（植物学专业论文）基于cpdna单倍型的银杏群体遗传与谱系分析.pdf

摘要 孑遗植物银杏 g i n k g ob i l o b al 是世界著名的 活化石一植物 目前在世界许多 地方都广泛栽培 我国可能存在银杏第四纪冰期残存群体 关于银杏的冰期避难所以及 群体遗传结构一直以来都是科学家们感兴趣的课题 本文在前人研究基础上基于叶绿体 基因组d n a 结合了种群生态学的资料 研究了银杏的谱系地理学 揭示了银杏的遗 传多样性 遗传结构等 并推测了第四纪冰川期银杏在中国的避难所 主要研究结果如 下 从2 1 个叶绿体片段中筛选了3 个适合银杏群体遗传分析的片段 对2 3 个群体共2 2 0 个个体进行了序列分析 结果显示c p d n at r n k 基因 t r n s t r n g 基因和a t p h a t p i 基因 间隔区呈现了1 3 个单倍型类型和1 3 个变异位点 银杏物种水平的核苷酸多态性 p 为0 3 5 x 1 0 单倍型多态性 h 为0 2 1 9 总体遗传多样性水平较低 西南地区的j f w c s p p x 和e s 群体一共有8 种单倍型 其中6 种为特有单倍型 单倍型多态性 h 为0 0 0 0 0 7 0 9 核苷酸多态性 p 为0 1 3 2 x 1 0 3 东部t m 群体有4 种单倍型 其 中3 种为特有单倍型 单倍型多态性 h 为0 4 8 核苷酸多态性 p 为0 6 0 0 x 1 0 3 a m o v a 分析结果显示遗传变异主要存在群体内 居群问遗传分化 f s t 为4 0 4 4 2 其中9 6 8 为东部 9 西部两地理区域之i 1 的遗传分化 c p d n a 单倍型分布 单倍型系 统发育分析以及网状支系分析 n e s t e dc l a d e a n a l y s i s 表明 银杏在中国有两个第四纪 冰期避难所 证实了中国西南地区的金佛山 务川和思施为银杏第四纪冰期在中国的避 难所 另外 还首次确定了东部浙江西天目山地区为银杏的另一个避难所 冰期后 银 杏群体并没有经历过明显的群体扩张 但在西南地区避难所群体外围存在一定程度的短 距离扩散 银杏的自然扩张能力有限 而人类的引种和白果买卖促进了银杏在各群体中 的传播 最后提出了对金佛山一务川一恩施三省市交界处的古银杏建立自然保护区的建 议 关键词 g i n k g ob i l o b al c p d n a 谱缘地理学 群体遗传结构 a b s t r a c t g i n k g ob i l o b al o f t e nr e f e r r e dt oa sal i v i n gf o s s i l i saf a m o u sa n dw i d e l yc u l t i v a t e d p l a n t h o w e v e rt h ep o s s i b l ew i l dp o p u l a t i o n so fg i n k g oa r eo n l yr e s t r i c t e d i nc h i n a a c c o r d i n g l y d e t e r m i n a t i o no fg e n e t i cd i v e r s i t y p o p u l a t i o ns t r u c t u r ea n dg l a c i a lr e f u g i aa r e o fc r u c i a li m p o r t a n c ei no r d e rt ou n d e r s t a n dt h eh i s t o r i c a lp r o c e s s e sw h i c hg i n k g oh a s u n d e r g o n e i nt h i ss t u d y u s i n gc h l o r o p l a s ts e q u e n c ev a r i a t i o n w ea n a l y z e dt h ec o n s e r v a t i o n g e n e t i ca n dp h y l o g e g r a p h c ii s s u e so fg i n k g ob i l o b al f o c u s i n go ng e n e t i cd i v e r s i t y g e n e t i c s t r u c t u r eo ft h i sv u l n e r a b l es p e c i e s t h em a i nr e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s a f t e rap r e l i m i n a r ys u r v e yo n2 1c h l o r o p l a s td n a r e g i o n s w eo b t a i n e dt h r e ec h l o r o p l a s t f r a g m e n t s t h e na m p l i f i e da n ds e q u e n c e dt h e s et h r e ef r a g m e n t sf o r2 2 0i n d i v i d u a l so f2 3 p o p u l a t i o n s at o t a lo f2 5 0 8b pa n d1 3v a r i a t i o ns i t e sw e r ed e t e c t e d w h i c hg a v er i s et oat o t a l o f1 3c p d n a h a p l o t y p e s n u c l e o t i d ed i v e r s i t ya n dh a p l o t y p ed i v e r s i t ya r ep o 3 5 1 0 a n d h 0 2 1 9r e s p e c t i v e l y i ns wc h i n a 8h a p l o t y p e sw e r ef o u n dw i t hpr a n g i n gf r o m0 0 0t o 1 3 2 1 0 刁a n dhf r o mo 0 0t o0 7 0 9 f o u rh a p l o t y p e s c b k aa n dm a r eu n i q u et os w c h i n a i ne a s t e r nc h i n a 4h a p l o t y p e sw e r ef o u n d a m o n gw h i c h3a r eu n i q u e p 0 6 0 1 0 s a n dh o 4 8 a m o v ar e v e a l e dv a r i a t i o ne x i s tw i t h i np o p u l a t i o n s h i 曲g e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o n w a sd e t e c t e d r s t 0 4 0 4 4 2 a m o n gp o p u l a t i o n s h a p l o t y p ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i sa n dn e s t e d c l a d ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt w op o t e n t i a lr e f u g i ae x i s t e dd u r i n gt h el a s tg l a c i a t i o n t h ef i r s t w a sl o c a t e di ns wc h i n a j ew c p x s p e sa n dq c a n dt h es e c o n di ne a s t e r nc h i n a e s p e c i a l l ym t t mw a st h ef i r s tt i m et ob ei d e n t i f i e da sar e f u g eb a s e do nm o l e c u l a ra n a l y s i s n e u t r a l i t y t e s ta n dm i s m a t c hd i s t r i b u t i o nn e i t h e rs u p p o r ta n ys i g n i f i c a n t p o s t g l a c i a l p o p u l a t i o ne x p a n s i o n b u tt h e r ei ss o m es h o r td i s t a n c em i g r a t i o nf r o mt h em a r g i n eo ft h e r e f u g i aa r e ai ns o u t h w e s t e r nc h i n a t h eo c c u r r e n c eo fh a p l o t y p ee w h i c hw a sd e r i v e df r o m t h eo n l yl o c a l l yd i s t r i b u t e dh a p l o t y p eii nt m m i g h tb et h er e s u l to far a p i dr a n g ee x p a n s i o n d u r i n gt h el a s ti n t e r g l a c i a lp e r i o d sf r o me a s t e r nc h i n a h u m a nt r a n s p l a n t a t i o nh a sd e f i n i t e l y p l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nt h es p r e a do fg i n k g o i no r d e r t oc o n s e r v et h eg e n e t i cr e s o u r c e s 0 fgb i l o b a w ep r o p o s et h a tt h em o s td e s i r a b l ep o p u l a t i o n sf o rt h e ns i t uc o n s e r v a t i o na r e t h o s ei ns w o f w c p x s pa n de s k e yw o r d s g i n k g o b i l o b al c p d n a p h y l o g e o g r a p h y p o p u l a t i o ng e n e t i c i i i 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果 也不包含为获得盘鎏盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 谢意 学位论文作者签名 签字日期 年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 盘姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交 本论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 本人授权逝鎏盘堂可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播 可以采用影印 缩印或扫描等复 制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 导师签名 签字日期 年月日签字日期 年月日 致谢 本文是在导师傅承新教授的悉心指导下完成的 从论文的选题 采样以及研究过程 无一不凝聚着傅老师的心血和精力 感谢傅承新教授两年多来的悉心栽培 傅老师具有 渊博的专业知识 敏锐的思维能力 能够准确把握学科方向的动态 以及他一丝不苟 严谨治学的科学态度 都使我在学习和科学研究的过程中受益匪浅 他对事业的执著追 求 治学上严谨的作风 忘我的工作精神 平易近人 悔人不倦的为师品德 我深为敬 佩 并将终生受益 同时也要感谢傅老师对我生活上无微不至的关怀和帮助 感谢邱英雄老师对我数据分析与讨论方面的指导和帮助 感谢龚维师姐对我实验上 的指导 学习上的帮助和生活上的关心 感谢赵云鹏师兄和y a h a r a 教授给我采集日本 的样品 感谢于明坚老师 姜维梅老师 蒋金火老师 等在两年学习 生活中给予的交 流与关心 感谢战秀玲在科研工作中的帮助 生活上的关心 一同分担烦恼 交流经验 感谢一起学习和生活过的师兄 师姐及朋友 陆胤 范捷 张文丽 管毕财 刘海 龙 周佐斌 陈光村 闫晓玲 陈烨烨 李密密 陈川 宗敏 沈瑛瑛 杨舒婷 陶晓 瑜 刘逸慧 李攀 龚华栋 刘晓贤 孙逸 符渊淼 祁新帅 祁哲晨 骆争荣 郗旺 汪殷华 陆炜强 感谢你们对我的关心和帮助 难忘一同度过的实验室生活 感谢我 的室友 沈晨佳 杨万军 何漪 我会永远记住我们一起学习生活 探讨人生 畅谈理 想的那些日子 感谢母亲多年以来无私的奉献 默默的支持 您的恩情我将永记于心 感谢父亲给 我学业上的鼓励 支持和理解 为我排除后顾之忧 感谢叔叔和姨妈及其家人 你们长 久以来的关怀和帮助让我觉得亲情无比的可贵 感谢所有关心我 帮助我的亲人和朋友 祝愿你们永远幸福安康 曾真 浙江大学紫金港 2 0 0 8 年6 月 第一章前言 谱系地理学 p h y l o g e o g r a p h y 是a v i s e 等 1 9 8 7 提出的 主要是探讨物种及种内居 群形成现有分布格局的历史原因和演化过程的一门学科 着重于对过往历史重建 探讨 物种演化关系 亲缘 与地质事件 冰川 之间的相关性并推测物种传播路径等问题的 研究 它与传统生物地理学的主要差别在于 传统生物地理学主要研究生物随时间变 化形成的空间分布式样 并解释这种分布式样形成的原因 即研究生物按时空梯度的分 布 此外 生物地理学强调高分类阶元的地理分布模式 如有袋类哺乳动物及木兰目植 物等 所采用的证据除了现今的传播 迁移方式及形态特征外 化石往往是不可缺少的 直接证据 相对地 谱系地理学的研究则偏重于近缘物种 强调其共同起源的历史 或种 内居群闻的研究 因此谱系地理学的研究被视为是种内水平微进化 m i c r o e v o l u t i o n 和种及种上水平大进化 m a c r o e v o l u t i o n 之间的桥梁 有许多进化力量决定此基因谱系关系 如随机遗传漂变 自然选择 种子及花粉传 播的迁移模式 乃至生物本身的居群数量变动 如瓶颈效应 其中遗传物质变异的研 究是重建物种 居群演化历史及分析物种遗传结构的基础 谱系地理研究除了可以了解 遗传变异的空间分布外 可进一步阐明物种在地理及演化上的关系 另外近年来 谱系 地理学研究得以迅速的发展 主要原因以下两点 第一 分子生物学技术的发展 p c r 技术的发展和应用以及测序技术的成熟 使其操作简单 结果更加直观 a v i s e2 0 0 0 第二 分析方法的改进 n c a n e s t e dc l a d ea n a l y s i s 是对传统聚类分析方法的补充 可以用于检测种内系统发育关系 揭示进化分支图上不明确的地方 以及找到系统发育 树的根 c r a n d a l la n dt e m p l e t o n 1 9 9 3 利用基于n c a 的单倍型网络图可以揭示物种 群体经历的历史事件 冰期后可能的历史迁移路线 栽培群体的起源以及一些亲缘地理 学关系等问题 a v i s e 2 0 0 0 1 1 谱系地理学研究中的分子标记 1 1 1 分子标记技术 广义的分子标记包括蛋白质标记和d n a 序列标记 2 0 世纪6 0 年代出现的等位酶 就是一种典型的蛋白质分子标记 该手段曾被广泛应用于动植物的保护遗传学和进化的 研究 为濒危物种的保护 种质资源的研究开发和利用做出了重要的贡献 h a r m r i c k a n d g o d t 1 9 9 2 葛颂和洪德元 1 9 9 4 中仁 1 9 9 6 2 0 世纪9 0 年代以后由于p c r 技术 的广泛应用 d n a 的多态性可通过体外克隆方法快速 高效而灵敏的检测出来 邹喻 苹等 2 0 0 1 基于p c r 的r a p d r f l p i s s r a f l p s s r 等d n a 指纹技术迅速 发展起来 并得到广泛应用 目前用于植物系统进化 遗传多样性以及植物地理学研究的分子标记和方法有多 种 总体来看可以分为4 类 即蛋白质标记 d n a 序列分析 d n a 指纹分析和d n a 构象变化与s s c p 分析 邹喻苹等 2 0 0 1 本论文采用的是d n a 序列分析 在此主要 介绍与本研究相关标记 1 1 1 1n d n a 核基因组d n a 结构复杂 大部分核基因存在种源 o r t h o l o g o u s 来源于物种形成 和 基源 p a r a l o g o u s 来源于基因重复 的拷贝 田欣和李德铢 2 0 0 2 一般情况下 基因组内非编码区序列 包括内含子 基因间区 因其功能上的限制较少 比编码区表现 出更快的进化速率 p a l m e r 1 9 9 1 c l e g gc ta 1 1 9 9 4 目前对核基因组序列的应用主要集 中在编码核糖体r n a 的重复区 n r d n a 内 其中使用较广的是i t s i n t e r a lt r a n s c r i b e d s p a c e r 内转录间隔区 和编码核糖体r n a 小亚基的1 8 s 基因等 k 竺 l 鹚琴l t s ilts2 鼹 图l l 植物核糖体d n a 的重复序列结构图示 修改自s o l t i s 筹 19 9 8 f i 9 2 4 t h i sd i a g r a md 印i c t st h en r d n ar e p e a tf o u n dm p h m t s m o d i f i e d k o ms o l t i sc t a l 1 9 9 8 1 i t s 内转录间隔区 i t s 位 于1 8 s 6 s 之间 被5 8 s 分割成两部分 图1 1 在分析时常把 5 8 s 与1 t s l i t s 2 放在一起分析 i t s 序列在裸子植物中变异很大 不适用于裸子植物 的系统发育研究 汪小全和洪德元 1 9 9 7 但在被子植物中 i t s 序列既有长度上的 保守性又有核苷酸序列的高度变异性 适合解决属间 种间的系统发育问题 另外 i t s 2 在一些起源古老或世代较长的植物类群 如木本竹子 中的变异较低 因而也可研究那些 间隔区进化速度很慢的古老类群间的关系和长世代类群内较高阶元的系统重建 田欣 李德铢 2 0 0 2 近1 0 多年来i t s 序列在系统学研究中得到了广泛的应用 厶1 w e z 和 w e n d e l 2 0 0 3 对5 年来的研究论文做了统计 发现2 4 4 篇有关属或属下水平的系统学 研究论文中 有6 6 的论文与i t s 序列有关 更令人惊奇的是所有有关系统进化的假说 中 有3 4 的假说基于i t s 数据而建立 2 1 8 s 核糖体d n a 中编码区1 8 s 高度保守 一般用于高级阶元的系统研究 其序列变异程 度尤其适于探讨被子植物乃至种子植物内部的深度系统分枝问的关系 j o h n s o ne ta 1 1 9 9 9 s o l t i se ta 1 1 9 9 7 2 0 0 0 由于不同类群中的进化速率不同 1 8 s 基因有时也用于 亚科或属间的关系重建 但也有认为利用1 8 s 探讨单子叶和双子叶植物会产生误导 d u v a l la n de r v i n 2 0 0 4 3 e t s 和i g s 外转录间隔区 e t s 与i t s 相似 位于1 8 s 上游 进化速率也较快 但由于难以找 到合适的引物将整个区域扩增出来 e t s 主要用于较低分类阶元的系统研究 可以研究 种间关系和物种的形成 k a ye ta 1 2 0 0 5 也有用于种间杂交关系的研究 w e e k s 2 0 0 4 位于n r d n a 重复序列间的基因间隔区 i g s 被认为是n r d n a 进化最快的片段之一 推测在近缘类群间的系统学研究 杂交研究及居群遗传学研究上具有一定的应用潜力 但是目前很少应用 4 s s r 微卫星d n a m i c r o s a t e l l i t ed n a 即简单重复序列 s s r s i m p l es e q u e n c er e p e a t s 符合孟德尔遗传模式 共显性表达 广泛分布于真核生物的基因组中 微卫星具有数量 多 分布均匀 多态性信息丰富和易于检测等优点 s c h l o t t e r e re ta 1 1 9 9 2 使得微卫星 成为优良的遗传标记并广泛应用 另外微卫星提高了交配系统和亲本分析 基因流等研 究的准确性 在种群水平上微卫星可用于遗传结构 有效种群大小 种群的系统发育重 建等研究 另外微卫星在很多物种泡括珍稀物种 的遗传结构研究中得到应用 利用微 卫星标记确定有效种群大小 检测有效种群大小的波动可以促使我们正确理解种群遗传 结构动态和种群进化过程 微卫星在种群的系统发育重建研究方面有很大的应用潜力 近年来 越来越多的研究已经开始利用微卫星标记进行物种的亲缘地理学和遗传多样性 3 分析 如 g e xj e ta 1 2 0 0 5 利用核基因的s s r 数据和c p d n a 的p c r r f u 研究了我 国野生香蕉 m u s ab a l b i s i a n a 的居群结构 c p d n a 单倍型的结果显示明显的地理相关的 分布格局 说明地理隔离在其中起着重要的作用 s s r 结果也显示了相似的地理分布格 局 在我国西部没有显示亲缘地理学关系 5 a f l p a f l p 技术是一项新的迅速发展的分子标记技术 利用p c r 技术扩增基因组d n a 限制性片段 基因组d n a 经限制性内切酶消化后 连上双链人工接头 根据接头的核 苷酸序列和酶切位点设计引物 从而进行选择性扩增 扩增产物在凝胶电泳上进行分离 和检测 a f l p 是一种显性标记 不用了解被研究对象的基因组信息 该标记产生的条 带数目多 多态性高 在亲缘地理学的研究中得到了越来越多的应用 s c h 6 n s w e t t e ra n d t d b s c h 2 0 0 5 s k r e d ee ta 1 2 0 0 6 m i l l e re ta 1 2 0 0 6 o r t i ze ta 1 2 0 0 7 s c h 6 n s w e t t e re ta 1 2 0 0 7 s c h 6 n s w e t t e r 和t r i b s c h 2 0 0 5 利用a f l p 对阿尔卑斯山维管植物柴胡属 b u p l e u r u ms t e l l a t u m a p i a c e a e 进行了亲缘地理学研究 他们发现该物种虽然在c o r s i c a d o l o m i t e s 和m o n t a f o n 呈不连续分布 但这几个群体之间的分化并不大 同时 c o r s i c a 的群体很有可能是从东阿尔卑斯山的群体迁移而来 o r i t z 等 2 0 0 7 对分布于欧洲西 南部和非洲西北海岸的h y p o c h a e r i ss a l z m a n n i a n a l 4 个群体1 4 4 个个体进行了a f l p 分 析 9 个引物组合一共扩增出4 8 7 个多态性条带 他们检测到摩洛哥南部的l o u k o s 河 流的群体发生了明显的遗传分化 他们推测该群体是hs a l z m a n n i a n a 第四纪冰期的避 难所群体 遗传多样性降低的原因可能是冰期后群体向北迁移 或者是因为问冰期海平 面上升使群体经历了瓶颈效应 也或者是因为hs a l z m a n n i a n a 繁育系统的改变 由于 a f l p 技术的种种优势 b e n s c h 等 2 0 0 5 建议使用a f l p 技术进行群体遗传多样性和 遗传结构等方面的研究 他们认为 虽然a f l p 为显性的标记 但是通过产生大量a f l p 位点 可以弥补这一不足之处 而且 相对于一些共显性的标记 a f l p 实验体系的建 立耗时更短 更容易 由于核基因是双亲遗传的 经常有位点间的重排和杂合性存在 这些特点给系统学 的研究提高了难度 但同时也为杂交 物种形成和网状进化的研究提供了基础 4 1 1 2 植物谱系地理学中分子标记的选择 分子标记技术的改进使分子谱系地理学研究蓬勃发展 但是在研究中 选择不适合 的遗传标记将会得出一些不合理的解释 w a ne ta 1 2 0 0 4 所以选择有效 合适的分子 标记 是谱系地理学研究中最关键的一步 植物的三种基因组 核基因组 线粒体基因 组合叶绿体基因组 中 核基因组d n a 非常庞大 理论上可以满足亲缘地理学研究的 要求 但是如前所述 核基因为双亲遗传 经常有位点间的重组和杂合性 以及网状进 化的存在 使分析变得困难 核d n a q h 用的较多的是核核糖体内转录间隔k i t s 但由 于i t s 存在旁系同源进化而给系统发育重建带来困难 为解决上述问题 应该考虑寻找 具有足够变异的单拷贝或低拷贝的核基因来研究 s c h a a le ta 1 1 9 9 8 目前利用n d n a 研究植物亲缘地理学的报道也逐渐增多 w a n ga n dg e 2 0 0 6 叶绿体基因组 c p d n a 约占植物总基因组d n a 的1 0 2 0 为双链闭环结构 一般为1 2 0 2 2 0 k b 多在1 2 0 1 6 0 k b 之间 被2 个长约2 2 2 5k b 的反向重复序列 m 分成大拷贝区 l s c 和小拷贝区 s s c 见图1 2 c p d n a 由于具有下列特 性使其成为植物分子进化 分子系统学和分子地理学研究的热点 1 基因组小但包含 大量的d n a 成分 2 在分子水平上能提供有效的信息支持 r i t l a n da n dc l e g g 9 9 0 3 不同区域进化速率不一致 可分别适于不同分类阶元的系统发育研究 4 单亲遗传 细胞分裂时不发生重组 可用于追溯起源和迁移 适于分子地理学的研究 s c h a a le ta 1 1 9 9 8 但由于是单亲遗传 不能解决杂交 渐渗现象或网状进化等问题 汪小全和洪 德元 1 9 9 7 目前常用的片段有两种类型 即叶绿体基因的编码区和非编码区 由于进化速率不 同 两种片段分别用于解决不同的系统学问题 在编码区方面 c h 觞e 等 1 9 9 3 利用r b c l 基因构建了种子植物的系统关系 a p g 1 9 9 8 2 0 0 3 也主要是基于r b c l 基因构建的 a n d e r s o n 等 2 0 0 5 利用r b c l 基因对真双子叶 e u d i c o t s 的基本类群进行了分歧年代 的估计 显示了该片段在系统学研究中的价值 利用非编码区的例子 如t m l f 非编码 区可用于探讨属间或亚属间 w a n ga n dl i u 2 0 0 4 及种间 s t a p p e n 1 9 9 9 的关系 口舻b 而c l 基因间隔区长约8 0 0 9 0 0 p b c h i a n ge ta 1 1 9 9 8 其进化速率较t m l f 非编码区 慢 已用于科问 族间或属间关系的研究 i s s e m 锄a n dr i t z 2 0 0 5 田欣和李德铢 2 0 0 2 但也可用于居群遗传学中 c h i a n ge ta 1 1 9 9 8 s ue ta 1 2 0 0 5 植物线粒体基因组 m t d n a 的进化速率比核基因组 n d n a 还低 w o l f ee ta 1 1 9 8 7 经常发生序列重组 基因组也较动物的大 且变动范围大 w a r de ta 1 1 9 8 1 因此植 物的m t d n a 分析受到很大限制 对植物m t d n a 研究 还可利用d n a 指纹图谱的方法进 行分析 w ue ta 1 2 0 0 5 而不是对某一片段的测序 w u 等 1 9 9 8 研究了北美三种1 3 个居群的松树的m t d n a 样性 种群分化与收敛 发现种间无共有单倍型 主要的遗 传变异存在于居群间 因此 利用c p d n a 单倍型的分布特点来推测种群的起源 迁移 分化已被普遍接 受 但是由于各自的特点决定 不管是n d n a m t d n a 还是c p d n a 都无法完全解决亲缘 地理学所有问题 有必要结合多种基因组的数据 同时结合形态学 生态学 繁育生物 学等多种手段来解决存在的问题 也就是说亲缘地理学需要多种学科的综合研究 近年 的亲缘地理学研究已经注意到这一点 如 g e 等 2 0 0 5 利用核基因的s s r 数据和c p d n a 的p c r r f l p 研究了我国野生香 m u s ab a l b i s i a n a 的居群结构 c p d n a 单倍型的结果显 示明显的地理相关的分布格局 说明地理隔离在其中起着重要的作用 s s r 结果也显示 了相似的地理分布格局 在我国西部没有显示亲缘地理学关系 c h i a n g 等 2 0 0 6 利用 母系遗传的线粒体基因组内含子n i d l 和父系遗传的叶绿体基因组a t p a r b c l 基因间隔区 研究了琉球松 p i n u sl u c h u r n s i s 复合种在中国大陆 台湾和一些太平洋岛屿三个地理 亚种居群的亲缘地理学j 发现有意义的结果 图l 2 水稻叶绿体基因组编码基因 转自田欣 李德铢t2 0 0 2 f i g 1 2t h ee n c o d e dg e n eo fc h l o r o p l a s tg e n o m eo fr i c e 6 1 3 前人关于银杏的研究概况 银杏 g i n k g ob i l o b al 是国家一级保护植物 典型的中生代孑遗植物 是世界著 名的 活化石靠植物 银杏类植物从出现到繁荣以至衰亡 经历了3 个大地质时期 即 起源于古生代 繁荣于中生代 衰亡于新生代 据化石资料 银杏类植物昌盛时期 除 南极洲和赤道两侧外 北起阿拉斯加 加拿大 格陵兰 斯瓦西德群岛 法兰士约瑟夫 地群岛 西伯利亚北部 伊尔库茨克盆地 乌克兰 查理士王地 新西伯利亚群岛 往 南至亚洲 欧洲和北美大陆 南半球的阿根廷 澳大利亚 新西兰以及非洲南部等都有 分布 白垩纪晚期 气候急剧变化 银杏类植物开始衰落 出现了高度进化并能广泛适 应的被子植物 到第三纪末第四纪初的冰川运动 造成了地质条件变迁 山脉隆起和海 底陆地上升 导致欧洲 北美和亚洲大部分地区的银杏灭绝了 仅剩下少数群体残存于 我国长江中下游局部地区 傅立国和金鉴明 1 9 9 2 因此中国是银杏唯一的自然分布 地 国外的银杏都源自中国 记载南宋时传入日本 1 7 3 0 年由日本传入欧洲 荷兰的 乌特列支植物园的银杏古树是第一棵 以后再从欧洲传入北美等 李正理 1 9 5 7 林协 1 9 6 5 陈平平 1 9 9 6 1 3 1 银杏的分类历史及系统地位 1 7 7 1 年l i n n a e u s 将银杏命名为g i n k g ob i l o b a 1 8 9 6 年日本人h i r a s e 和i k e n o 发现 银杏花粉萌发时能产生具鞭毛能游动的精子以后 植物分类学家们才把银杏从紫杉科分 出 成为独立的科属种 梁立兴 1 9 9 6 但至今为止 分类学界对这个独特的物种的 系统地位和演化仍有不同观点 植物学家难于对其定位是因为银杏具有与苏铁类一样的 繁殖方式 又有与针叶类一样的生长形态 就胚胎发育来看 银杏和苏铁等植物有许多 相似之处 如配子体具发达且高度分枝的吸器系统及游动的鞭毛精子 小孢子囊为真蕨 型发育方式 孢子叶为叶性的 雄配子体发育后期近基端明显有扩散生长 且管核迁移 到精原细胞附近 而雄配子体近基球状膨大仅限于游动孢子受精植物 嘲杏和苏铁 尽管初始分枝是银杏雄配子体分枝的主要方式 但在离体条件下有次生分枝 这与 c e r a t o z a m i a 和赤松 p i n u s d e n s i f l o r a 是相似的 此外 从形态及解剖特征来看 银杏 的许多方面又与松 杉类相似 如根和茎的次生木质部具年轮 次生木质部密木型 叶 气孔下陷 根不易产生不定芽 具轮生枝等等 王伏雄等 1 9 8 3 但银杏与苏铁 松 7 柏 蕨类等在系统发育上又有许多不同之处 如银杏雄配子体通过复杂的分枝吸器系统 来减少花粉管伸长阻力 从而大大增加其表面积 体积比值 进而克服养分胁迫 而苏 铁和大多数松树的雄配子体是通过酶的降解和对珠心组织的机械损伤来达到上述目的 总之 从精子形态和结构上看 银杏在裸子植物中属比较原始的物种 从原胚游离核的 数量来看更加明显 即银杏较苏铁进化 而红豆杉科 松柏科却比银杏更为进化 邢世 岩和孙霞 1 9 9 6 1 3 2 银杏的形态学研究 银杏为落叶大乔木 树干高大 雌雄异株 树皮幼时浅绿色 老树呈灰褐色 深纵 裂 粗糙 分枝繁茂 枝分长短枝 叶在长枝上螺旋状散生 在短枝上簇生状 扇形 有长柄 淡绿色 无毛 具有多数叉状分枝细脉 上缘宽5 8 厘米 浅波状 有时中央 有浅裂或深裂 雌株叶柄下方维管束周围有油状空隙 而雄株叶柄下方维管束周围没有 梁立兴 1 9 8 8 雌株一般叶基分叉 而雄株不分叉 雄株裂叶较雌株深得多 雌花 芽瘦而稍尖 雌球花生于短枝叶腋或苞腋 呈簇生状 花梗端常分2 叉稀不分叉或分成 3 巧叉 叉顶各生1 个胚珠 雄花芽大而饱满 顶部稍平 雄球花4 6 枚 成柔荑花序状 下垂 花药黄绿色 花粉球形 萌发时产生2 个具纤毛且能游动的精子 种子核果状 有臭味 中种皮骨质 白色 具2 3 棱 内种皮膜质淡褐色 子叶2 片 花期4 5 月 9 1 0 月种子成熟 梁立兴 1 9 8 8 邢世岩 1 9 9 3 钱丙炎 1 9 9 9 程晓建等 2 0 0 2 p e t e r 1 9 9 2 研究了银杏在生长发育过程中出现的独特的块茎状无性系再生组织一一b 舔a l c h i c h i 发 现此再生组织在适宜的条件下既可以向上发育为植株的根 又可以向下发育为根 认为 这不仅是银杏成为森林中的长寿树种的重要原因 也可能在该物种顺利渡过第四纪冰期 的过程中扮演了重要角色 p e t e r 2 0 0 7 检测了生长纬度的不同对于银杏生长发育的影响 生长在温暖环境中的 银杏比在低温环境下的银杏种子早发芽从而它们有一个更长的幼苗期 银杏胚胎的发育 有温度依赖机制有助于度过寒冷的冬天 这种机制和其它的寒冷适应使银杏度过了寒冷 的早白垩纪 1 3 3 银杏的染色体研究 陈学森等 1 9 9 6 研究结果表明 不论树龄 从5 0 年生到近4 0 0 0 年生 产地及品种 银杏雌雄株核型一致 核型公式为2 n 4 m 8 s m 1 2 s t 2 4 最长染色体与最短染色体之 比大于2 臂比大于2 1 的染色体占8 3 3 3 属较不对称核型 在银杏组织培养中进行 诱变处理 未发现染色体数目变异 说明银杏染色体具有极强的遗传稳定性 陈学森等 1 9 9 8 利用银杏非根尖材料的染色体形态特征鉴别银杏性别 国内外都有报道 但结 果并不一致 陈学森等 1 9 9 6 和l e e 1 9 5 4 p o l l o c k 1 9 5 7 的研究结果一致 认 为雄株的一对最短的次端部着丝粒为性染色体 银杏的性别决定机制为x y 型 1 3 4 银杏植物化学研究 银杏药用价值最高部位为叶 郭娟等 2 0 0 1 银杏叶的化学成分十分复杂 其主 要活性物质是银杏黄酮类和萜类内酯等 齐之尧和李家玉 1 9 9 7 除了最主要的黄酮 类和萜内酯类化合物外还含有有机酸 多糖 酚类 氨基酸 聚戊烯醇 甾类 微量元 素等 据不完全统计 从银杏叶中分离出的化合物有1 4 0 多种 李开泉等 2 0 0 2 银 杏黄酮具广泛的生理活性 是防治心脑血管疾病最理想的天然成分 能有效地治疗各种 类型的老年痴呆症 对抗血小板活化因子 降低血液粘度 血浆胆固醇 血浆纤维蛋白 原 改善血浆胆固醇和磷脂的比例 银杏内酯是一种血小板活化因子拮抗剂 可用于治 疗脑血栓 心肌梗塞等心脑血管病症 同时还具有抗衰老 防治神经系统疾病等功能 殷 智等 2 0 0 0 银杏叶提取物还分离出了聚戊烯醇类化合物和多种长链酚类物质 前者 可制取长醇 用于治疗再生障碍性贫血 肝病和糖尿病 后者可用于抗菌和抗癌 李开 泉等 2 0 0 2 研究表明 银杏叶富含的氨基酸 维生素和矿质元素 具有保健作用 提取物还具有超氧化物歧化酶 s o d 活性 现已用于化妆品 从银杏外种皮提取出氰甙 银杏酚等物质 用于生产生物农药 李兆龙 1 9 9 6 1 3 5 银杏种群生态和地理分布的研究 银杏在世界范围内均有广泛分布 但目前可能的野生群体仅在我国发现 中国科 学家发现在中国的西南地区和东部地区有残存的银杏群落 并对它们进行了多次群落调 9 查 李建文等 1 9 9 9 及向准等 2 0 0 1 分别对重庆市南川金佛山的银杏天然林资源进 行了调查 发现了许多银杏大树 部分树龄在1 0 0 0 年以上 向应海和向碧霞 1 9 9 7 向应海和鲁新成 1 9 9 8 向碧霞等 2 0 0 6 年对贵州省务川县的银杏资源进行了多次 调查 调查结果表明 贵州省务川县至今存在着丰富的野生银杏资源 在全县范围内普 遍存在着野生银杏残存群落 残存树群 残存树丛 残存孤立木及孤立木桩篼迹地等演 替系列 表明在这块土地上 曾经存在过大面积古银杏森林群落 他们认为贵州是银杏 在第四纪冰期的避难所 也是现代银杏的保留地 向应海和向碧霞 1 9 9 7 向应海和鲁 新成 1 9 9 8 向碧霞等 2 0 0 6 p e t e r 等 1 9 9 2 向应海等 2 0 0 0 和林协和张都 海 2 0 0 4 分别对浙江西天目山的银杏进行了资源调查 认为这一地区的银杏也是古银 杏的残存群落 应俊生等 1 9 9 3 2 0 0 1 指出中国横断山脉地区 华中地区和岭南地区 都具有丰富的植物物种多样性 另外 湘黔川鄂边界山地地区 广粤桂湘赣南岭山地地 区和浙闽地区是中国的生物多样性关键 其中湘黔川鄂交界处是东亚亚热带植物区系华 中区系成分分布的核心地段 是世界上生物多样性的热点地区之一 w w w c o n s e w a f i o n o r g m y e me ta 1 2 0 0 2 分布有著名的梵净山和巫山 目前 这些地区分布有银杏群落 根据花粉模拟的末次冰期中国植被分布的情况以及基于g i s 的古代植被分布情况来看 中国的西南地区在末次冰期时很有可能仍为森林所覆盖 同时东亚地区的植被呈连续分 布 h a r r i s o ne ta 1 2 0 0 1 y ue ta 1 2 0 0 1 r a ye ta 1 2 0 0 1 1 4 基于分子生物学方法有关银杏的研究 1 4 1r a p d 谭晓风 1 9 9 8 茵 次利用r a p d 标记研究了银杏的性别鉴定 找到了一个可能为雄性 所有的r a p d 片段 并对该片段进行了分离 克隆 探针制备 刘叔倩等 2 0 0 1 应 用r a p d 标记技术分析银杏2 8 个变异类型 品种 的遗传分化及其遗传多样性水平 结果显示供试银杏样品遗传多样性水平较低 样品间遗传关系较近 k u d d u s 等 2 0 0 2 利用r a p d 技术分析了美国3 个群体的1 8 株银杏的遗传变异 结果发现 宾夕发尼亚 西部和华盛顿特区的银杏带型极为相似 尼亚加拉瀑布的银杏带型与前述两地的银杏有 较大的差异 并推断在美国可能存在不同群体的银杏 且遗传多样性比较高 1 0 1 4 2i s s r h o n g 等 2 0 0 1 使用i s s r 和r a p d 分子标记对韩国境内6 个银杏群体进行了遗传 多样性分析 葛永奇等 2 0 0 3 采用了i s s r s 分子标记技术 对江苏泰兴 美国纽约栽 培群体和从群落生态学调查所推测的3 个可能的银杏野生自然群体 浙江天目山 贵州 务川 湖北大洪山区 的遗传多样性水平和群体遗传分化进行了研究 结果表明 与其 它濒危和孑遗裸子植物比较 银杏种内具有丰富的遗传变异 p p b 7 0 5 h 0 2 4 0 8 i 0 3 5 9 9 贵州务川群体的遗传多样性水平最高 江苏泰兴栽培群体和美国纽约的栽 培群体的遗传多样性水平较低 与k u d d u s 等 2 0 0 2 所推测的结果相似 1 4 3n s 陈月琴等 1 9 9 9 测定了银杏雌株核糖体r d n ai t s 区全序列共1 1 7 2 碱基对 分析 结果表明 形态上仅有很少变化的银杏 其个体之间有明显的分子差异 不同产地栽培 株r d n ai t s 区序列的核苷酸差异值高达2 5 这一差异远远大于一般意义上种间的距 离 表明该类植物形态上的变化与分子进化的不一致 1 4 4 a f i p 王晓梅等 2 0 0 1 利用a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m a f l p 技术 应用 4 8 个引物组合 检测了雌雄银杏基因组d n a 的多态性 筛选与银杏性别相关的分子标 记 其中3 个引物组合各提供了1 个与雌性相关的分子标记 经s o u t h e r n 点杂交证实 有两个标记为银杏雌性基因组所特有 这些分子标记的获得 为寻找性别特异的探针或 p c r 引物 用于银杏的性别鉴定奠定了基础 王利 2 0 0 6 运用a