直接法和简介法两种方法 38 二 免疫酶抗体诊断试剂 免疫酶技术 用酶标记抗体来检测抗原分为 免疫酶染色 组化法 和酶免疫测定 EIA 两种类型 39 1 免疫组化用抗体诊断试剂 原理 酶标抗体与抗原发生特异性结合 当加入酶的底物时 底物在酶的催化下发生组化反应 产生有色物质 40 2 酶免疫测定用抗体诊断试剂 用酶标记已知抗体或抗免疫球蛋白 抗抗体 与待查配体抗原混合反应后形成抗原抗体结合物后 再用适当方法分离出来 加入酶的底物进行显色 用分光光度计测定待测物质的含量 41 ELISA方法 可用直接法 夹心法和竞争法测定抗原 或抗体 42 常用的酶免疫测定用抗体诊断试剂 HBsAg酶标诊断试剂 HBeAg酶标诊断试剂 HAVAg 甲型肝炎病毒抗原 酶标诊断试剂 测定HIV 人免疫缺陷病毒 抗原的酶标抗体诊断试剂 甲胎蛋白 AFP 酶标抗体诊断试剂 癌胚抗原 CEA 的酶标抗体诊断试剂 43 生物素 酶标抗生物素蛋白系统抗体诊断试剂 44 三 放射免疫用抗体诊断试剂放射免疫技术是将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测技术 45 放射性核素标记抗体的方法 氯胺 T法 Iodogen氏法抗原的测定有 夹心法 间接法 竟争法 46 常用标记抗体试剂有 HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂 HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂 HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂 AFP放射性核素标记抗体诊断试剂 CEA放射性核素标记抗体诊断试剂 47 三 导向诊断药物 放射免疫显像优点 在体内确切肿瘤定位作用 准确性达90 灵敏度达100 在体内可检出0 5cm大小的病灶 并可检出肺脑的转移灶 小分子抗体易到达肿瘤部位 可显著提高N NT值 抗体在肿瘤部位可保留6 9日 能观擦抗体在血中的半衰期和可能出现的不良反应 48 放射免疫显像定位技术将抗肿瘤单克隆抗体 Ab 与二乙基三胺五乙酸 DTPA 在体外偶联成Ab DTPA 再注入体内后 就能与体内组织相结合 由于抗体分子量大 需3天完成 3天后注入放射性核素In 113M 半衰期100m 因DTPA是重金属离子络合剂 所以In 113M可以结合到DTPA分子上 使肿瘤组织显像 这一过程在2小时内可完成 49 抗体治疗药物 目前的客观现实是 研究进展迅速 但未达到常规治疗的应用阶段障碍 原因 抗体相对分子质量大 穿透力低 不能达到靶部位或摄取量低 鼠源性抗体的排斥反应 50 一 放射性同位素标记的抗体治疗药物优 操作简便 用量少 能观察到药物在体内的分布和药物动力学 缺 同位素来源困难 需放射线保护和污物处理 51 二 抗癌药物偶联的抗体药物常用的抗癌药物 氨甲喋呤 methotrexate MTX 阿霉素 adriamycin ADM 丝裂霉素 mitomycin MMC 环磷酰胺 cyclophosphamide CTX 新抑癌蛋白 neocarzinostatin NCS 正定霉素 doxorubicin DOX 等 52 抗体导向酶 前药疗法选用单抗导向原理 与前药专一性活化酶交联并选择性地结合于肿瘤部位 使前药可区域特异性地在肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子 有效增加肿瘤部位浓度降低正常组织中浓度 53 三 毒素偶联的抗体药物免疫毒素 毒素 抗体 免疫毒素及其换代制品在导向药物中 毒素和抗体的交联物称为免疫毒素 54 第一代免疫毒素是包含有A B链完整毒素和抗体的交联物 其中B链非特异性结合 使其仅在体外应用 第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物 因避免了第一代免疫毒素的非特异性 故能在体内有一定的抗肿瘤作用 第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗体基因重组表达 特异性好 稳定性强 渗透性佳