（耳鼻咽喉科学专业论文）跨血迷路屏障内耳给药的实验研究.pdf

华中科技大学同济医学院 2 0 0 2 级硕士学位论文 前言 内耳系统疾病 包括耳蜗与前庭 是临床上一类较难治疗的耳科疾病 感音 神经性听觉损害 眩晕 耳鸣等症状严重影响患者的工作能力与生活质量 全身 药物治疗仍是目前最常用的方法 但由于血一迷路屏障的存在 通过口服 肌肉 或静脉注射进入体内的药物难以到达内耳系统 因此治疗效果一直不理想 为达 到有效浓度而加大药物剂量的做法常因副作用而对其他组织器官产生不良影响 内耳局部给药的基本原理是 经中耳路径使药物通过半透膜 圆窗膜 跨 越血一迷路屏障直接进入 或渗入 内耳组织间隙 因此 所需的剂量极小 对 其它器官几乎无任何副作用 且药物的分布更加直接 迅速 但由于内耳结构的 精细与复杂 局部给药在技术上有一定难度 因此目前临床仍以全身给药治疗为 主 迄今 内耳疾病的局部给药方法主要有以下四种 经鼓膜直接注射给药 鼓 室预置载药材料 半植入式微虹吸管给药和半植入式微管给药 上述方法都是通 过内耳与中耳唯一的膜性间隔一圆窗膜一的通透性实现给药 在微创性和缓释性 延长药物的作用时间 方面各具优缺点 其中 通过鼓膜向鼓室直接注射药液 的方法最具微创性 结合近年来药物缓释剂型的飞速发展的成果 向鼓室内注射 缓释剂的策略体现了缓释技术与微创方法相结合 可能成为最优化的给药方式 目前 仅有极少数学者在这方面进行过初步探索 b a l o u g h 1 9 9 8 等向栗鼠 中耳注射纤维蛋白凝胶 f i b r i ng l u e 与庆大霉素的混合物 即以此凝胶态纤 维蛋白为庆大霉素的缓释载体进行鼓室注射给药 殷团芳 1 9 9 8 等将透明质酸 和链霉素的混合物灌注圆窗 这些研究大多用增加药物粘度的方法以期延长药物 在中耳的停留时间 然而药物往往经过较大的载体分子问隙在短时间内经咽鼓管 流失 因此这些研究并非药剂学严格意义上的控释给药 近年来 天然高分子材料 如藻酸钠 壳聚糖 胶原 纤维蛋白凝胶 透明 质酸和明胶等 以其生物相容性好和可降解特性成为倍受关注的载药材料而被用 于临床多个领域 这些材料经改性后有望成为可注射的半固体药物载体或微包 囊 尤其是海藻酸和壳聚糖 前者荷负电 后者荷正电 两者可通过静电相互作用 控制药物释放 因而广泛用于药物 生物制品 疫苗及细胞的载体的制备 2 华中科技大学同济医学院 2 0 0 2 级硕士学位论文 为了寻求和研发合适的内耳缓释制剂 本实验在首都医学发展基金 2 0 0 2 2 0 1 2 重点项目的资助下 严格按照药剂学的要求进行了初步的探索 通过动物实验证明藻酸钠凝胶对豚鼠内耳结构无毒性 成功设计了圆窗膜离体通 透试验装置 并检验了其可靠性 利用该装置在严格的体外条件下 筛选并比较 了不同载体制剂通过圆窗膜的特性 利用药代学数据筛选合适的缓释制剂 用藻 酸钠与壳聚糖为载体材料 以地塞米松为模型药 该药是治疗突发性耳聋常用的 药物 制备了不同的地塞米松缓释制剂 利用上述圆窗膜离体通透试验装置比 较和筛选出了最具缓释特性的地塞米松制剂 本研究旨在选择合适的高分子材料作为载体 为制备可注射性内耳缓释制剂 如氨基糖苷类药 类固醇激素及多肽因子 奠定实验基础 为内耳疾病的治疗 提供更科学 更有效的手段 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 级硕士擘位论文 摘要 第一部分 藻酸钠凝胶对豚鼠听泡结构影响的观察 目的探讨海藻酸凝胶作为药物载体在某些耳部疾病局部治疗中的应用前 景 方法向豚鼠听泡注射藻酸钠溶液及交联剂氯化钙溶液 观察投药后第一周 和第二周中耳黏膜 圆窗膜 咽鼓管及耳蜗的形态学改变 结果所有动物在实验进行的1 2 周内未出现摆头 躯体旋转等前庭刺激症 状 观察期内未见发生鼓室积液 可见圆窗膜轻度增厚 咽鼓管黏膜黏液分泌细 胞消失 但圆窗膜和咽鼓管均未见炎性细胞浸润 中耳黏膜以及耳蜗形态正常 两周内药物尚未完全降解与排空 结论本研究提示 藻酸钠凝胶对听泡内组织无致炎性 无免疫排斥反应 对内耳结构具有安全性 通过对藻酸钠浓度和剂量的调节 可满足载药后局部应 用的需要 关键词 海藻酸钠 豚鼠 圆窗膜 耳蜗 咽鼓管 第二部分 离体圆窗膜通透试验装置的建立与质量控制 目的制备离体圆窗膜通透试验装置 并进行质量控制 为经中耳 内耳问 跨膜药理学研究提供技术平台 方法模拟中耳腔及鼓阶外淋巴腔环境 构建由离体豚鼠的圆窗膜组织 f r a n z 扩散池 玻璃 聚乙烯组件 组成的离体通透试验装置 检测该装置有无渗 漏 以亚甲基蓝为模型药物 检测三小时内的药物通透量 结果本文设计并构建的离体圆窗通透试验装置符合药理学实验的基本要 求 检测该装置性能良好 无渗漏 经连续3 小时观察 亚甲基蓝的累积释放量 符合零级方程 4 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 级硕士学位论文 结论本实验成功构建的离体圆窗通透试验装置 符合药学实验质控标准 本装置的建立为中耳一内耳之间的跨膜给药研究提供了有价值的实验平台 关键词 f r a n z 扩散池 体外试验 释放量 圆窗膜 第三部分 离体圆窗膜对地塞米松不同制剂的通透性 目的利用离体圆窗膜通透试验装置 分析海藻酸钠 a l g i n a t es o d i u m a l g l 羧甲基甲壳胺 c a r b o x y m e t h y l e dc h i t o s a n c h i 两种缓释辅料对地塞米松 透膜释放的效力 方法制备不同浓度的海藻酸钠和羧甲基甲壳胺的地塞米松磷酸钠制剂 利 用圆窗膜离体试验装置 于9 小时内的不同时间点采样 用高效液相色谱 h p l c 法测定各时间点样品的浓度 推算地塞米松对圆窗膜的累积通透量 并进行释放 方程拟合 结果不含缓释辅料的对照组地塞米松在给药后3 小时内迅速通透圆窗膜 3 小时后接近平衡 2 5 9 1 海藻酸钠分别与4 9 l 6 酣羧甲基甲壳胺的配方对地塞 米松的缓释作用最强 p o 9 9 9 证明其线性相关性良好 2 2 装置对亚甲基蓝试验液的通透性 将测得的样品吸光度 带入标准曲线求得各个时间点的浓度 c 用公式 o c y 妻i c 算得各个采样点的累积释放量 q 其中g 时测浓度 介质体积 本实验为接受室的体积1 2 m l 屹 取样体积 本实验为0 2 m l 表2 图6 1 9 华中科技大学同济医学院 2 0 0 2 级硕士学位论文 将q 分别代入零级 h i g u c l l i 释放方程 1 q 进行拟舍 得到每种方程的回归方 程及系数 表3 零级方程 q o 0 9 3 4 t 1 2 1 5 6 r z o 9 0 8 4 h i g u c h i 方程 q 0 6 8 3 3 t 娩一3 7 7 1 r 2 0 8 2 5 相关系数r 2 进行t 检验 t 6 1 3 7 p 0 0 2 6 o 9 9 9 据此可以认为 其浓度在o 1 8 0 u g m l 时对吸光度具有良好的线性相 关性 图5 本实验以1 0 m g m l 亚甲基蓝溶液作为释放液注入供给室 d 时内亚甲基 蓝逐渐经圆窗膜渗透到接受室 可观察到接受室内液体的颜色逐渐变蓝并加深 药物在三小时内的吸光度由o 0 3 5 到0 6 5 处于标准曲线的范围内 o 0 2 到1 2 表1 比较其累积通透量的模拟方程 零级和h i g u c h i 方程 表3 相关系数r 2 进行t 检验证明两种方程的有统计学差异 t 6 1 3 7 p o 0 2 6 0 0 5 三小时内 亚甲基蓝对圆窗膜的通透更符合零级释放 即符合表面扩散机n t l 9 并且可以 证明该离体通透装置的可靠性 在后续的实验中可以根据实验要求 应用不同的 药物代替亚基甲基蓝 观察更长时间内药物与检测 华中科技大学同济医学院 2 0 0 2 级硕士学位论文 表1 标准液不同浓度所测得的吸光度 浓度 u g m 1 吸光度 a b s 0 1 o 2 0 5 1 1 5 7 8 o 0 2 0 0 6 0 0 7 0 1 2 0 1 9 o 8 9 1 0 2 表2 圆窗膜离体试验装置对亚甲基蓝的通透性 n 3 表3 亚甲基蓝在3 小时内释放量的拟合方程 拟合方程 相关系数r 2 零级方程q o 0 9 3 4 t 一1 2 1 5 6 0 9 0 8 4 h i g u c h i 方程q o 6 8 3 3 t 1 3 7 7 1 o 8 2 5 表4 本实验设计的离体圆窗膜试验装置与w i t t e 2 0 0 0 o 的比较 w i t t e 2 0 0 0 嘲 本实验改进之处 牙科水泥对离体 粘连材料 环氧树脂 圆窗膜除外 牙科水泥圆窗膜组织刺激 小 中耳腔侧与外淋巴腔侧 中耳腔侧 0 2 m l本实验给予药物 给予液体外淋巴腔侧 溶液的体积比更 均为4 m l 1 2 m 接近生理状况 4 天 从开始观测到实验 2 天 从取圆窗膜时间越短离体圆 实验时间到实验结束 包窗膜的活性保存 结束 括观测过程 越好 华中科技大学同济医学院 2 0 0 2 级硕士学位论文 表5 本实验设计的离体圆窗膜试验装置与f r a n z 扩散池相 1 5 1 6 比较 f r a n z 扩散池本实验补偿措施 星形搅拌子有无 每次取样前及取样过程中摇晃数次 恒温水夹层有无保持实验过程中的室温为2 5 粘连材料无有无刺激且防水的牙科水泥 并在整 个实验过程中密切注意粘连处的渗 漏情况 一但发现即淘汰该标本 图1f r a n z 扩散池常用于体外透皮试验和离体角膜通透试验 由供给室与接受室 两部分组成 取自活体动物的生物膜组织 如皮肤或角膜 可直接夹于f r a n z 扩 散池的两室之间 华中科技大学同济医学院 2 0 0 2 级硕士学位论文 图2w i n e 和k a s p e r b a u e r 2 0 0 0 所设计的离体圆窗膜试验装置嘲 所用的材料 主要为聚乙稀培养皿和试管 箭头所指处为圆窗膜 连同圆窗龛 图3 圆窗膜离体实验装置的侧面示意图 1 供给室 4 4 表中耳腔 2 聚 乙烯薄片 附有圆窗膜 3 取样管 4 接收室 代表外淋巴腔 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 级硕士学位论文 鼓垂镧 圆窗腹 鼓阶侧 图4 聚乙烯圆片的中心部分示意图 由w i r em c k a s p e r b a u e rj l 嘲 修改而来 图5 亚甲基蓝标准曲线 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 级硕士学位论文 参考文献 图6 亚甲基蓝溶液累积释放曲线 n 3 1 o k u n ot n o m u r ay p e r m e a b i l i t yo f t h er o u n dw i n d o wm e m b r a n e a r c h o t o r h i n o l a r y n g o l1 9 8 4 2 4 0 1 0 3 6 2 g o y c o o l e am vc l i n i c a la s p e c t so fr o u n dw i n d o wm e m b r a n ep e r m e a b i l i t y u n d e r n o r m a la n dp a t h o l o g i c a lc o n d i t i o n s a c t ao t o l a r y n g o t2 0 0 1 1 2 1 4 4 3 7 4 4 7 3 p l o n t k es w o o da s a l ta a n a l y s i so f g e n t a m i c i nk i n e t i c si nf l u i d so f t h ei n n e r e a r 埘t l lr o u n dw i n d o w a d m i n i s t r a t i o n o t o ln e u r o t o l 2 0 0 2 2 3 6 9 6 7 9 7 4 f 4 g o y c o o t e am v p a p a r e l l am m g o l d b e r gb e ta 1 p e r m e a b i l i t yo f t h em i d d l ee a r t os t a p h y l o c o c c a lp y r o g e n i ce x o t o x i ni no t i t i sm e d i a i n tjp e d i a t ro t o r h i n o l a r y n g o l 1 9 8 0 1 3 0 1 8 5 l t m d m a nl j u h ns k b a g g e 卜s j b b l c kd e ta 1 p e r m e a b i l i t yo f t h en o r m a lr o u n d 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 级硕士学位论文 w i n d o wm e m b r a n et oh a e m o p h i l u si n f l u e n z a et y p ebe n d o t o x i n a c t ao t o l a r y n g o l s t o c k h t 9 9 2 11 2 5 2 4 9 6 k i mc s c h ot k j i n nt h p e r m e a b i l i t yo ft h er o u n dw i n d o wm e m b r a n et o h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ei ne x p e r i m e n t a lo t i t i sm e d i a o t o l a r y n g o lh e a dn e c ks u r g 1 9 9 0 1 0 3 9 1 8 2 5 7 g o l d b e r gb g o y c o o l e am v s c h l e i v e r tp m e ta 1 p a s s a g eo fa l b u m i nf r o mt h e m i d d l ee a rt ot h ei n n e re a ri no t i t i sm e d i ai nt h ec h i n c h i l l a a mjo t o l a r y n g o l 1 9 8 1 2 2 1 0 4 f 8 w i t t em c k a s p e r b a u e r 几 r o u n dw i n d o wm e m b r a n ep e r m e a b i l i t yt o t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r a a ni nv i t r os t u d y o t o l a r y n g o l o g y h e a da n dn e c k s u r g e r y 2 0 0 0 1 2 3 1p t1 9 1 9 6 9 g o y c o o l e am v m u c h o wd m a r t i n e zg c e ta 1 p e r m e a b i l i t yo ft h eh u m a n r o u n d w i n d o wm e m b r a n et oc a t i o n i cf e r r i t i n a r c ho t o l a r y n g o lh e a dn e c ks u r g 1 9 8 8 1 1 4 1 2 4 7 5 1 10 b a c h m a n ngs uj z u m e g e nc e ta 1 p e r m e a b i l i t yo ft h er o u n dw i n d o w m e m b r a n ef o rp r e d i s o l o n e 2 1 h y d r o g e ns u c c i n a t ef o l l o w i n gl o c a la p p l i c a t i o ni n t ot h e r o u n dw i n d o wn i c h e l e v e so fp r e d i s o l o n ei np e r i l y m p ha f t e rl o c a lv s s y s t e m i c a p p l i c a t i o n h n o2 0 0 14 9 7 5 3 8 5 4 2 1 1 h i m e n oc k o m e d am i z u m i k a w am e ta 1 i n t r a c o c l d e a ra d m i n i s t r a t i o no f d e x a m e t h a s o n ea t t e n u a t e s a n a i n o g l y c o s i d eo t o t o x i c i t yi nt h eg u i n e ap i g h e a r i n g r e s e a r c h 2 0 0 2 1 6 7 1 2 1 6 1 7 0 1 2 n o r d a n gl l i n d e rb a n n i k om m o r p h o l o g i cc h a n g e si nr o u n dw i n d o w m e m b r a n ea f t e rt o p i c a lh y d r o c o r t i s o n ea n dd e x a m e t h a s o n et r e a t m e n t o t o ln e u r o t 0 1 2 0 0 3m a r 2 4 2 3 3 9 4 3 1 3 b a l o u g hb j h o f f e rm e w e s t e rd e ta 1 k i n e t i c so fg e n t a m i c i nu p t a k ei nt h e i n n e re a ro fc h i n c h i l l al a n i g e ra f t e rm i d d l e e a ra d m i n i s t r a t i o ni nas u s t a i n e x l r e l e a s e v e h i c l e o t o l a r y n g o l h e a d n e c k s u r g 1 9 9 8 1 1 9 5 4 2 7 4 3 1 1 4 j a c k s o nl e s i l v e r s t e i nh c h e m i c a lp e r f u s i o no f t h ei n n e re a r o t o l a r y n g o lc l i n 华中科技大学同济医学院 2 0 0 2 级硕士学位论文 n a m 2 0 0 2 3 5 3 6 3 9 6 5 3 1 5 朱盛山 药物新剂型 北京 化学工业出版社 2 0 0 3 3 0 4 3 7 8 1 6 王志宣 姜典卓 张晓鹏等格尔德霉素滴眼液在离体兔眼角膜的吸收与扩 散沈阳药科大学学报2 0 0 3 2 0 3 1 6 0 1 6 4 1 7 罗宗铭 曹捷 染料结合分光光度法测定蛋白质的研究 广东工业大学学报 1 9 9 9 1 6 3 1 0 2 1 0 5 1 8 殷团芳 卢永德 陈忠等 透明质酸 链霉素圆窗灌注对正常豚鼠内耳功能 和形态学的影响 湖南医科大学学报 1 9 9 8 2 3 2 1 3 3 1 3 6 1 9 王晋 陈鹏 黄群等 尼可地尔2 乙基纤维素固体分散物的药物释放动力学 的研究 中国药学杂志 2 0 0 0 3 5 f 1 3 0 3 1 华中科技大学同济医学院 2 0 0 2 级硕士学位论文 第三部分 离体圆窗膜对地塞米松不同制剂的通透性 圆窗膜是中耳与内耳之间惟一的膜性通道 对某些小分子物质以及某些抗生 素 1 棚 外毒素 4 1 内毒素 5 辣根过氧化物霉 矾 白蛋白 7 8 j 铁蛋t 9 1 激素 1 0 1 4 1 等多种物质具有通透性 是经中耳腔内耳局部给药最常用的通路 其中 类固醇 激素已被用来治疗多种内耳疾病 如自身免疫性聋 突发性感音神经性聋 噪声 性聋 梅尼埃病 急性脑膜炎后迷路炎 1 2 1 一些临床实验已证明经传统全身给 药方法治疗效果欠佳的突发性感音神经性聋或梅尼埃病 即时的内耳局部激素 地塞米松 甲基强的松龙等 治疗具有效果 1 5 9 1 然而 目前经圆窗膜给药的 研究方法基本限于在体动物实验 其影响因素较复杂 如药物在内耳的扩散与吸 收常数等 1 0 q 4 1 尚无法获得 特别是以寻找缓释药物剂型为目的的研究 尤其需要 将给药因素单一化 因此 为了筛选地塞米松经圆窗膜给药的缓释剂型 本实验 利用自行设计的离体圆窗膜通透试验装置 严格按照药剂学的研究方法 选用常 用的缓释剂 海藻酸钠和羧甲基甲壳胺 观察了药物经圆窗膜缓释过程的药代 动力学规律 为建立内耳局部给药的新模式提供实验依据 1 材料和方法 1 1 试剂及仪器 纯水机 高效液相色谱仪 色谱柱 电子天平 超声清洗器 双室扩散池 解剖显微镜 甲醇 地塞米松磷酸钠 m i n i p o r e a g i l e n t l10 0 n o v a p a k 固c 1 83 9 15 0 m m b p 3 1 0 0 ps a r t o r i u s k q 一5 0 b 自制 o l y m p u s 色谱纯 天津四友 天津天药 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 级硕士学位论文 林格氏液北京天鹤 海藻酸钠分析纯 羧甲基甲壳胺青岛海汇 牙科水泥a 粉及b 液 手钻及钻头 微量加样器 解剖剪 游丝镊 聚乙烯培养皿 容量瓶 玻璃 棒 离心管等 e x c e lx p 及s p s s l 0 0 软件包 1 2 高效液相色谱 h p l c 分析方法的建立 1 2 1 色谱行为的考查 缓冲盐溶液 用天平称取适量磷酸二氢钾 用新制的三蒸水与前者在容量瓶 内准确配制磷酸二氢钾缓冲盐 使其浓度为0 0 2 5 m o i 1 流动相 调节高效液相色谱仪 使甲醇 缓冲盐溶液的体积比从4 0 6 0 4 1 5 9 5 9 4 l 6 0 4 0 分别以上述流动相进样空白淋格氏液和地塞米松磷酸钠液 在往湓2 5 2 4 0 n m 检测波长的条件下 手动进样1 0 u l 考察保留时间和峰形 选取保留时间 合适 峰形较好的流动相 确定h p l c 检测条件 以上条件的确定参考胡大强 吴光亮 吴伟等的经验 2 0 越l 1 2 2 建立标准曲线 回收率及精密度试验 贮备液 用天平称取t o m g 地塞米松磷酸钠 加入1 0 m l 林格氏液中 利用 超声清洗器混均 配制成l m g m l 的贮备液 标准液 每次用微量加样器从贮备液中吸取一定量的液体到l m l 的离心管 内 用林格氏液稀释 配制成1 5 1 0 2 5 5 0 1 0 0 2 5 0 5 0 0 和1 0 0 0 u g m l 的标准液 h p l c 检测 在确定的h p l c 检测条件下 每种浓度的标准液进样1 0 u l 重 复两针 标准曲线 以峰面积 a 对药物浓度 c 进行线性回归得到标准曲线方 程 回收率及精密度 另外配制地塞米松磷酸钠 方法同上 1 0 2 5 1 0 0 u l g m l 的样品 于日内 日间分别进行h p l c 检测 得到回收率及精密度 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 级硕士学位论文 1 3 离体圆窗膜通透试验装置的构建 该装置的设计思想 构建步骤 圆窗膜的分离方法见第二部分 1 2 离体圆窗 膜通透试验装置的设计与制备 1 4离本圆窗膜对地塞米松不同制剂的通透试验 1 4 1 制剂的配制及分组 以林格氏液为溶剂 配制2 0 m g m l 地塞米松磷酸钠 d x m 溶液 以之为基 础溶液 亦为不含任何辅料的对照液 a 组 以此基础液添加不同成份的海藻酸钠 a l g 羧甲基甲壳胺 c i i i 配制成 四组制剂 b e 5 组制剂的具体成份见表l 各组溶液配制好后在超声清洗器内超声助溶混匀 1 4 2 分时段采样与检测 每组制剂分别选用三个试验装置 先使接受室充满林格氏液 供给室用注射 器分别加入各组制剂0 2 m l 用胶膜覆盖 室温下 2 5 分别于2 0 4 0 6 0 1 2 0 1 8 0 3 0 0 4 2 0 5 4 0 m i n 从取样管吸取0 2 m l 液体注入l m l 离心管内 同时向接 受池补入等体积林格氏液 将所采集的样品用h p l c 法在确定的条件下进行检 测 2 结果 2 1h p l c 流动相的确定 一 当流动相甲醇 缓冲盐体积比为4 6 5 4 时 臼标准液中林格氏液对药物没有 干扰 地塞米松磷酸钠溶液峰形尖锐 图1 2 2 h p l c 标准曲线 回收率及精密度试验 标准曲线 地塞米松标准液 1 5 l o 2 5 5 0 1 0 0 2 5 0 5 0 0 1 0 0 0 u g m 1 h p l c 方法检测到的峰面积 a 对药物浓度 c 见表2 对其进行线性回归 得标准曲线方程 图2 y 1 4 7 2 x 2 6 3 4 5 r 2 0 9 9 9 9 2 回收率及精密度检测相 对标准偏差均小于1 0 表3 表明此条件下h p l c 检测方法具有可靠性 2 3 五组地塞米松制剂对圆窗膜通透量的检测 2 3 1 建立拟合方程及通透释放曲线 华中科技大学同济医学院 2 0 0 2 级硕士学位论文 目测制剂的粘度 不含任何辅料的地塞米松对照组 a 组 与只添力1 4 9 1 羧甲基 甲壳素 e 组 的流动性接近 几无黏性 其余三组的黏度相近且较大 从接受池采集的样品在上述h p l c 条件下检测 将检测到的峰面积 a u 代入 i n i 标准曲线 求得各个时间点的浓度 c n 用公式婊 q 虻 g 一 算锝各个采 t l 样点的累积释放量 幺 表4 其中h 时测浓度 砟 介质体积 本实验为 接受室的体积1 2 m l 7 r 取样体积 本实验为0 2 m l 将q n 分别代入零级 一级 h i g u c h i 释放方程进行拟合 a 组以3 小时为界分两段拟合 得到每种方程的回归 系数r 2 表5 以时间为横坐标 累积释放量为纵坐标作图 得到五组制剂的累积通透释放 曲线 图3 2 3 2 各组制剂对比分析 结合图3 和表5 可知 不含任何辅料的对照组 a 组 在给药3 d 时内释放曲线较 陡 符合零级方程 3 d 时后释放曲线渐为平缓 2 5 即海藻酸钠与6 9 l 或4 9 l 羧甲基甲壳胺 b 组与c 组 在整个观测的9 小时内 释放曲线最为平缓 图3 按零级方程计算 表5 b 和c 两组的释放速率分别为 0 0 4 0 7 u g m i n n l 0 0 3 6 6 u g m i n 此两组辅料对地塞米松的缓释作用最强 p o 0 5 单独添自n 2 5 9 l 海藻酸钠 d 组 的释放曲线为缓慢上升型 图3 其斜率介于a 组与b 组 或c 组 之间4 由零级方程得到其释放速率为0 1 0 5 1 u g m l 表5 从图3 可见只添 j i 4 9 1 羧甲基甲壳胺 e 组 的释放曲线在3 小时前与a 组伴行 3 小时后略高于a 组 证明羧甲基甲壳胺能使药物的释放量大于对照组 提示e 组 配方有微小促渗作用 3 讨论 3 1 缓释制剂的选择与分组 藻酸钠和羧甲基甲壳胺都是可生物降解的天然高分子 后者属于壳聚糖的衍 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 缓硕士学位论文 生物 生物相容性好 其中海藻酸钠荷负电 壳聚糖荷正电 两者可通过静电相 互作用控制药物释放 因此构成多种药物 生物制品 疫苗及细胞的缓释载体 2 3 2 7 1 本文第一部分的实验根据文献的报道 2 8 1 向豚鼠听泡内注射3 0 妒的藻酸钠 结果显示两周内藻酸钠未完全吸收 排泄 仅引起较轻的形态学改变 无致炎性 反应 对内耳组织结构是安全的 赵武奇等 2 9 2 0 0 4 对壳聚糖 海藻酸钠缓释制 备红景天苷微包囊的研究中发现 藻酸钠与壳聚糖的浓度分别为2 5 9 l 和4 鲫时缓 释作用最强 因此 为了进一步探索海藻酸在圆窗膜给药中作为缓释载体的条件 本实验根据第一部分的研究结果以及赵武奇等 2 9 1 等 2 0 0 4 的结果将海藻酸的浓 度调整为2 5 鲫 壳聚糖的浓度分为4 鲥与6 9 l 分别与前者进行搭配组合 地塞米松属于类固醇激素 能与细胞内受体结合 抑制一氧化氮合成酶和细 胞因子 粘附分子 血小板因子转录 从而抑制炎症过程 许多研究已证实地塞 米松能够通透圆窗膜 并用于治疗多种内耳疾病 如自身免疫性聋 突发性感音 神经性聋 噪声性聋 梅尼埃病 急性脑膜炎后迷路炎 3 0 3 1 目前国内外所有的 动物和临床实验中 地塞米松经鼓室 圆窗膜的给药方式为 经鼓膜直接注射 经鼓室预置载药体释药 如明胶海绵 半植入式微型虹吸管滴药和植入式微管 控释泵给药 3 2 1 这些方法各有利弊 鼓膜注射法药物溶液流失快 经咽鼓管 达到内耳的药物浓度波动大 重复注射将增大鼓膜损伤的机会 后三种方法虽然 能使内耳维持较稳定的药物浓度 但所需的鼓膜或鼓室切开术对中耳有较大创 伤 我们认为 经鼓膜注射缓释制剂的方法有可能成为将微创性和缓释性相结合 的最优化的给药方式 因此本实验以藻酸钠 羧甲基甲壳胺为缓释辅料 制成五组地塞米松制剂 a e 组 利用自行研制的圆窗膜体外试验装置观测与对比了五组制剂的特性 3 2 不同地塞米松制剂透膜释放特点的比较 不含任何辅料的对照组 a 组 在给药3 b 时内释放曲线较陡 3 b 时后释放曲 线渐为平缓 表明地塞米松在前3 小时内迅速透过圆窗膜释放到接收池 3 b 时后 透膜释放接近平衡 图3 前3 b 时符合零级拟合方程 其速释放速率为 o 2 4 0 7 u g m i n 即地塞米松在这一时间段内的透膜释放符合表面释放机制 表5 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 级硕士学位论文 表6 1 2 3 3 3 1 含有海藻酸钠 2 5 朗 与羧甲基甲壳胺 4 胡 6 8 1 b 组与c 组 的地塞米松制剂 释药速率最慢 缓释作用最强 p 0 0 1 单独2 5 9 1 海藻酸钠的缓释作用次之 然 而比较b c 两组之间的缓释性没有显著差异 p o 0 5 证明6 鲥或4 9 l 的羧甲基甲 壳胺与2 5 1 海藻酸钠联用时其缓释作用相近 b c 两组都符合h i g u c h i 拟合方程 表明两组地塞米松制剂的释放符合骨架扩散机制 2 3 j 3 1 根据辅料少副作用小的原 则 我们推荐在后续的研究中将羧甲基甲壳胺的浓度定为4 9 1 单独添加2 5 9 1 海藻酸钠的地塞米松制剂 d 组 释放曲线为缓慢上升型 图3 其斜率介于a 组与b 组 或c 组 之间 表明该组制剂具有缓释性 但其缓释作用 较b c 两组弱 也符合h i g u e h i 拟合方程 由零级方程得到其释放速率为 o 1 0 5 1 u g m l 表5 1 e 组 仅含4 9 l 羧甲基甲壳胺辅料 地塞米松的通透量稍大于对照组 证明羧甲 基甲壳胺有微小促渗作用 此结果与g o y c o o l e a 刚 卿 2 0 0 1 一致 后者认为圆窗膜 对通透的物质有电荷选择性 如阳离子铁蛋白的通透性大大超过阴离子铁蛋白 本实验中羧甲基甲壳胺带正电荷 因此有可能而促进地塞米松通过圆窗膜 c h a n d r a s e k h a r 等1 1 4 2 0 0 0 曾比较三种辅料 透明质酸 d m s o 组胺 x j l g 塞米松 圆窗膜给药的促渗作用 结合本实验的这一结果 将对激素冲击治疗突发性耳聋 有研究意义 3 5 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 级硕士学位论文 表1 五组地塞米松制剂的成份 浓 度组成 表2 地塞米松标准液的浓度及所测得 的蜂面积 u 浓g 度m 1 峰面积 1 5 1 0 2 5 5 0 1 0 0 2 5 0 5 0 0 1 0 0 0 1 4 2 9 7 2 5 0 1 4 0 1 5 3 5 5 4 8 7 1 8 8 3 1 4 5 6 0 5 3 6 1 8 8 2 7 1 8 8 2 9 1 4 7 7 9 0 0 表3 h p l c 法测定地塞米松磷酸溶液的精密度及回收率 i s 表4 不同时间点所求得的累积释放量 i s 玎 3 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 级硕士学位论文 表6 各组制剂对三种方程的拟合情况 3 7 华中科技大学同济医学院 2 0 0 2 级硕士学位论文 图1 标准液中林格氏液对药物没有干扰 地塞米松磷酸钠溶液峰形尖锐 保留时 间约8 5 m i n 图2 地塞米松标准曲线 3 8 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 级硕士学位论文 参考文献 图3 五组制剂的累积释放曲线 1 o k u n ot n o m u r ay p e r m e a b i l i t yo f t h er o u n dw i n d o wm e m b r a n e a r c h o t o r h i n o l a r y n g o l1 9 8 4 2 4 0 1 0 3 6 2 g o y c o o l e am v c l i n i c a la s p e c t so fr o u n dw i n d o wm e m b r a n ep e r m e a b i l i t y u n d e r n o r m a la n dp a t h o l o g i c a lc o n d i t i o n s a c t ao t o l a r y n g o l2 0 0 1 1 2 1 4 4 3 7 4 4 7 3 p l o n t k es w o o da s a l ta a n a l y s i so f g e n t a m i c i nk i n e t i c si nf l u i d so f t h ei n n e r e a rw i t hr o u n dw i n d o wa d m i n i s t r a t i o n o t o ln e u r o t o l 2 0 0 2 2 3 6 9 6 7 9 7 4 4 g o y c o o l e am v p a p a r e l l am m g o l d b e r gb e ta 1 p e r m e a b i l i t yo f t h em i d d l ee a r t os t a p h y l o c o c c a lp y r o g e n i ce x o t o x i ni no t i t i sm e s a i n tjp e d i a t ro t o r h i n o l a r y n g o l 1 9 8 0 1 3 0 1 8 5 l u n d m a nl j u h ns k b a g g e r s j o b a c kd e ta 1 p e r m e a b i l i t yo f t h en o r m a lr o u n d w i n d o wm e m b r a n et oh a e m o p h n l l si n f l u e n z a et y p ebe n d o t o x i n a c t ao t o l a r y n g o l s t o c k h 1 9 9 2 11 2 5 2 4 9 6 k i mc s c h ot k j i n nt h p e r m e a b i l i t yo ft h er o u n dw i n d o wm e m b r a n et o 3 9 华中科技大学同济医学院2 0 0 2 级硕士学位论文 h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ei ne x p e r i m e n t a lo t i t i sm e d i a o t o l a r y n g o lh e a dn e c ks u r g 1 9 9 0 1 0 3 9 1 8 2 5 7 g o l d b e r gb g o y c o o l e am v s c h l e i v e r tp m e ta 1 p a s s a g eo fa l b u m i nf r o mt h e m i d d l ee a rt ot h ei n n e re a ri no t i t i sm e d i ai nt h ec h i n c h i l l a a mjo t o l a r y n g o l 1 9 8 i 2 2 1 0 4 8 8 w i t t em c k a s p e r b a u e rj l r o u n dw i n d o wm e m b r a n ep e r m e a b i l i t yt o t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r a a ni nv i t r os t u d y o t o l a r y n g o l o g y h e a da n dn e c k s u r g e r y 2 0 0 0 1 2 3 1p t1 9 1 9 6 9 g o y c o o l e ai v l v m u c h o wd m a r t i n e zg c e ta 1 p e r m e a b i l i t yo f t h eh u r n a n r o u n d w i n d o wm e m b r a n et oc a t i o n i cf e r r i t i n a r c ho t o l a r y n g o lh e a dn e c ks u r g 1 9 8 8 11 4 1 2 4 7 5 1 1 0 b a c h m a n ng s uj z u m e g e nc e ta 1 p e r m e a b i l i t yo ft h er o u n dw i n d o w m e m b r a n ef o rp r e d i s o l o n e 2 1 h y d r o g e ns u c c i n a t ef o l l o w i n gl o c a la p p l i c a t i o ni n t ot h e r o u n dw i n d o wn i c h e l e v e so fp r e d i s o l o n ei np e r i l y m p ha f t e rl o c a lv s s y s t e m i c a p p l i c a t i o n h n o2 0 0 14 9 7 5 3 9 一5 4 2 11 h i m e n oc k o m e d am i z u m i k a w am e ta 1 i n t r a c o c h l e a ra d m i n i s t r a t i o no f d e x a m e t h a s o n ea t t e n u a t e s a m i n o g l y c o s i d eo t o t o x i c i t yi nt h eg u i n e ap i g h e a r i n g r e s e a r c h 2 0 0 2 1 6 7 1 2 6 1 7 0 f 1 2 n o r d a n gl l i n d e rb a n n i k om m o r p h o l o g i cc h a n g e si nr o u n dw i n d o w m e m b r a n ea r e rt o p i c a lh y d r o c o r t i s o n ea n dd e x a m e t h a s o n et r e a t m e n t o t o ln e u r o t 0 1 2 0 0 3 2 4 2 3 3 9 4 3 13 p a m e sl s s u na h f r e e m a nd j c o r t i c o s t e r o i dp h a r m a c o k i n e t i c si nt h ei n n e r e a rf l u i d s a na n i m a ls t u d yf o l l o w e db yc l i n i c a la p p l i c a t i o n l a r y n g o s c o p e 1 9 9 9 1 0 9 7p t2 1 1 7 f 1 4 c h a n d r a s e k h a rs s r u b i n s t e i nr y k w a r t l e rj a e ta 1 d e x a m e t h a s o n e p h a r m a c o k i n e t i c si nt h ei n n e re a r c o m p a r i s o no fr o u t eo fa d m i n i s t r a t i o na n du s eo f f a c i l i t a t i n ga g e n t s o t o l a r y n g o lh e a d n e c ks u r g 2 0 0 0 1 2 2 4 5 2 1 5 2 8 f 1 5 k o p k er d h o f f e rm e w e s t e rd e ta 1 t a r g e t e dt o p i c a ls t e r o i dt h e r a p yi n 华中科技大学同济医学院 2 0 0 2 缓硕士学位论文 s u d d e ns e n s o r i n e u r a lh e a t i n gl o s s o t o ln e l r o t 0 1 2 0 0 1 2 2 4 4 7 5 9 16 g i a n