靶向CK1α 基因SHRNA 表达载体的构建及其对A549 细胞增殖的影响.pdf

2010年3月 第33卷 第1期 湖南师范大学自然科学学报 Journal ofNatural Science of Hunan Nor malUniversity Vol 33 No 1 Mar 2009 靶向CK1 基因shRNA表达载体的构建 及其对A549细胞增殖的影响 邹飞雁 3 姜少杰 刘 晓 李俐娟 刘婉君 暨南大学生殖免疫研究所 中国 广州 510632 摘 要 通过RNA干扰实验沉默酪蛋白激酶1 Casein Kinase1 CK1 基因 探讨其对肺癌细胞A549生长 增殖的影响 首先构建3个针对CK1 基因不同位点的短发夹表达载体pGenesil2CK1 2 S1 pGenesil2CK1 2 S2 pGen2 esil2CK1 2 S3和一个无义错配载体pGenesil2NK 分别转染A549细胞 用G418筛选出阳性克隆 得到A5492S1 A5492S2 A5492S3及A5492NK细胞株 再通过RT2PCR和Western blotting方法 分别检测了CK1 基因的mRNA和 蛋白的表达情况 比对A5492NK A5492S1 A5492S2及A5492S3 mRNA水平的抑制率分别为84 3 57 9 和 611 8 P 0 001 蛋白质水平的抑制率分别为78 4 51 3 和59 9 P 0 001 选择干扰效率较好的A5492 S1细胞进行后续实验 细胞计数绘制生长曲线 CCK28法观察细胞增殖状况和流式细胞仪检测细胞所处周期时相 来分析转染CK1 基因shRNA表达载体对A549细胞生长增殖的影响 实验结果显示 A5492S1与A549和A5492NK 两对照组的平均值比较 细胞计数抑制率为 37 7 2 2 P 0 01 CCK28抑制率为 26 2 1 5 P 0105 S期减少 75 0 4 0 P 0 01 G2 M期减少 45 2 5 4 P 0 05 因此 转染CK1 基因shRNA 表达载体可导致CK1 基因的沉默 明显抑制A549细胞的生长和增殖 关键词 酪蛋白激酶1 A549 RNA干扰 细胞增殖 中图分类号 R73412 文献标识码 A 文章编号 100022537 2010 0120101207 Construction of an Expression Vector Carrying Short Hairpin RNA Targeting CK1 Gene and Its Effects on A549 Cells Grow th ZOU Fei2yan JIANG Shao2jie L IU X iao L I L i2juan L IU W an2jun Institute of productive I mmunology Jinan University Guangzhou 510632 China Abstract Casein Kinase1 CK1 is silenced by RNA interference for investigating the effect on A549 cells growth and proliferation First three shRNA plas mids specifically targeting different sites ofCK1 pGene2 sil2CK1 2 S1 pGenesil2CK1 2 S2 pGenesil2CK1 2 S3 and one nonsense shRNA plas mid pGenesil2NK are constructed and transfected into A549 cells and the stable transfected cell lines A5492S1 A5492S2 A5492S3 and A5492NK are sorted out by G418 Secondly the expression of mRNA and protein ofCK1 is detected by semi2quantitative RT2PCR and western blotting Compared with pGenesil2NK expression of A5492S1 A5492S2 and A5492S3 are dereased by 84 3 57 9 and 61 8 respectively at mRNA level P 0 001 78 4 51 3 and 59 9 respectively at protein level P 0 001 ThusA5492S1 is chosen to do further experiment Thirdly cell growth curve is drawn by cell counting cell proliferation ismeasured by CCK28 and cell cycle distri2 bution is assessed by flow cytometry for investigating the difference among A549 A5492NK and A5492S1 cells growth and proliferation Experimental results show that the A5492S1 cells IR is 37 7 2 2 in cell counting experiment P 0 01 and 26 2 1 5 in CCK28 assay P 0 05 respectively and the S and G2 M 3收稿日期 2010202228 基金项目 国家自然科学基金资助项目 30471954 中国博士后科学基金资助项目 2003034467 暨南大学自然科学 基金资助项目 3 通讯作者 E2mail zoufeiyan6364 yahoo com cn phase in A5492S1 cells are significantly reduced by 75 0 4 0 P 0 01 and 45 2 5 4 P 0105 compared with the average values of A549 and A5492NK Therefore silencing ofCK1 gene can inhibit the growth and proliferation ofA549 cells efficiently Key words Casein Kinase1 CK1 A549 RNA interference cell growth 人类CK1 基因位于5q32 1 属于丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶家族 2 CK1 参与多种细胞生理过程 包括 膜转运 细胞周期 染色体分离 细胞凋亡和细胞分化等 CK1 还参与Wnt 2 Catenin Hedgehog及NF 2 B等 信号通路 从细胞膜 细胞质到细胞核均有分布 324 并且在有丝分裂期间 还定位于突触小泡 中心体和纺锤 体微管 5 国外CK1 的功能研究近年开始增多 国内有关CK1 的研究报道甚少 6 前期实验对CK1 的 mRNA和蛋白在肺癌组织中的表达作了初步的探究 发现其在肺腺癌和肺鳞癌均存在不同程度的表达减少 结果表明CK1 与肺癌相关 在此基础上 构建靶向CK1 基因的shRNA表达载体 稳定转染A549细胞 下 调CK1 在A549细胞中的表达 并探讨CK1 的表达对A549细胞生长 增殖的影响 1 材料与方法 1 1 材料与试剂 图1 pGenesil21 shRNA表达载体 1 1 1 材料 质粒pGenesil2 1 武汉晶赛 大小4 9 kb 含EGFP标 记基因 hU6启动子及多克隆位点 Sal hU6 B amH Pst Hind 图1 大肠杆菌DH5 肺腺癌细胞株A549和表达载体 pEGFP2 C1 CK1 LS和CK1 S 本室保存 1 1 2 试剂 质粒抽提及回收试剂盒 天根 内切酶 B amH Hind Sal Pst T4 DNA Ligase T4 Polynucleotide Kinase PNK Taq酶 Premix Taq Trizol TaKaRa 脂质体 Lipofectamine T M 2000 Invitrogen DMEM Gibco 胎牛血清 天津TBD G418 Genview 逆转录酶M2 MLV 百泰克 细胞裂解液R IPA中 碧云 天 BCA蛋白定量试剂盒 Pierce ECL化学发光试剂盒 羊抗人CK1 多克隆抗体 HRP2 驴抗羊二抗 兔抗人G APDH抗体 HRP2 羊抗兔二抗 Santa Cruz 碘化丙啶 PI 凯基 CCK28 Dojindo 1 2 方法 1 2 1 干扰位点及发夹结构的设计 根据GenBank提供的CK1 基因序列 设计3个特异序列 19 nt 作为 干扰位点 并在NCB I进行BLAST 排除非特异性抑制其他基因的可能 同时设计1条无义错配序列 19 nt 作为阴性对照 分别命名为CK1 2 S1 CK1 2 S2 CK1 2 S3 CK1 2 NK 将4个序列设计成具有发夹结构的shR2 NA模式 表1 寡核苷酸片段由上海生工公司合成 表1 CK1 基因的干扰位点及发夹结构的设计 NameHairpin structure BamH Sense Loop Antisense Ter mination Signal Sal Hind Target site NK 5 2GATCC GACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTT GTCGACA23 3 2G CTGAAGTATTCCGCGTACGAAGTTCTGCCGTACGCGGAATACTTCAGAAAAAA CAGCTGTTCGA25 S1 5 2GATCCG TCTCAGAAGGCCAGGCATCTTCAAGACGGATGCCTGGCCTTCTGAGATTTTTT GTCGACA23 3 2GCAGAGTCTTCCGGTCCGTAGAAGTTCTGCCTACGGACCGGAAGACTCTAAAAAA CAGCTGTTCGA25 6252643 S2 5 2GATCC GTGGCAGTGAAGCTAGAATTTCAAGACGATTCTAGCTTCACTGCCACTTTTTT GTCGACA23 3 2G CACCGTCACTTCGATCTTAAAGTTCTGCTAAGATCGAAGTGACGGTGAAAAAA CAGCTGTTCGA25 6072625 S3 5 2GATCC GTACAGAGACAACAGGACATTCAAGACGTGTCCTGTTGTCTCTGTACTTTTTT GTCGACA23 3 2G CATGTCTCTGTTGTCCTGTAAGTTCTGCACAGGACAACAGAGACATGAAAAAA CAGCTGTTCGA25 9692987 201 湖南师范大学自然科学学报 第33卷 1 2 2 pGenesil2shRNA重组质粒的构建 寡核苷酸片段的退火 退火片段的磷酸化 pGenesil21质粒的双 酶切 B amH Hind 及大片段的回收 磷酸化的退火片段与pGenesil21质粒双酶切产物的连接 连接 产物转化感受态DH5 阳性克隆的筛选及重组质粒的酶切鉴定 重组质粒的测序 将测序正确的各组重 组质粒分别命名为pGenesil2NK pGenesil2CK1 2 S1 pGenesil2CK1 2 S2 pGenesil2CK1 2 S3 1 2 3 重组质粒转染A549细胞 将A549细胞种至12孔板 汇合度80 时 用DMEM洗一遍 每孔再加 DMEM 1mL 每种质粒各取1 g 分别加至100 L的DMEM中 室温30 min 各取4 L Lipofectamine T M 2000 用100 L的DME M稀释 室温5 min 将上述两者混匀 室温放置30 min 再滴加到12孔板中 前后摇晃混匀 37 CO2培养箱培养6 h后 吸去转染复合物 用DME M洗一遍 加含10 胎牛血清的培养基继续培养42 h 1 2 4 G418筛选建立稳定转染细胞系 细胞转染48 h后 用含G418 800 g mL 的完全培养基培养15 d 后 用有限稀释法挑单克隆并扩增获得稳定株 同时将完全培养基中G418换成维持浓度 400 g mL 筛选 出的稳定细胞系分别命名为A5492NK A5492S1 A5492S2 A5492S3 1 2 5 CK1 基因转录产物的确定 考虑到CK1 基因编码区存在2个插入片段 一个84 nt为L片段 另 一个36 nt为S片段 可形成4种转录变异体 CK1 LS CK1 L CK1 S CK1 根据CK1 的基因序列设计 引物 上游5 2GGTATTGGGCGTCACTGTAA23 下游5 2GGATCCTTAGAAACCTTTCATGTTACTCTTG23 预计 产物大小 CK1 LS 672 bp CK1 L 636 bp CK1 S 588 bp CK1 552 bp 以A549细胞作为材料 RNA 由Trizol一步法提取 紫外分光光度计测定浓度和纯度 同时用CK1 LS和CK1 S的表达载体作为模板进行 对照 两者的PCR产物分别为672 bp和636 bp RT反应条件 20 L体系 总RNA 1 g 随机引物 0 2 g L 1 L RNA Inhibitor 40 U L 0 5 L dNTP 10 mM 2 L 5 buffer 4 L M2MLV 1 L 加无酶水 至20 L 42 60 min 70 10 min PCR反应条件 50 L体系 RT产物5 L 上下游引物 20 M 各1 L Premix Taq 25 L 加无酶水至50 L 预变性 94 2 min 变性 94 30 s 退火 58 30 s 延伸 72 1 min 终延伸 72 7 min 循环数 40 1 5 琼脂糖电泳 紫外灯下观察 拍照 1 2 6 RT2PCR检测干扰效率 对CK1 基因再设计一对引物 上游5 2GGTATTGGGCGTCACTGTAA23 下 游5 2GGGAGAAACAAATGCTGCTC23 扩增产物 主要为CK1 S 大小641 bp 用GAPDH作为内参 引物为 上游5 2CTGGCGCTGAGTACGTCG23 下游5 2TTGACAAAGTGGTCGTTGA23 扩增产物大小658 bp RNA由 Trizol一步法提取 并通过紫外分光光度计测定浓度和纯度 RT反应条件 20 L体系 同上 PCR反应条件 25 L体系 RT产物2 5 L 10 PCR buffer 2 5 L dNTP 10 mM 0 5 L 上下游引 物 20 M 各0 5 L Taq酶0 5 L 加无酶水至25 L 预变性 94 2 min 变性 94 30 s 退火 55 30 s 延伸 72 1 min 终延伸 72 7 min 循环数 40 1 5 琼脂糖电泳 紫外灯下观察 拍照 1 2 7 Western blotting检测干扰效率 R IPA裂解液裂解细胞后 收集蛋白 12 浓缩胶 5 分离胶进行 SDS2PAGE电泳 转移至PVDF膜上 5 脱脂奶粉TBST封闭过夜 加一抗 CK1 1 100 GAPDH 1 2 000 4 4 h TBST洗涤3次 每次10 min 分别加二抗 辣根过氧化物酶标记 室温孵育4 h TBST洗涤3次 每次 10 min ECL显色 1 2 8 A549 A5492NK及A5492S1三者生长曲线的比较 3种细胞在对数生长期时 0 25 胰酶消化 进行 细胞记数 分别接种1 0 10 4 个细胞于24孔板 每种细胞接种7孔并平行作3排 每天计数一组 重复3 次 绘制生长曲线 并计算A5492S1组的生长抑制率 细胞生长抑制率 IR 对照组细胞数目 干扰组细 胞数目 对照组细胞数目 100 1 2 9 CCK28细胞增殖实验 取对数生长期的待测细胞 分为A549 A5492NK及A5492S1组 接种于96孔 板中 2 10 3 孔 37 5 CO2培养 CCK28法检测细胞增殖 每天分别检测3个复孔 测量A450值 绘制生 长曲线 并计算A5492S1组的生长抑制率 细胞生长抑制率 IR 对照组A450值 干扰组A450值 对照组 A450值 100 1 2 10 细胞流式检测细胞周期 收集2 10 6 个对数生长期细胞 冷PBS洗涤2遍 冷70 乙醇固定 4 过夜 弃除乙醇 PBS洗涤一遍 加500 L PI 50 g mL 染液和10 L RNase A 50 g mL 避光染色30 min 上机 301第1期 邹飞雁等 靶向CK1 基因shRNA表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响 1 2 11 统计学处理 实验结果均经SPSS 17 0软件统计 两组比较采用t检验 多组比较采用方差分析 以 P 0 05表示有统计学意义 2 结果 2 1 pGenesil21质粒的酶切鉴定 pGenesil21质粒大小4 893 bp 通过BamH Pst 及Hind 单酶切可得约4 9 kb的片段 图2 2 2 重组pGenesil2shRNA质粒的酶切鉴定 重组后的pGenesil2shRNA能被Sal 切出一条约400 bp的小带 且不能被Pst 酶切 图3 M TaKaRa W ide Range DNA Marker 500212 000 Lane 1 pGenesil21 plasmid Lane 224 pGenesil21 plas mid digested byBamH Pst andHind 图2 pGenesil21 shRNA表达载体酶切鉴定图 M TaKaRaW ide RangeDNAMarker 500212 000 Lane 12 2 pGenesil2NK plasmid digested bySal andPst Lane 324 pGenesil2CK1 2 S1 plas mid digested bySal andPst Lane 526 pGenesil2CK1 2 S2 plas mid digested bySal andPst Lane 728 pGenesil2CK1 2 S3 plas mid digested bySal andPst 图3 重组pGenesil2shRNA酶切鉴定图 2 3 重组pGenesil2shRNA质粒测序 重组质粒的测序结果与设计序列经BLAST比对分析 均为插入正确的重组质粒 图4 A pGenesil2NK B pGenesil2CK1 2 S1 C pGenesil2CK1 2 S2 D pGenesil2CK1 2 S3 图4 重组pGenesil2shRNA测序图 401 湖南师范大学自然科学学报 第33卷 2 4 倒置荧光显微镜观察的结果 在倒置荧光显微镜的可见光和紫外光下对A549 A5492NK A5492S1 A5492S2 A5492S3进行观察 稳定 转染的细胞系几乎所有细胞都均匀表达GFP 而未转染的A549细胞则未见GFP表达 图5 A B D F H Lane 1 PCR product usingpEGFP2C12CK1 S as template Lane 2 RT2 PCR products using A549 mRNA as template Lane 3 PCR product using pEGFP2C12CK1 LS as template 图6 CK1 mRNA表达产物的鉴定 2 5 CK1 基因转录产物的确定 根据电泳图 以pEGFP2C12CK1 S和pEGFP2C12CK1 LS 为模板的PCR产物是588 bp和672 bp的单一产物 而以 A549细胞mRNA为模板的RT2PCR产物则主要为588 bp的 CK1 S 且依稀可见672 bp的CK1 LS也有微弱表达 图6 2 6 RT2PCR检测结果 QuantityOne软件分析CK1 mRNA的表达水平 与阴性 对照 组A5492NK相 比 CK1 mRNA在A5492S1中 下 降 8413 在A5492S2中下降57 9 在A5492S3中下降61 8 图7 有显著性差异 P 0 001 2 7 W estern blotting检测结果 QuantityOne软件分析CK1 蛋白的表达水平 与阴性对 照组A5492NK相比 CK1 蛋白表达量在A5492S1中下降 7814 在A5492S2中下降51 3 在A5492S3中下降59 9 图8 有显著性差异 P 0 001 Lane 1 A5492NK Lane 2 A5492S1 Lane 3 A5492S2 Lane 4 A5492S3 图7 RT2PCR检测CK1 mRNA表达 Lane 1 A5492NK Lane 2 A5492S1 Lane 3 A5492S2 Lane 4 A5492S3 图8 Western blotting检测CK1 mRNA表达 2 8 A549 A5492NK及A5492S1三者生长曲线的比较 通过每天对A549 A5492NK及A5492S1进行细胞计数发现 与A549和A5492NK相比 A5492S1的生长 速度明显受到抑制 抑制率 37 7 2 2 P 0 01 图9 2 9 CCK28细胞增殖实验 以细胞在不同时间的A450值绘制细胞增殖曲线 结果与细胞计数实验基本吻合 相比A549和A5492NK A5492S1的增殖受到抑制 抑制率 26 2 1 5 P 0 05 图10 2 10 细胞周期分布检测 细胞流式结果显示A5492S1的细胞周期明显改变 与A549和A5492NK相比 A5492S1的S期和G2 M 期明显减少 S 期减少 75 0 4 0 G2 M期减少 45 2 5 4 表2 细胞主要集中在有丝分裂完成 501第1期 邹飞雁等 靶向CK1 基因shRNA表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响 到DNA复制之间的G0 G1期 图11 细胞增殖受到抑制 图9 A549 A5492NK和A5492S1的生长曲线 图10 A549 A5492NK和A5492S1的细胞增殖实验 A A549 B A5492NK C A5492S1 图11 细胞周期测定结果 表2 细胞周期测定结果 Group Cell cycle distribution G0 G1SG2 M A54934 3563 242 41 A5492NK45 6150 873 52 A5492S168 02a31 24b0 74a aP 0 05 bP 0 01 vsA549 and A5492NK 3 讨论 作者成功构建了CK1 基因shRNA表达载体pGenesil2shRNA 并筛选出稳定转染细胞系 在此基础上 用细胞计数法和CCK28法绘制了A549 A5492NK和A5492S1的生长增殖曲线 并用流式细胞术检测其细胞 周期 实验结果表明 A5492S1细胞增殖速度比阴性对照组慢 S期及G2 M期细胞比例减少 降低CK1 基 因在A549细胞中的表达能够抑制其生长 NicolasBid re等发现CK1 基因的沉默能抑制原代人T淋巴细胞 增殖 对ABC DLBCL 淋巴瘤细胞 更是具有致死性 7 本研究结果与Nicolas Bid re等的研究结果一致 但 与作者前期在肺癌患者新鲜和组织蜡块标本中取得的实验结果相矛盾 CK1 作为一种激酶 就目前的研究进展来看 其在肿瘤中的作用还存在较大的分歧 在Wnt 2 Catenin 和Hedgehog信号通路中 CK1 充当负调控因子 它可以将 2Catenin Wnt 2 Catenin信号通路的枢纽分子 和Gli 1 2 3 Hedgehog信号通路的枢纽分子 磷酸化并促使 2Catenin和Gli 1 2的降解 而使Gli 3转变成 转录抑制子Gli 3R 从而抑制Wnt 2 Catenin和Hedgehog信号通路的激活 8210 因此 CK1 被认为是一个候 选抑癌基因 11 601 湖南师范大学自然科学学报 第33卷 Medrek C等发现CK1 对 2Catenin的磷酸化与 2catenin E2cadherin复合体的增加有关 且并不导致 2 Catenin的降解 12 而NicolasBid re等则发现CK1 能促使CARMA1降解 而抑制NF 2 B信号通路 但在 NF 2 B信号通路异常激活的淋巴瘤细胞ABC DLBCL中 CK1 是重要的正调控因子 CK1 激活NF 2 B信号 通路对ABC DLBCL的生存是必要的 因而CK1 是一种条件性的恶性基因 7 Wang Y等发现 CK1 能与 R IP1相互作用并将其磷酸化 这是R IP1获得活性所必需的 所以CK1 是TNF2 诱导的NF 2 B信号通路的 正调控因子 13 HuartAS等发现对 CK1 实施RNAi或使用激酶抑制剂D4476可激活P53 同时使转录因子 E2F21不稳定 因而CK1 是 p53的负调控因子和E2F21的正调控因子 14 Lihong Chen等发现 CK1 可与 MDMX结合并在Ser289将其磷酸化而调节MDMX 可使MDMX抑制p53的能力增加4倍 15 这些研究不支 持CK1 作为抑癌基因的功能 由于CK1 作为一种激酶 参与众多生理反应 底物来源相当广泛 作用机制较复杂 推测CK1 的沉默 对A549细胞的生长抑制可能是众多调控机制的综合结果 其在信号通路中矛盾的双重功能使其成为一个 极其复杂的靶位点 致谢 感谢暨南大学再生医学教育部重点实验室的沈晓涛老师和暨南大学生殖免疫研究所的陈敬同学 对本研究的支持和帮助 参考文献 1 ROWLES J SLAUGHTER C MOOMAW C et al Purification of casein kinase 1 and isolation of cDNAs encodingmultiple ca2 sein kinase I2like enzymes J Biochemistry 1991 88 9 54829 552 2 BENNETT G S LASKOWSKA D D I LULLO C Lithium inhibits the phosphorylation of newly synthesized neurofilament pro2 tein NF2M in cultured chick sensory neurons J J Neurochem 1991 57 1202129 3 KN IPPSCH I LD U WOLFF S GI AMAS G et al The role of the casein kinase 1 CK1 family in different signaling pathways linked to cancer development J Onkologie 2005 28 5082514 4 KN IPPSCH I LD U GOCHTA WOLFF S et al The casein kinase 1 family participation in multiple cellular processes in eu2 karyotes J Cellular Signalling 2005 17 6752689 5 DUBO IS T HOWELL S ZEML ICKOVA E et al Identification of casein kinase 1 interacting protein partners J FEBS 2002 517 1672171 6 邹飞雁 谢海龙 余艳辉 等 肺癌候选抑瘤基因HLCDG1片段的验证及全长序列的克隆 J 中国病理生理杂志 2009 25 6 1 08121 088 7 B I D RE N VU N NGO LEE J et al Casein kinase 1a governs antigen2receptor2induced NF 2 B activation and human lym2 phoma cell survival J Natu