烟草实验操作手册-0707.doc

2011年烟草生理指标测定操作手册一、 取样方法和测定指标：1、不同烤烟品种生理生化特征与烟叶质量风格特征研究 在生长特征观测的同时，从第11叶的叶长为0.5cm时算起，每个品种在11叶上挂塑料牌标记, 10天后开始取样，以后按品种每10天选取表现一致的典型植株(第一次取样40株,第二次取样20株,第三次取样10株, 连续采样至该叶位采收结束)；第17叶的取样方法为: 从第17叶的叶长0.5cm时的10天后开始取样, 第一次取样40株,第二次取样20株,第三次取样10株，连续采样至该叶位采收结束(每个植株只取一次样或1个叶片)。 采集第11叶位和17位的叶片（分别表示中部叶、上部叶），一部分叶片（10片叶，除去叶片的主脉）在105杀青15min，60烘干至恒重(30h)后送检（此操作在咸丰县基地完成），剩余叶片（除去叶脉）保存在-30的低温冰箱中待测，在华中农业大学植物生理实验室完成。分别测定以下11个指标。酶活性的测定： 硝酸还原酶活性（磺胺比色法）、谷氨酸/丙酮酸转氨酶、淀粉酶活性（3，5-二硝基水杨酸显色法）、蔗糖合酶（SS）、蔗糖转化酶（3，5-二硝基水杨酸显色法）。有机成分的测定： 可溶性糖含量（蒽酮显色法）、淀粉含量（盐酸水解总糖残渣3，5-二硝基水杨酸显色法）、总氮含量（凯式定氮法）、蛋白质含量（考马斯亮蓝比色法）、烟碱含量（盐酸提取活性碳脱色法）、游离氨基酸含量（水合茚三酮比色法）。2、特色优质烟叶关键栽培因子筛选生理指标分析 对于5种不同的处理材料（I-V）：分别在5个时期（现蕾期前30天, 现蕾期前15天, 现蕾期,现蕾后15天, 现蕾后30天）选取烟叶样后，分成上部叶、中部叶、下部叶。 在5个处理中, 每个处理选取4株(每个重复选取2株)长势长相具有代表性的烟株，取上部烟叶（上部1-5叶）, 中部烟叶（中部的叶片）和下部烟叶（下部1-5叶）三部分。在田间迅速放置在冰盒中带回武汉。酶活性的测定： 在实验室中， 测定单株各部位烟叶的鲜重后，将材料分成两份：一份（2株）烟株的上部、中部和下部叶片放置在-20冰柜中保存。用于硝酸还原酶（NR）、谷丙转氨酶（GPT）、蔗糖合酶（SS）、蔗糖转化酶（INV）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定。 有机成分的测定： 另一份（2个烟株）于105下杀青20min，70下烘干至恒重。分别称量上部叶、中部叶和下部叶的干重。最后，测定淀粉、可溶性糖， 烟碱、总蛋白总N和可溶性氨基酸含量。二、 酶活性的测定流程2.1 淀粉酶的测定过程（王艳丽）一材料、仪器设备及试剂（一）材料 烟叶（二）仪器设备冷冻离心机，分光光度计，天平，冰箱，恒温水浴，研钵，离心管，洗耳球，移液管，具塞刻度试管，1ml移液枪，枪头（三） 试剂1. DNS试剂： 精确称取3、5二硝基水杨酸1g溶于20ml 1mol/L NaOH中，加50 ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，溶解后盖紧瓶塞，勿使CO2进入。2. 麦芽糖标液：称取麦芽糖0.1000g溶于少量蒸馏水中，定容至100ml即为1mg/ml的麦芽糖标液。二实验步骤1. 酶液提取：称取鲜样0.2克，加1% NaCl 8 ml研磨（低温），放置15min，不时摇动。3000rpm离心10min。2. 待测：取1ml酶液，加1淀粉(预先在40度水浴中保温!)1ml。空白对照： 取1ml酶液，100度水浴10min，加1淀粉1 ml。混匀后，40水浴5min（准确记时）。取出后，将各试管分别加入DNS 2 ml，煮沸5-10 min。冷却后，定容至25ml。然后在520 nm下比色。 注：淀粉临时配制。1淀粉：1g溶于100ml水中。3标准曲线的制作：取25ml具塞刻度试管7支，按下表加入各种试剂。混匀，在沸水浴中加热5-10min。取出后冷却至室温。加蒸馏水至25ml刻度。摇匀后，取4ml上清液，在520nm下比色，绘出标准曲线。管号麦芽糖含量（mg）麦芽糖标液（ml）蒸馏水（ml）DNS试剂（ml）012345600.20.61.01.41.82.000.20.61.01.41.82.02.52.31.91.51.10.70.52.02.02.02.02.02.02.0淀粉酶总活力（麦芽糖mg/g鲜重min）=查得的麦芽糖含量(mg)淀粉酶原液总体积(ml)稀释倍数/样品重(g)测定时酶液用量(ml)反应时间(min)2.2 硝酸还原酶活力的测定（离体法）（潘舒）一实验原理 硝酸还原酶催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸及萘胺在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物，在540nm有最大吸收峰。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以N g/ (g. h)为单位表示。二材料、仪器设备及试剂（一）材料 烟叶（二）仪器设备冷冻离心机，分光光度计，天平，冰箱，恒温水浴，研钵，剪刀，离心管，洗耳球，移液管，具塞刻度试管（四） 试剂1. 亚硝酸钠标准溶液： 取分析纯NaNO2 0.9857g，溶于蒸馏水定容至1000ml，再吸取5ml定容至1000ml。2. 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)：取 Na2HPO412H2O 30.0905g与NaH2PO42H2O 2. 4965 g，加入蒸馏水溶解定容至1000ml。3. 1% 磺胺溶液：1.0g磺胺溶于100ml 3mol/L HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3 mol/L HCL）。4. 0.02%萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶100ml蒸馏水中，贮于棕色瓶。5. 0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液。6. 0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液：取Na2HPO412H2O 8.8640 g与K2HPO43H2O 0.0570 g，加入蒸馏水溶解定容至1000ml。7. 提取缓冲液：取0.1211g 半胱氨酸、0.0372g EDTA溶于100ml 0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲液中。8. 2mg/ml NADH溶液：2mg NADH 溶于1ml 0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液（现配现用）。三实验步骤（一）标准曲线的绘制 取7支具塞刻度试管，按下表加入试剂，混合均匀后在25下保温30min左右，用1cm光径比色皿在540nm下比色测定吸光度。以硝态氮（g）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。管号1234567亚硝酸纳标准液/ml0.00.20.40.81.21.62.0蒸馏水/ml2.01.81.61.20.80.40.01%磺胺/ml4.04.04.04.04.04.04.00.02%萘基乙烯胺/ml4.04.04.04.04.04.04.0每管含亚硝态氮/g0.00.20.40.81.21.62.0（二）样品测定1. 酶的提取：取鲜样0.5g，剪碎于研钵中, 置于低温冰箱30min，取出置冰浴中, 加少量石英砂及4ml提取缓冲液，研磨成浆。4、4000rpm离心5min，上清液为粗酶提取液。2. 酶的反应：取提取液0.4 ml于10 ml试管，加入1.2 ml 0.1mol/L KNO3溶液和0.4mlNADH溶液，混匀。25水浴中，保温30min；对照不加NADH溶液，而以0.4ml 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液代替。3. 保温结束后，立即加入 1 ml磺胺终止酶反应，再加1ml萘基乙烯胺溶液，显色15min后4000rpm离心5min，取上清液测吸光值。四结果计算单位鲜重样品中硝酸还原酶的活性=xV2*V1w*t g/(gh)式中：x为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量(g)；V1为提取酶时加入的缓冲液体积(ml)；V2为酶反应时加入的粗酶液体积(ml)；W为样品鲜重(g);t为反应时间(h)。2.3 蔗糖转化酶测定3，5-二硝基水杨酸法（张言芳）一、仪器设备紫外可见分光光度计，容量瓶100 ml，移液器，离心管和离心机，水浴锅，温度计，烘箱，滤纸，天平，25 ml的具塞试管。二、试剂1. 1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取100 mg 无水葡萄糖（预先在105干燥至恒重），用少量水溶解后，转移到100 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀。2. 100 g/L NaOH水溶液。3. DNS试剂： 精确称取3、5二硝基水杨酸1 g溶于20 ml 1 mol/L NaOH中，加50 ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，溶解后盖紧瓶塞，勿使CO2进入。4. 磷酸盐缓冲溶液（pH6.8）：0.1 mol/L Na2HPO4 49.1 ml和0.1 mol/L KH2HPO4 50.9 ml混匀。5. 100 g/L蔗糖溶液：称取10 g蔗糖溶于少量水中，转入100 ml容量瓶中，加10 ml磷酸盐缓冲溶液（pH6.8），用水稀释至刻度。二、实验步骤1、标准曲线绘制准确吸取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml（相当于0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg葡萄糖）分置6支25 ml的具塞比色管中，各加水至2.0 ml，各加3,5-二硝基水杨酸试剂1.5 ml，置沸水浴中5 min，取出后立即用冷水冷却至室温，再用水将各管定容至刻度。立即于520 nm波长处，用1 cm比色皿，以试剂空白作参比，测定吸光度。根据测得的吸光度值绘制标准曲线或计算直线回归方程。2、蔗糖转化酶活性的测定称取0.5 g烟叶，用水研磨，并定容至6 ml，然后在3000 r/min离心10 min。定容（由后面的吸光值确定定容多少体积）混合液：吸取10 ml酶液和10 ml蔗糖溶液，混匀，吸取此混合溶液5 ml，用水稀释并定容至100 ml容量瓶中。转化液：取混合液8 ml于45水浴中转化1 h，取出立即快速冷却至室温。吸取混合液和转化液各1 ml，分置25 ml的具塞试管中，各加水至2 ml，各加3,5二硝基水杨酸试剂1.5 ml，在沸水溶中5 min，取出后立即用水冷却至室温，再用水将各管定容至刻度。立即于520 nm波长处，用1 cm比色皿，以试剂空白作参比，测定吸光度。3、计算：N=n*A/W/V*200 M=n*A/W/V*200蔗糖转化酶活性(mg/g)=10*2(M-N)式中：M转化后单糖(mg/g)； N转化前单糖(mg/g)；A从标准曲线上查得的葡萄糖含量(mg)；W样品质量(g)；V测定用样品体积(ml)；N稀释倍数；蔗糖转化酶活性单位(mg/g)：在1g烟叶作用下，能使蔗糖转化为单糖的mg数。2.4 蔗糖合酶（孔霖）一、实验原理蔗糖合酶催化反应：UDPG+果糖-蔗糖+UDP这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。该酶在分解方向的Km值相对较高（30-150mmol/L），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。蔗糖合酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD，测定果糖含量表示酶活性）。二、仪器设备及设备冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），0.1、0.5、1、5 ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱 三、试剂配制1. 提取缓冲液： 100 mmol/L Tris-HCl (pH7.0)缓冲液，内含5 mmol/L MgCl2, 2mmol/L EDTA-Na2, 2%乙二醇，0.2% 牛血清蛋白（BSA），2% PVP，5 mmol/L DTT。2. 透析缓冲液：25mmol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液，内含2.5mmol/L MgCl2, 1mmol/L EDTA-Na2, 1%乙二醇，1mmol/L DTT。3. 酶反应液：100mmol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液，内含10mmol/L果糖, 2mmol/L EDTA-Na2, 5mmol/L 醋酸镁，5mmol/L DTT。4. 10mmol/L UDPG: 称取0.012206 g UDPG，配成2ml，浓度计为 10mol/L UDPG,随配随用。5. 2mol/L NaOH。6. 30% HCl。7. 0.1% 间苯二酚：0.1g间苯二酚溶于100ml 95%乙醇中，棕色瓶保存。8. 1mg/ml蔗糖标准液。四、实验步骤1. 酶液制备： 称取1g植物叶片，置于预冷的研钵中，分批加入5ml提取缓冲液，冰浴研磨提取，2、10000转离心20min。上清液3ml装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲液中4透析过夜。期间更换透析液3次，透析后酶液定容5ml备用。2. 蔗糖合酶活性测定：取3支10ml具塞试管，加入0.4ml酶反应液，0.1ml UDPG和0.05ml透析后的酶液，补水至1ml。于30水浴中反应10min后，沸水浴3min中止反应，对照用蒸馏水代替UDPG。3. 蔗糖含量测定：往各反应试管中加入 2mol/L NaOH 0.1 ml, 沸水浴10 min后，冷却至室温。加30% HCl 3.5 ml, 0.1%间苯二酚 1 ml。摇匀后，于80保温10 min。冷却后，480nm处比色，测定蔗糖生成的量。4. 标准曲线制作：取7支10ml具塞试管，并按下表加入各种试剂，按上述步骤3反应并测定其吸光度。以吸光度值为纵坐标，蔗糖含量为横坐标，绘制标准曲线，以计算反应中蔗糖形成的数量。试剂 管号12345671mg/ml蔗糖标准液（ml）00.10.20.40.60.81蒸馏水（ml）10.90.80.60.40.20蔗糖含量（mg）00.10.20.40.60.81A4805. 结果计算：蔗糖合酶活力（mg蔗糖/(g*FW*L)）= C*Vt*n/(FW*t*Vs)式中：C是从标准曲线查得的蔗糖量（mg）；FW是样品鲜重（g）;t是反应时间（h）；Vt是提取酶液总体积（ml）；Vs是测定时取用酶液体积（ml）；n是提取液测定中的稀释倍数。【注】透析袋不可装满，以防止吸水涨破。2.5 谷氨酸/丙酮酸转氨酶的测定（孔霖）（赖氏比色法）(一) 方法原理谷氨酸丙酮酸转氨酶(间作GPT) 是植物体内最普遍的转氨酶,其催化下述反应: GPT :L - 谷氨酸+ 丙酮酸L - 丙氨酸+- 酮戊二酸植物酶粗提液中GOT 对基质中门冬氨酸和-酮戊二酸反应起催化作用,在一定的反应条件下,产生一定量的草酰乙酸,草酰乙酸随之脱羧成为丙酮酸(Pyruvic acid ,简写Pyr) 。反应至规定时间后,加入2 ,4 - 二硝基苯肼及盐酸溶液终止反应,同时2 ,4 - 二硝基苯肼与酮酸中羰基加成,生成丙酮酸苯腙。在碱性条件下,苯腙呈红棕色,其颜色深浅与丙酮酸含量在一定范围内成正比,可用分光光度计以500nm 波长进行比色,测定丙酮酸含量以确定GOT 活度。 酶粗提液中GPT 作用于基质中丙氨酸和- 酮戊二酸,生成丙酮酸及谷氨酸,酶促反应达到规定时间后,加2 ,4 - 二硝基苯肼及盐酸溶液终止反应,再按上法测定丙酮酸含量来确定GPT 活度。(二) 主要仪器与试剂1、 主要仪器设备 高速离心机, 恒温水浴锅, 722G分光光度计。2、 主要试剂(1) 0. 05mol/ L Tris - HCL 缓冲液(pH7. 2): 0. 2mol/ L 三羟甲基氨基甲烷(24. 2g 三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解并定容至200ml) 50ml 和0. 2mol/ L HCl 44. 2ml ,用蒸馏水稀释至200ml 。(2) 0. 1mol/ L 磷酸盐缓冲液: 称取磷酸氢二钠(AR) 11. 928g ,磷酸二氢钾(AR) 2. 176g ,加少量蒸馏水溶解并定容至1000ml 。(3) 2 ,4 - 二硝基苯肼溶液:称取2 ,4 - 二硝基苯肼19. 8mg ,用10mol/ L HCL10ml 溶解后,加蒸馏水至100ml ,保存于棕色瓶中备用,此液可保存3 个月。(4) 0.4mol/ L 氢氧化钠溶液:16g 氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至1000ml 。(5) 1 mol/ L 氢氧化钠溶液:40g 氢氧化钠(AR) 加蒸馏水溶解并定容至1000ml 。(6) 丙酮酸标准液(2mol/ ml) :精确称取纯丙酮酸钠22. 0mg 于100ml 容量瓶中,加0. 1mol/ L 磷酸盐缓冲液至刻度。此液应新鲜配制。(7) GPT 底物液: (DL - 丙氨酸200mmol/ L ,- 酮戊二酸2mmol/ L) : 称取- 酮戊二酸29. 2mg 和DL -丙氨酸1. 79g 置于一小烧杯中,加入0. 1mol/ L 磷酸盐缓冲液(pH7. 4) 约80ml 煮沸溶解后,待冷,用1mol/ L氢氧化钠调pH 至7. 4 (约加0. 5ml) ,再加0. 1mol/ L 磷酸盐缓冲液至100ml 混匀,加氯仿数滴防腐,贮于冰箱内。(三) 操作步骤1 酶粗制剂的提取将新鲜植物材料剪碎,取鲜重0. 2g 左右放入研钵,加0. 05mol/ L Tris - HCl 缓冲液(pH7. 2) 2. 0ml ,在冰浴中研磨,得到的匀浆用高速离心机20000 g 离心20min ,上清液供测酶活度用。2. 谷丙转氨酶( GPT) 活度测定取10ml 试管2支,一支作测定管,分别加酶粗制剂0. 1ml 和GPT 底物液0. 5ml ,另一支作对照管,仅加酶粗制剂0. 1ml 。将二管同时置37 水浴,30min 后取出,各管加2 ,4 -二硝基苯肼液0. 5ml 终止反应,对照管再加GPT 底物液0. 5ml 。将二管再置37 水浴中20min ,取出后各管加0. 4mol/ L NaOH 5. 0ml ,混匀,10min 后用分光光度计比色,波长500nm ,蒸馏水调零点,读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度,得吸光度差值,查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml) ,若查得的丙酮酸体积超过0. 2ml 时应将酶粗制液稀释后再进行测定,测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(ml) 。工作曲线绘制: 取10ml 试管6 支,各管加0. 1mol/L 磷酸盐缓冲液0. 1ml ,分别加GPT 底物液0. 5 、0.45 、0. 40 、0. 35 、0. 30 、0. 25ml ,丙酮酸标准液0 (对照管) 、0. 05 、0. 10 、0. 15 、0. 20 、0. 25ml 。置37 水浴中5min ,各管加2 ,4 - 二硝基苯肼溶液0. 5ml ,混匀,再置37 水浴中20min ,取出后各管加0. 4mol/ L 氢氧化钠溶液5ml ,混匀,10min 后同上比色,读取各管吸光度。各管吸光度分别减去对照管吸光度,以各管丙酮酸体积为横座标,以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。(四) 结果计算转氨酶活度以每克植物鲜样在30min 内反应生成的丙酮酸微摩尔(mol) 表示。GPT 活度mol/ g30min = (C V 20) / (m 2)式中,C 丙酮酸标准溶液的浓度(mol/ ml) ;V 由工作曲线查得的丙酮酸体积(ml) ; 20 稀释倍数;2 反应时间换算系数, GOT 实际反应时间为1h ,按习惯本法酶活性以 30min 计算4,故应除以2 ;m 植物鲜重(g) 。2.6 苯丙氨酸解氨酶的活性测定（王艳丽）一、原理 苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonia lyase,简称 PAL；EC4.3.1.5）催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若酶的加入量适当，A290升高的速率可在几小时内保持不变。通过测定A290升高的速率以测定PAL活力。 酶的活力单位：规定1h内A290增加0.0l为PAL的一个活力单位，相当每ml反应混合液形成1g肉桂酸。二材料、仪器设备及试剂（一）材料 烟叶（二）仪器设备冷冻离心机，分光光度计，天平，冰箱，恒温水浴，研钵，剪刀，离心管，洗耳球，移液管，具塞刻度试管，1ml移液枪，枪头（三） 试剂1. 0.lmol硼酸-硼砂缓冲液(pH8.8)。2. 酶提取液：0.1mol/l硼酸-硼砂缓冲液（含1mmol/lEDTA, 5mmol /L-巯基乙醇）。3. 0.02mol/l L-苯丙氨酸溶液（用0.1mol/L pH8.8硼酸缓冲液配制）。4. 6mol/l HCl5. 100g/ml标准蛋白质溶液：准确称取10 mg 牛血清白蛋白于烧杯内，用蒸馏水溶解，完全转移到100ml容量瓶内，定容至刻度，混匀。6. 考马斯亮蓝G-250蛋白质染色液：称取10mg考马斯亮蓝G-250,溶于5ml95%乙醇中，加入85（W/V）磷酸l0 ml ，混匀后即为母液。利用时，按15ml母液加85m1蒸馏水的比例稀释，混匀后过滤即为稀释液。三、操作步骤1. 酶液提取。植物材料lg，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上研钵研磨。2. 将已匀浆的酶液用三层纱布过滤。滤液转入离心管。10000g冷冻离心30min。3. 离心后，取上清液，即为酶粗提液。量出其体积，放置冰浴中备用。4. 酶活力测定：取试管3支，按表中所述加样(0号为调零管，1号为测定管，2号为对照管 ) 试管编号1230.1mol/l硼酸缓冲液43.94.9酶液0.10.10.02mol/l苯丙氨酸(ml)11将各管混匀，放入40恒温水浴保温1h，到时加0.2ml 6mol/1HCl终止反应。紫外分光光度计预热l0 min,于波长290nm 处测定各管的A290。(5) 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度。取酶液0.1ml，用蒸馏水稀释至5ml. 取试管8支，按下表加入各溶液：试管编号01234567标准蛋白质溶液(ml)00.20.40.60.81.0稀释酶液（mI）11蒸馏水（ml）21.81.61.41.21考马斯亮蓝(ml)22222222 将上述各管混匀，静置2min,测定各管的A595。四、结果处理1. PAL活力的公式为植物样品中PAL活力=A290*VtW*Vs*0.01式中：A290为290nm的吸光值；Vt为提取液总体积（mL）；W为样品鲜重（g）；VS为测定时加样量（mL）。2. 蛋白质含量的公式为：样品中蛋白质的含量=C*VTVS*WF*1000(mg/g)式中：C为查标准曲线值（g）；VT为提取液总体积（mL）；WF为样品鲜重（g）；VS为测定时加样量（mL）。 注意：绘制蛋白质测定的标准曲线：以15号管溶液的A595值为纵坐标，相应管中的蛋自质微克数为横坐标，作图。三、 有机成分的测定流程3.1 总氮的测定（王艳丽）干重0.10.5g(依样品含氮量而定，含氮13mg为宜)，用凯氏定氮仪测定。3.2 烟碱的测定(盐酸萃取法) （孔霖）一、实验原理：烟碱在强酸条件下，可从烟叶中脱离出来，同时色素进入提取液，利用活性炭的吸附作用脱色、烟碱对特定波长的光有吸收能力，测定烟碱的含量。二、测定步骤：1待测液的制备：称取0.030 g样品放入100ml的三角瓶，加1/3角匙的活性炭和25ml 0.5N的盐酸。振荡5 min，过滤到100 ml的容量瓶中，洗三角瓶、合并滤液并定容摇匀待测。2. 空白： 取0.5N 25ml盐酸加入容量瓶中，定容摇匀。3. 测定： 以空白参比在分光光度计仪器上调读数为零，在3个波长处（236nm，259nm，282nm）分别测定A。4. 计算：烟碱% = 1.059A2590.5（A236+A282）100100/W(1水%)3431000式中：1.059是校正系数；F是稀释倍数；V是待测试液体积；34.3是烟碱的吸光系数3.3 游离氨基酸的测定（茚三酮显色法）（潘舒）一、原理氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，其吸收峰在570nm，颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。二、仪器设备及试剂配制（一）仪器设备分光光度计，分析天平，研钵，烧杯，容量瓶，试管，移液管，水浴锅，三角瓶，漏斗。（二） 试剂配制1. 水合茚三酮试剂： 取0.6g再结晶的茚三酮，加入15ml正丙醇搅拌溶解，再加30 ml正丁醇和60ml乙二醇，最后加入9 ml pH5.4的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，4保存备用，10d内有效。2. 乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）：称乙酸钠54.4g，加入100ml超纯水加热至沸，使体积蒸发至60 ml左右，冷却转入100 ml容量瓶，加入30 ml冰醋酸，超纯水定容至100 ml。3. 标准氨基酸（5 g/ml，标曲用）：称80烘干的亮氨酸46.8mg，溶于少量10%异丙醇中，用10%异丙醇定容100ml, 取5ml,蒸馏水稀释至50ml。4. 0.1%抗坏血酸：取50mg抗坏血酸，溶于50ml超纯水中，现配现用。三、 实验步骤（一）标准曲线的绘制1. 取6支20ml刻度试管，按下表加入试剂，混合均匀。2. 沸水中加热20min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色时，用80%乙醇定容至20ml。3. 混匀后，用1cm光径比色皿在570nm下比色测定吸光度。以氨基酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。管号123456标准氨基酸/ml0.00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml2.01.81.61.41.21.0水合茚三酮/ml3.03.03.03.03.03.0抗坏血酸/ml0.10.10.10.10.10.1每管含氮量/g0.01.02.03.04.05.0（二）样品测定1. 取鲜样0.5g，洗净擦干并剪碎，沸水浴10min。2. 取1ml待测液，放入20ml干燥试管中，加入1ml超纯水。3. 依次加入3ml水合茚三酮试剂，0.1ml 0.1%抗坏血酸（现配先用）。4. 沸水浴显色20min。冷却后加入80%乙醇并定容至20mL。混匀后，用1cm光径比色皿在570nm下比色测定吸光度。四结果计算100克样品中氨基态氮含量=C*VTVS*W *100式中：C为查标准曲线值得氨基态氮含量（g）；VT为样品稀释总体积（ml）；VS为测定时样品体积（ml）；W为样品鲜重（g）。注： 茚三酮重结晶方法：合格茚三酮为微黄色结晶，若颜色变深或成微红色，必须重结晶。方法：5g茚三酮溶于15ml 热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，若太稠可加水，30 min后滤纸过滤，置冰箱过夜可见微黄结晶。用干滤纸过滤，再用1 ml 蒸馏水洗结晶一次，置于干燥器中干燥后贮于棕色瓶。 严格控制抗坏血酸的量。3. 4 考马斯亮兰法（Bradford法）测总蛋白（潘舒）一实验原理考马斯亮兰G-250染料测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（11000g），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。二仪器设备及试剂配制（一）仪器设备分光光度计，研钵，烧杯，量瓶，移液管，具塞刻度试管。（二）试剂配制1. 标准蛋白质溶液（100g/ml 牛血清蛋白）： 取牛血清蛋白25mg加水定容至100ml。取上述溶液40ml用蒸馏水稀释至100ml。2. 考马斯亮兰G250染料试剂： 取100mg考马斯亮兰G250，溶于50ml 90%乙醇，加入100 ml 85%（W/V）的磷酸，定容至1L。贮存棕色瓶，常温保存6个月。三实验步骤（一）标准曲线的绘制取6支具塞试管，按下表加入试剂，混合均匀后放置5min左右，用1cm光径比色皿在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。管号123456标准蛋白质/ml0.00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.20蛋白质含量/g020406080100考 G-20/ml5.05.05.05.05.05.0（二）样品测定1. 取鲜样0.250.5g，加入5ml蒸馏水研磨成匀浆。2. 3000rpm离心10min，取上清1ml。取样品提取液1.0 mL至具塞试管中，加入5ml 考马斯亮兰G-250 混合，放置2 min后在595nm下比色，测定吸光度。3. 通过标曲查蛋白质含量。四结果计算样品中蛋白质的含量=C*VTVS*WF*1000(mg/g)式中：C为查标准曲线值（g）；VT为提取液总体积（mL）；WF为样品鲜重（g）；VS为测定时加样量（mL）。3.5 淀粉的测定方法-蒽酮法（张言芳）一、原理用乙醇将烟叶中可溶性糖浸出并分离出去。然后，烟叶中淀粉用适量HCl，因淀粉在稀酸作用下被水解成葡萄糖，再按葡萄糖测定进行。根据葡萄糖的含量从而算出淀粉含量。二、仪器设备与试剂（一）仪器：三角瓶50ml，容量瓶100ml，移液管10ml、1ml，漏斗，圆底烧瓶1000ml，离心管和离心机，水浴锅，温度计，烘箱，滤纸，天平，分光光度计。（二）试剂与试剂的配制：盐酸，乙醇，氢氧化钠，蒽酮。1. 葡萄糖标准液的配制：称取无水葡萄糖（AR级，即为分析级）0.1 g溶于蒸