Notch信号在大鼠胎肺AEC(1).doc

Notch信号在大鼠胎肺AEC细胞转分化调控机制中作用的研究（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：1. 项目的立项依据近年来，我国早产儿出生率从1985年的9.8上升至目前的12，即每年约有450万例早产儿出生1。早产儿尤其是极低出生体重儿肺损伤已成为新生儿死亡、致残的主要原因之一，重度肺损伤病死率仍在40%以上2。迄今早产儿肺损伤发病机制尚未完全阐明，临床亦无有效治疗措施，给家庭及社会造成沉重负担。因此，深入研究早产儿肺损伤的发生机制和防治措施，对提高早产儿存活率和生存质量具有重要意义。肺发育受阻及不成熟肺组织异常修复是早产儿肺损伤的两个特征性病理改变3。晚近研究表明，炎性因子、氧中毒、气压或容量损伤、营养缺乏等病因致单核/巨噬细胞高度活化，导致肿瘤坏死因子（TNF）、IL-8、转化生长因子（TGF）和胰岛素样生长因子（IGF）等诸多细胞因子水平异常升高。这些细胞因子构成调节网络，通过正反馈机制进一步促进肺泡上皮细胞结构和功能破坏，介导肺损伤发生。肺泡型上皮细胞(alveolar epithelial cell ,AEC) 是肺内主要干细胞，肺损伤修复的唯一途径是AEC增殖并向肺泡型细胞转分化（transdifferentiation），对肺泡壁重新上皮化以恢复气血屏障起重要作用。在早产儿肺损伤中，AEC转分化居于肺发育受阻及损伤修复的中心位置4。目前，有关AEC转分化的研究在国内外受到高度重视，但多以成年肺泡上皮为研究对象，对发育中胎肺型上皮细胞转分化研究甚少。研究表明，AEC能转分化为AEC，后者可逆转为AEC，这种转分化主要受肺成纤维细胞及细胞外基质（ECM）调节，AEC和基底膜细胞外基质的相互作用贯穿于整个修复过程3。正常肺组织的超微结构研究证实，AEC通过“上皮足突”穿越基底膜与肺间质成纤维细胞相联系。当AEC处于分裂增殖状态时，上皮突起数目减少，上皮下基底膜完整；而当AEC转分化时，上皮突起则增多，基底膜变得不完整。而且AEC增殖的同时，与之联系的间质成纤维细胞亦增殖。Demayo F3等推测，AEC与肺成纤维细胞的直接接触可能是调控肺上皮细胞表型转分化的重要前提。若AEC正常转分化为AEC，则损伤完全修复，肺结构正常；若AEC转分化异常，则导致不成熟肺异常修复和肺发育阻滞。目前，关于AEC-AEC间可逆转分化的研究仅限于离体实验，在早产儿肺损伤中的作用尚不清楚。因此，研究型细胞“转分化”及基质对其调控机制，是阐明早产儿肺损伤发病机制的关键所在。细胞外基质调控型细胞转分化的信号途径成为关注的焦点。近年发现，Notch受/配体信号系统可决定肺泡上皮细胞转分化方向，从而在肺发育及肺损伤修复中起重要作用 5。Notch信号为一组高度保守的跨膜蛋白质，由Notch14、配体（Delta、Jagged）及目的基因supperssor of hairless (Su(H)、Hes（hairy and enhance of split）组成，是多种组织和器官早期发育所必需的细胞间调节信号，通过邻近细胞间相互作用精确调控各谱系细胞（如多种器官干细胞及其原始细胞）的发育、增殖、分化。研究表明6，Notch配体通过与相邻的同型或异型细胞表面的Notch分子胞外区结合，释放具有活性的Notch胞内区，后者通过与胞浆和胞核内的相关蛋白结合来调控分化目的基因Su(H)、Hes的转录，最终影响细胞分化命运。Notch的生理抑制剂Numb可以阻断其细胞内区向核内的转移。研究发现，Notch信号途径介导的细胞间相互作用的本质特征在于相邻细胞受、配体的表达不同6:由同型细胞组成的细胞群中，使某些细胞定向分化，周围细胞向另一方向分化或保持未分化状态（即侧向分化或抑制作用）；由不同型细胞组成的细胞群中，使细胞进入下一分化阶段（即信号诱导作用）。目前有限的文献报道7，8及我们的前期工作9，10表明，新生大鼠肺发育囊泡期肺泡上皮细胞和间质细胞高表达Notch受/配体，其蛋白及mRNA表达水平随胎龄增加而改变。由此推测，Notch信号可能通过调控AEC分化方向在肺发育及早产儿肺损伤中起重要作用，Notch信号表达异常可能通过上皮/基质相互作用对肺泡上皮细胞转分化及肺损伤修复产生重要影响。目前，对上皮细胞转分化在发育期肺损伤修复中的作用研究很少，基质调控胎肺AEC转分化的分子机制尚有待进一步研究。国际上有关Notch信号转导通路调控发育的报道主要限于淋巴细胞和脑组织细胞分化的研究，而对其调控肺泡上皮细胞转分化的机制及在早产儿肺损伤中作用尚无人涉及。 在早产儿肺损伤研究领域，本室已开展一系列工作，成功建立了高氧所致早产大鼠急、慢性肺损伤的动物模型，掌握了支气管肺泡灌洗术、体外胎肺肺泡型细胞和成纤维细胞培养11以及其他相关的分子生物学和免疫细胞化学技术，并对细胞因子、抗氧化酶、一氧化氮、转化生长因子、细胞外基质中MMPs/TIMP（基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶抑制剂）平衡等因素在高氧肺损伤发病机制中所起的作用进行了较深入研究，同时应用地塞米松、人类重组促红细胞生成素、银杏叶提取物（EGb761）进行了抗氧化损伤的干预研究。晚近已完成Notch 信号在大鼠胎肺组织表达的预实验。上述前期工作为从分子水平探讨早产儿肺损伤发生机制奠定了基础。 据此，本研究提出如下假设：1体外同型细胞培养时AEC转分化为AEC；不同型细胞（AEC+成纤维细胞）共培养时抑制AEC转分化；2细胞外基质抑制AEC转分化主要通过Notch 信号调控。 本项目内容如能按预期完成，将深化对Notch信号通路调控AEC转分化分子机制的认识并可能为早产儿肺损伤的防治开拓新思路和提供理论依据。2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题研究目标：阐明胎肺细胞外基质是否对AECAEC间可逆转分化起决定作用；阐明Notch受/配体信号在基质对胎肺AEC体外转分化的调控机制中是否起关键作用，以期初步确定基质调控胎肺AEC转分化分子机制，探索防治早产儿肺损伤的新途径。研究内容：1. 体外培养大鼠胎肺AEC（同型细胞群），体外AEC和成纤维细胞（Fb）共培养（不同型细胞群），研究两种条件下胎肺AEC体外转分化的形态学改变（病理染色及电子显微镜技术）；2. 两种培养条件下细胞增殖、转分化状况的差异（利用流式细胞技术）； 3. 胎肺AEC和成纤维细胞表面Notch受/配体表达状况（利用共聚焦显微镜技术）；4. 两种培养条件下AEC细胞Notch受/配体表达的差异（利用基因