抗生素残留量检验检方法-微生物抑制法.doc

QS-F006作业指导书 第1页共3页文件编号：QC-WI017（1） 文件名称：抗生素残留量检验检方法-微生物抑制法拟制：审核：批准：工具设备/检验器具：均质机、离心机、平皿、克氏瓶、恒温培养箱、牛津杯、蒸汽杀菌锅、游标卡尺一、抽样 抽样数量批次原料鳗数量（Kg） 抽样条数 检体数 12000 3 1 20005000 6 2 500110000 9 31000115000 12 41500125000 15 525001 21 7二、测定方法1.检测原理：用含有敏感菌的琼脂作成平板，上放小管或滤纸片，在管中或纸片上滴加已知抗生素标准液和未知试样液，经培养后，抗生素标准液管或纸片周围琼脂不生长细菌，即为抑菌圈，如试管周围也出现抑菌圈表示含有抗生素。2、菌种： ATCC9341藤黄微球菌（检测青霉素、氨基糖苷类）ATCC6633枯草芽孢杆菌（检测大环内酯类）ATCC11778蕈状芽孢杆菌（检测四环素族类）。3.试剂和材料 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。（1）标准液：a.土霉素(四环素类)：用0.1N盐酸溶解后加入适量的灭菌去离子水配制成100mg/L（ppm）母液,用PH4.5磷酸缓冲液稀释至0.1 mg/L（ppm）。b.卡那霉素(大环内酯类) :用灭菌去离子水配制成100 mg/L（ppm）母液，用PH8.0磷酸缓冲液稀释至0.1 mg/L（ppm） c.氨苄西林（氨基糖苷类）：用灭菌去离子水配制成100 mg/L（ppm）母液，用PH8.0磷酸缓冲液稀释至0.1 mg/L（ppm）（2）缓冲液：a.柠檬酸、丙酮缓冲液1/5M柠檬酸溶液和1/2M氢氧化钾溶液等量混合溶液：丙酮：蒸馏=35：35：30比例调制。 1/5M柠檬酸溶液：称取柠檬酸4.2g 用蒸馏水定容至100ml。1/2M氢氧化钾溶液：称取氢氧化钾2.8g用蒸馏水定容至100ml。 b PH4.5磷酸缓冲液: 称取磷酸二氢钾13.6g用蒸馏水定容至1000ml。c PH6.0磷酸缓冲液: 称取磷酸二氢钾8.0g及磷酸氢二钾2.0g用蒸馏水定容至1000ml。d PH8.0磷酸缓冲液: 称取磷酸二氢钾0.523g及磷酸氢二钾16.73g用蒸馏水定容至1000ml。 安全预防措施：环境控制要求：参考标准/法规/验收准则：日本畜水产食品中的残留抗生物质简易检查法SN/T 1750-2006残留抗生物质为“阴性”必要的记录：预难检验记录表原料检验记录表成品检验记录表人员配备： 1人1增加参考标准,修改必要的记录2007.10.802003.11.13修订次修订内容生效期 QS-F006作业指导书 第2页 共3页文件编号：QC-WI017(1) 文件名称：抗生素残留量检验检方法-微生物抑制法拟制：审核：批准：PH4.5、6.0及8.0磷酸缓冲液要用时才配制，如要保存要在121高压杀菌15分钟后密封保存。但如有混浊或有沉淀物时不可使用。4.试验菌的保存 用普通的细菌斜面培养基30培养18小时后确认试验菌在斜面全体上发育后密封冷藏（0-4）保存。下代移植每隔一个月至一个半月执行。三、测定步骤1.菌悬液的制备a.ATCC6633枯草芽孢杆菌将二代保存的菌株接种于普通细菌培养基平板上，30培养一星期后形成芽孢。用灭菌生理盐水洗下平板上发育的菌苔，用65加热30分钟，再于3000rpm离心20分钟后取掉上清液。让沉淀物在悬浮在灭菌生理盐水中，这就是芽孢原液。b.ATCC9341藤黄微球菌 将二代保存的菌株接种于增殖用肉汤中，30培养18小时的培养液作为试验菌液。c.ATCC11778蕈状芽孢杆菌 将二代保存的菌株接种于普通细菌培养基平板上，30培养一星期后形成芽孢。用灭菌生理盐水洗下平板上发育的菌苔，用65加热30分钟，再将它至于3000r/min离心20分钟后取掉上清液。让沉淀物在悬浮在灭菌生理盐水中，这就是芽孢原液。注：芽孢要染色显微镜观察确定芽孢达到80以上才可。如果芽孢形成率达不到要求再培养数日即可，但如果培养10天以上，芽孢形成率还达不到的话，试验菌可能变异，该试验菌不可使用。菌悬液冷藏（0-4）保存。2.检定平板的制备在测定前，需进行预测试，以求得菌悬液最佳使用量。ATCC6633枯草芽孢杆菌的检定用平板，加0.1 mg/L（ppm）的标准工作液后,用30培养18小时后产生的抑制圈清晰、完整直径为121mm的菌悬液量为最佳。ATCC11778蕈状芽孢杆菌的检定用平板，加0.1 mg/L（ppm）的标准工作液后,用30培养18小时后产生的抑制圈清晰、完整直径为121mm的菌悬液量为最佳。 将检定用培养基冷却至50左右，加入最佳量的菌悬液，使其充分混合后，每个平板注入8ml作为检定用平板。所用平板需当天制备。3.样液制备称取10.0g肉、内脏，加入柠檬酸-丙酮缓冲液20mL均质振荡后，80水浴保温20分钟，3000rpm离心15分钟后取上清液作为测试用提取液。4.样液的测定 四类抗生素（青霉素类、氨基糖苷类、四环素族类、大环内酯类）残留量的检测：在制备好的检定用平板的底部作好标记，上放牛津杯，分别滴加样液、标准液及阴性对照液（提取液），每份样品做两个平板上的平行试验，冷藏放置30分钟后，置301培养181小时。四、结果报告：抑菌圈直径在10mm以上者为阳性，同时确认抗生素标准对照的抑菌圈在12mm以上。抑菌圈小于10mm，大于8mm的视为可疑，必要时重新测试，或用其它方法进行确认。五、试剂盒检验方法试剂盒内提供AM8培养基干粉1瓶、AM5培养基干粉2瓶，藤黄微球菌ATCC9341菌悬液1瓶、枯草芽胞杆菌ATCC6633芽胞悬液1瓶、蜡样芽胞杆 QS-F006作业指导书 第3页 共3页文件编号：QC-WI017(1) 文件名称：抗生素残留量检验检方法-微生物抑制法拟制：审核：批准：菌蕈状变种ATCC11778芽胞悬液1瓶，土霉素标准纸片、红霉素标准纸片、卡那霉素标准纸片。1.样品制备：方法同三3。2.提取缓冲液配制：同二3（2）。3.检定用平板的制备（1）检测用培养基准备：将3瓶检测用培养基分装3个三角烧瓶内，各加入100mL蒸馏水，作好标记，121，15分钟高压灭菌后冷却到50备用。（2）平板制备：三种菌液（必须充分振荡至无细胞沉淀物）各取1mL，分别按下表所示加入各自对应的检测培养基内，充分混匀（约10秒）后倾倒平板，每块平板约8mL。 菌种培养基ATCC9341AM5ATCC6633AM5ATCC11778AM8注：尽可能在无菌环境中倾倒平板，打开盖放置于水平台面上冷却1-2分钟后再盖上以减少冷凝水。未用完的平板密封后置4-8，可保存2-3天。4.样品检定在制备好的检定用平板的底部作好标记，用灭菌镊子将检测用滤纸片浸入提取液，吸足提取液后，放置在制备好的琼脂平板上（也可先将纸片放置于平板上用加液器在每片滤纸上滴加90-100L提取液），用镊子轻压使其固定，每块平板放置4-6片滤纸片，通常每份样品需做两个平板上的平行试验。每一批样品做1-2个抗生素标准对照，用灭菌镊子将对照用标准纸片放置在相对应的琼脂平板上（见下表），用加样器在每片对照标准纸片上滴加100L灭菌蒸馏水，轻压使其固定。已加好样的平板4冷藏放置30分钟后，30培养18小时。 试验平板ATCC6633平板ATCC9341平板ATCC11778平板对应使用的对照标准抗生素纸片卡那霉素标准纸片红霉素标准纸片土霉素标准纸片5.检验结果的判定抑菌圈直径在12mm以上者为阳性，同时确认抗生素标准对照的抑菌圈在14mm以上。抑菌圈小于12mm，大于10mm的视为可疑