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华 南 理 工 大 学 学 报 自 然 科 学 版 第 39 卷 第 1 期Journal of South China University of TechnologyVol 39No 1 2011 年 1 月 Natural Science Edition January2011 文章编号 1000 565X 2011 01 0053 05 收稿日期 2010 05 26 基金项目 广东省国际科技合作计划项目 B15B207108b 作者简介 钟振声 1955 男 教授 主要从事有机精细化学品的合成 提取和分析研究 E mail chszhong scut edu cn 引种互叶白千层茶树油的化学成分及抑菌活性 钟振声樊丽妃黄继兵 华南理工大学 化学与化工学院 广东 广州 510640 摘要 采用气相色谱 质谱联用仪 GC MS 对从澳大利亚引种的广西玉林市互叶白 千层茶树油进行化学成分分析 测试了该种茶树油的理化常数 并将结果与 ISO 国际标准 进行了比较 以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为供试菌种 对该种茶树油的抑菌活性进行了 研究 并用混合药剂法测得了该种茶树油对供试菌种的最小抑菌浓度 最后考察了培养基 pH 值 食盐和蔗糖对该种茶树油抑菌活性的影响 发现 非特征成分桉叶素的相对含量高 达 72 49 而特征成分 4 松油醇只有 0 78 该种茶树油的大多数理化常数均不在 ISO 国际标准规定的范围之内 该种茶树油对供试菌种的最小抑菌浓度均为 4 00 mL L 显示 其有很强的抑菌活性 在 pH 5 10 范围内 该种茶树油对供试菌种都有较强的抑制作 用 一定用量的食盐及蔗糖与该种茶树油之间存在明显的协同抑菌作用 这些结果表明 该互叶白千层茶树极有可能发生了变种 但其抑菌活性得到了保持 关键词 茶树油 互叶白千层 成分分析 抑菌活性 中图分类号 TH83 Q93doi 10 3969 j issn 1000 565X 2011 01 010 互叶白千层茶树原生长于澳大利亚新南威尔士 州的北部沿海 其茶树油与世界各地的相比产量最 大 质量最佳 目前世界各地多有引种 我国广西 广 东 海南等地也有大规模的栽培 其中广西为主要产 区 1 文献报道 2 茶树精油具有广谱抗微生物 抑 菌 环保 温和天然清香 无污染无腐蚀 渗透性和生 物降解力强的性质 茶树油应用于个人护理品 头 发护理 身体护理 洗脚液 肥皂 抗菌型洗手液 口 气清新剂及口腔护理用品 健康用品 急救乳液 杀菌剂 烧伤护理等 中 可起到消炎抑菌 止痛 止 痒的作用 现已进入美国食品 药品监督局采购名 单 国际上茶树油已广泛应用于医疗 化工等领域 而在中国 茶树油的应用市场还不成熟 我国对茶树 油的认识时间较短 目前仅在日化行业有所使用 茶 树油的应用作为一个新兴产业 具有良好的开发价 值和发展潜力 加强茶树油的基础研究和应用研究 提高我国茶树油的质量 开发茶树油的新产品 具有 十分重要的意义 国内外文献采用气相色谱 质谱联用仪 GC MS 对茶树油的成分进行分析 发现其主要成分有 4 松油醇 松油烯 松油烯 1 8 桉叶素等 其主 要抑菌活性成分是 4 松油醇 居解语等 3 对不同茶 树油样品进行了成分差异研究 发现主要是 1 8 桉 叶素 松油烯 异松油烯和 4 松油醇这几种成分含 量有较大差异 文中对从澳大利亚引进 经过十年选 种培育的广西玉林互叶白千层茶树油进行了化学成 分分析及抑菌活性研究 以此来揭示互叶白千层茶 树油异地引种后的化学成分及抑菌活性的变化 1实验部分 1 1主要材料与仪器 茶树油 广西玉林市玉州区互叶白千层 澳洲 茶树 种植基地提供 茶树引种已十年 大肠杆菌 Escherichia coli 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 取自广州工业微生物检测中心菌种库 无 水乙醇 95 乙醇 蔗糖 氯化钠 氢氧化钠 均为分 析纯 琼脂 牛肉浸膏 蛋白胨 均为生化试剂 QP2010 型气相色谱 质谱联用仪 日本 SHI MADZU 公司 SPX 型生化培养箱 上海新苗医疗 器械制造有限公司 XS 212 型生物显微镜 南京江 南永新光学有限公司 SW CJ 1D 型净化工作台 苏 州净化设备有限公司 YX 280D 型手提式压力蒸汽 灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司 10mm 7 8mm 6 0 1 mm 型牛津杯 浙江省宁海健民 医疗仪器厂 1 2实验方法 1 2 1茶树油理化常数的测定 相对密度依据 GB T 11540 2008 测定 折光指 数依据 GB T 14454 4 2008 测定 旋光度依据 GB T 14454 5 2008 测定 闪点依据 GB T 14454 6 2008 测定 乙醇中溶解 混 度依据 GB T 14455 3 2008 测定 1 2 2茶树油的化学成分分析方法 称取一定量茶树油 用正己烷配制成质量浓度 约为5mg mL 的样品溶液 采用 GC MS 对茶树油进 行定性和定量分析 4 气相色谱 色谱柱为 DB 5MS 30m 0 25mm 0 25mm 样口温度为 260 载气为高纯氦 柱流 量为 1 0mL min 分流比为 100 1 进样量为 1 L 程序升温起始温度为 70 速率为 2 min 终止 温度为 180 质谱 电离方式为 EI 电子能量为 70eV 接口温度为 250 离子源温度为 200 溶 剂延迟 2 min 加速电压为 1 00 kV 扫描范围为 45 500 u 1 2 3抑菌活性和最小抑菌浓度的测定 采用二倍稀释法 用 5 体积分数 的无菌吐 温 80 溶液将茶树油配成体积分数分别为 20 5 的茶树油溶液 5 采用牛津杯法 6 测茶树油对大肠 杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径 以相同体积 分数的溶剂做对比实验 用混合药剂法 7 测茶树油对大肠杆菌和金黄 色葡萄球的最小抑菌浓度 MIC 在培养基凝固前 加入一定量的茶树油 混合均匀 使培养基中含一定 量的茶树油 待培养基凝固后 在培养基表面划线接 种细菌 37 培养 24 h 后观察细菌生长情况 每一 种添加量做 3 个平行实验 以 5 的无菌吐温 80 溶 液作为对照组 完全无菌生长的茶树油的添加量即 为最小抑菌浓度 MIC 1 2 4茶树油抑菌活性的稳定性分析 根据文献 8 在固体培养基凝固前将 pH 值分 别调到 4 5 6 7 8 9 10 11 然后用比各菌的 MIC 低一个体积分数梯度的茶树油溶液进行抑菌实验 比较不同 pH 值下该茶树油溶液的抑菌活性 确定 其 pH 值活性范围 方法同 MIC 测定 实验中以相 应添加量的吐温 80 水溶液作对照 在固体培养基凝固前加入不同质量分数的蔗 糖 食盐进行抑菌实验 与 pH 值影响实验条件相 同 研究蔗糖 食盐对互叶白千层茶树油抑菌活性 的影响 以吐温 80 水溶液作对照 2结果与分析 2 1茶树油的理化常数 采用国标方法测得的茶树油的相对密度 折光指 数 旋光度 闪点及在乙醇中的溶解度如表1 所示 将测得的理化常数与 ISO 国际标准 8 相比较 发现引种茶树油除了在乙醇中的溶解度符合该标准 之外 其余几项常数均不在标准规定的范围之内 这 是由于该标准是对 4 松油醇型茶树油的规定 而受 测茶树油的成分与常规的澳洲茶树油相比 已经有 了较大的改变 从而使得其理化常数与国际标准不 同 具体见下文的分析 2 2茶树油的化学成分 用 GC MS 对茶树油进行定量分析 通过图谱 见 图1 解析及相关资料查询 将各成分列于表2 中 表 1广西玉林引种互叶白千层茶树油的理化常数 Table 1Physical and chemical constants of tea tree oil from Melaleuca alternifolia planted in Yulin Guangxi China 项目相对密度折光指数旋光度 闪点 溶解度1 引种茶树油0 91731 4630 2 8381mL 茶树油全溶于 0 4mL 的乙醇中 溶液澄清 ISO 标准0 885 0 906 1 4750 1 4820 5 15561mL 茶树油全溶于不大于 2mL 的乙醇中 溶液澄清 1 20 下 在 85 体积分数 乙醇中的溶解度 45华 南 理 工 大 学 学 报 自 然 科 学 版 第 39 卷 图 1茶树油的总离子流色谱图 Fig 1Total ionic chromatogram of tea tree oil 表 2茶树油化学成分分析结果 Table 2Results of chemical components of tea tree oil 峰号 保留 时间 min 化合物 名称 结构式 相对含量1 引种 茶树油 ISO 标准 8 13 101 侧柏烯0 10 23 243 蒎烯3 961 0 6 0 33 559莰烯0 07 44 002桧烯0 06微量 3 5 54 128 蒎烯1 29 64 352 月桂烯1 85 74 743伪柠檬烯0 12 85 092 松油烯0 075 0 13 0 95 326对伞花烃0 64 105 444苧烯8 570 5 1 5 115 5421 8 桉叶素72 49微量 15 0 126 357 松油烯0 2410 0 28 0 137 311异松油烯0 081 5 5 0 1411 5064 松油醇0 7830 0 48 0 1512 300 松油醇8 271 5 8 0 1625 711香树烯0 32微量 3 0 1726 969香树烯0 15微量 3 0 1828 943 喇叭烯0 21 1 各峰面积占总峰面积的百分比 从表 2 中可知 1 8 桉叶素是广西玉林茶树油 的主要成分 相对含量高达 72 49 属于桉型茶树 油 7 一般所说的澳洲茶树油属于 4 松油醇型 国 际标准 ISO 规定其 4 松油醇的相对含量在 30 0 48 0 之间 1 8 桉叶素相对含量须小于 15 9 广 西玉林从澳大利亚引种的互叶白千层茶树通过十年 精选培育 不断改良 其茶树油中的 1 8 桉叶素相 对含量大大增加 而特征成分 4 松油醇 松油烯 松油烯和异松油烯的相对含量分别降低到不足 1 这说明引种的澳洲茶树极有可能已经发生了 变种 2 3茶树油的抑菌活性与最小抑菌浓度 选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 研究不同体积 分数茶树油的抑菌活性 抑菌圈直径测试结果见表 3 由表3 中可知 茶树油对大肠杆菌和金黄色葡萄球 菌有很强的抑菌活性 即使茶树油体积分数由 100 下降到5 其抑菌活性下降的幅度也不到50 表 3不同体积分数茶树油的抑菌效果1 Table 3Antimicrobial effect of tea tree oil with different vo lume fractions 茶树油体积分数 抑菌圈直径 mm 大肠杆菌金黄色葡萄球菌 10024 9925 30 2018 3719 27 512 8614 47 1 以吐温 80 溶液为对照 其大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑 菌圈直径均为 0mm 一般认为 茶树油的抑菌物质应该是 4 松油醇 等成分 所以 ISO 标准中规定 4 松油醇的相对含量 要高于 30 0 文中所研究的引种茶树油几乎不含 4 松油醇 却仍具有强烈的抑菌作用 这说明该茶树 油与原种澳大利亚互叶白千层茶树油存在差别 其 中起抑菌作用的成分极有可能不是 4 松油醇 引种 茶树油具体的抑菌成分有待进一步研究 用混合药剂法测得的茶树油的最小抑菌浓度见 表 4 由表 4 可以看出 茶树油对大肠杆菌和金黄色 葡萄球菌的最小抑菌浓度相同 均为 4 00 mL L 与 抑菌圈直径的实验结果相吻合 2 4茶树油抑菌活性的稳定性 通常 受测物的抑菌活性会受到 pH 值 无机盐 含量等因素的影响 文中考察了在不同 pH 值 不同 质量分数的食盐或蔗糖存在下茶树油抑菌活性的变 化 并对其抑菌活性的稳定性进行评价 55第 1 期钟振声 等 引种互叶白千层茶树油的化学成分及抑菌活性 表 4茶树油的最小抑菌浓度测定结果1 Table 4Measured MICs of tea tree oil 20 茶树油 体积 mL 培养基 体积 mL 茶树油添加量2 mL L 1 大肠杆菌生长情况金黄色葡萄球菌生长情况 样品组对照组样品组对照组 0 114 91 33 0 214 82 67 0 314 74 00 0 414 65 33 0 514 56 67 0 614 48 00 1 代表牛津杯周围无菌生长 代表牛津杯周围有菌生长 越多代表菌生长越密 下同 2 茶树油添加量是指每升凝胶体系中含有的纯茶树油的量 2 4 1培养基 pH 值对茶树油抑菌活性的影响 培养基 pH 值对茶树油抑菌活性影响的实验数 据见表 5 由表 5 可以看出 茶树油的抑菌活性具有 较宽的 pH 值范围 在 pH 5 10 范围内 当茶树油 添加量为 2 67mL L 时 能较好地抑制大肠杆菌和 金黄色葡萄球菌的生长 且随着 pH 值的升高 抑菌 活性先减弱后增强 这是由于培养基的强酸强碱性 不利于细菌的生长 再加上茶树油的抑菌作用 两者 综合就增强了其抑菌效果 而吐温 80 添加量 每升 凝胶体系中含有的纯吐温 80 的量 为 2 67 mL L 的对照样品没有表现出抑菌活性 表 5培养基 pH 值对茶树油抑菌活性的影响1 Table 5Effect of pH value of culture medium on antimicrobial activity of tea tree oil pH 值 大肠杆菌生长情况金黄色葡萄球菌生长情况 C1CK1C1CK1 4 5 6 7 8 9 10 11 1 C1是茶树油添加量为 2 67 mL L 的样品 CK1是吐温 80 添 加量为 2 67mL L 的对照样品 2 4 2蔗糖对茶树油抑菌活性的影响 蔗糖对茶树油抑菌活性影响的实验数据见表 6 从表 6 中可以看出 当茶树油添加量为 2 67 mL L 时 若蔗糖用量 质量分数 余同 大于 5 则随着 蔗糖用量的增大 抑菌效果逐渐加强 蔗糖用量为 30 和 40 时 完全无菌生长 结果表明 茶树油与 蔗糖之间应该存在协同作用 2 4 3食盐对茶树油抑菌活性的影响 食盐对茶树油抑菌活性影响的实验数据见表7 表 6蔗糖用量对茶树油抑菌活性的影响1 Table 6Influence of sucrose dosage on antimicrobial activity of tea tree oil 蔗糖 用量 大肠杆菌生长情况金黄色葡萄球菌生长情况 C2CK2C2CK2 0 5 10 20 30 40 1 C2是茶树油添加量为 2 67mL L 添加了蔗糖的样品 CK2是 吐温 80 添加量为 2 67mL L 添加了蔗糖的对照样品 从表 7 中可知 当茶树油添加量为 2 67mL L 时 若 食盐用量大于 2 则随着食盐用量的增加 培养皿 中大肠杆菌的生长程度明显减弱 食盐用量为 4 时 大肠杆菌完全受到抑制 而当食盐用量仅为 1 时 对金黄色葡萄球菌的抑菌效果大大增强 当食盐 用量为 3 以上时 金黄色葡萄球菌完全不生长 这 说明食盐和桉型茶树油对金黄色葡萄球菌的协同作 用较对大肠杆菌明显 表 7食盐用量对茶树油抑菌活性的影响1 Table 7Influence of salt dosage on antimicrobial activity of tea tree oil 食盐 用量 大肠杆菌生长情况金黄色葡萄球菌生长情况 C3CK3C3CK3 0 1 2 3 4 5 1 C3是茶树油添加量为 2 67mL L 添加了食盐的样品 CK3是 吐温 80 添加量为 2 67mL L 添加了食盐的对照样品 3结语 用 GC MS 分析得出广西玉林引种茶树油的 18 65华 南 理 工 大 学 学 报 自 然 科 学 版 第 39 卷 种主要化学成分及其相对含量 通过与 ISO 标准中 4 松油醇型茶树油化学成分相对含量的对比 发现 广西玉林种植基地的互叶白千层茶树在经过 10 年 的种植以后极有可能已经发生了变异 由 4 松油醇 型茶树转变为了桉型茶树 茶树虽然可能发生了变 异 但其所产的茶树油仍有很强的抑菌活性 文中还 发现 桉型茶树油在 pH 5 10 范围内对大肠杆菌 和金黄色葡萄球菌都有较强的抑制作用 而一定质 量分数的食盐及蔗糖与茶树油之间存在明显的协同 抑菌作用 这对茶树油的应用有一定的指导意义 参考文献 1 吴鹏昌 张伟 茶树油的研究进展 J 中国药业 2009 18 3 61 62 Wu Peng chang Zhang Wei Research progress on tea tree oil J China Pharmaceuticals 2009 18 3 61 62 2 李娟 李小瑞 茶树油的性质及其应用 J 日用化学 工业 2003 33 5 323 325 Li Juan Li Xiao rui Properties and applications of tea tree oil J China Surfactant Detergent Cosmetics 2003 33 5 323 325 3 居解语 何立平 互叶白千层精油化学成分差异的研 究 J 经济林研究 1999 17 2 6 9 Ju Jie yu He Li ping Variation in chemical composition in the essential oil extracted from Melaleuca alternifolia J Economic Forest Researches 1999 17 2 6 9 4 翟淑红 黄少烈 顾志伟 茶树油的分子蒸馏精制及其 GC MS 分析 J 广东化工 2008 35 177 97 100 Zhai Shu hong Huang Shao lie Gu Zhi wei GC MS analysis of tea tree oil purified by molecular distillation J Guangdong Chemical Industry 2008 35 177 97 100 5 Liu Xia Zu Yuan gang Fu Yu jie et al Antimicrobial ac tivity and cytotoxicity towards cancer cells of Melaleuca alternifolia tea tree oil J Eur Food Res Technol 2009 229 2 247 253 6 钟振声 赵蓓蓓 孙昂 蒲公英抑菌物质的提取工艺研 究 J 现代食品科技 2009 25 1 59 62 Zhong Zhen sheng Zhao Bei bei Sun Ang Extraction of bacteriostatics from taraxacum J Modern Food Science and Technology 2009 25 1 59 62 7 晏增 杉木心材精油的提取 分离及抑菌活性的研究 D 福州 福建农林大学生命科学学院 2004 8 ISO 4730 2004 白千层 对孟烯 4 醇型 茶树油 质 量标准 S 9 程速远 徐康森 茶树油的研究概况 J 中华医药杂 志 2005 5 2 132 134 Cheng Su yuan Xu Kang sen Overview on tea tree oil J Chinese Journal of Medicine 2005 5 2 132 134 Chemical Components and Antimicrobial Activity of Tea Tree Oil from Introduced Melaleuca alternifolia Zhong Zhen shengFan Li feiHuang Ji bing School of Chemistry and Chemical Engineering South China University of Technology Guangzhou 510640 Guangdong China Abstract In this paper first the chemical components of the tea tree oil extracted from Melaleuca alternifolia in troduced from Australia and planted in Yulin Guangxi China were analyzed by means of GC MS Next the physical and chemical parameters of the tea tree oil were measured and were compared with the data set by ISO in ternational standard Then by using Escherichia coli and Staphylococcus aureus as the indicator bacteria the anti microbial activity of the tea tree oil was investigated and the corresponding minimum inhibitory concentrations MIC were investigated by means of mixed medicament method Finally the effects of pH value salt dosage and sucrose dosage on the antimicrobi