（有机化学专业论文）环四聚磷腈多齿配体的合成及dna切割活性的研究.pdf

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a c t a r t i f i c i a ln u c l e a s e sh a v er e c e n t l yr e c e i v e dc o n s i d e r a b l ei n t e r e s tf o rt h e i r p o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nm o l e c u l a rb i o l o g i c a lt e c h n o l o g ya n dd r u gd e v e l o p m e n t a t t h es a m et i m ei ti sa ni m p o r t a n tt o o li nt h ef i e l d so fm o l e c u l a rb i o l o g ya n dg e n e t i c e n g i n e e r i n g a r t i f i c i a ln u c l e a s ei su s e da sa k i n do f n u c l e i ca c i ds t r u c t u r ea n df u n c t i o n p r o b e h e n c e f i n d i n go u th i g h l ye f f i c i e n ta r t i f i c i a ln u c l e a s er e a g e n ti sv e r yi m p o r t a n t e s p e c i a l l yc l e a v a g er e a g e n ti nas e q u e n c e s p e c i f i cw a y i nt h el a s ts e v e r a ly e a r s m a n yc o m p l e x e sh a v eb e e nd e v e l o p e da sa r t i f i c i a l e n z y m e a m o n gt h e s es y s t e m s m u l t i n u c l e a rc o m p l e x e sa r ep a r t i c u l a ra t t r a c t i v ed u e t ot h e i rp o t e n t i a lc o o p e r a t i v ee f f e c t sb e t w e e nt h em e t a lc e n t e r s h e r e i n i nt h i sd i s s e r t a t i o n s e r i e so fc y c l o t e t r a p h o s p h a z e n ep o l y d e n t a t el i g a n d s w e r e d e s i g n e d a n d s y n t h e s i z e dc o n t a i n i n g d i f f e r e n t h e t e r o c y c l i c m o r p h o i n e i m i d a z o l e t h e s et a r g e tc o m p o u n d sw e r ec h a r a c t e r i z e db y1 hn m r 3 1 p n m r 1 3 cn m r i ra n de s i m s t h ei n t e t a c t i o no fp l a s m i dp u c19d n aa n dc t d n aw i t hl i g a n d si nt h ep r e s e n c e o fc u i i z n i i c o i i c o m p l e x e sr e s p e c t i v e l yw a sm o n i t o r e db ya g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i sa n du v v i s i b l e t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a t o c t a n u c l e a rw a s i n d i c a t e ds u p e r i o rr e a c t i v i t yc o m p a r i n gt ot h eh e x a n u c l e a r t h e i rc l e a v a g ea n d m e c h a n i s mi sf r e er a d i c a lo x i d a t i o no fc u t t i n g t h e ya r es i x a n de i g h t c o o r d i n a t e d l i g a n ds e p a r a t e l y a n dt h es i xl i g a n d si nt h es t u d y t h ee i g h t c o o r d i n a t i o no ft h ez n c o m p l e xs p e c t r a lc h a n g e so ft h eg r e a t e s ti n t e r a c t i o nw i t hc t d n a a l s ot h es t r o n g e s t a n dt h ei n f e n e dm o d eo fa c t i o nm a yb ep a r to f t h ei n t e r c a l a t i v ec t d n ao f b a s ep a i r s k e y w o r d s c y c l o t e t r a p h o s p h a z e n ep o l y d e n t a t el i g a n d s o x i d a t i v ec l e a v a g e f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r yu vt i t r a t i o n i i 目录 目录 摘要 i a b s t r a c t i i 目录 i i i 第一章前言 l 1 1 研究背景 1 1 2 研究意义 2 1 3 人工核酸酶的研究与切割系统 2 1 4 人工化学核酸酶切割d n a 的作用机理 4 1 4 1 水解切割机理 4 1 4 2 氧化切割机理 5 1 5 不同机理下的切割试剂 8 1 5 1 水解切割试剂 8 1 5 2 自由基氧化切割试剂 1 0 1 5 3 消去机理切割试剂 1 0 1 6 光谱法研究配合物与核酸的相互作用 1 l 1 7 本硕士论文的提出背景及研究内容 1 1 第二章八氯环四聚磷腈的合成与条件优化 13 2 1 引言 1 3 2 23 1 p n m r 跟踪坏磷腈反应的研究 1 4 2 2 1 实验仪器 1 4 2 2 2 实验药品 一1 4 2 2 3 测定条件 1 5 2 2 4 实验步骤 15 2 2 5 实验结果与讨论 1 6 2 3 本章小结 21 第三章配体的合成和表征 2 2 i i i 3 1 实验合成部分 3 1 1 合成所用仪器 3 1 2 合成所用药品 3 1 3 八对甲酰基苯氧基环四磷 3 1 4 八对羟甲基苯氧基环四磷 3 1 5 八对溴甲基苯氧基环四磷 3 1 6 八对咪唑基苯氧基环四磷 3 1 7 八对吗啡啉基苯氧基环四磷腈5 b 的合成 2 6 3 1 8 六对吗啡啉基苯氧基环三磷腈6 b 的合成 2 7 3 2 结果与讨论 2 7 3 2 1 八对甲酰基苯氧基环四磷腈的合成讨论 2 7 3 2 2 八对羟甲基苯氧基环四聚磷腈的合成讨论 2 8 3 2 3 八对溴甲基苯氧基环四聚磷腈的合成讨论 2 8 3 2 4 目标化合物的合成讨论 2 9 3 3 目标化合物的波谱分析 2 9 3 3 1 目标化合物的红外光谱学特征 2 9 3 3 21 hn m r 图谱分析 3 0 3 3 3 cn m r 图谱分析 3 0 3 3 4 引pn m r 图谱分析 3 0 3 3 5 目标化合物质谱裂解分析 3 0 3 4 本章小结 31 第四章金属配合物对d n a 切割活性的研究 3 2 4 1 引言 3 2 4 2 凝胶电泳法研究金属配合物对d n a 的切割活性 3 2 4 2 1d n a 氧化切割凝胶电泳原理 3 2 4 2 2 实验部分 3 3 4 3 配合物与小牛胸腺d n a 的相互作用 4 0 4 3 1 仪器与药品 4 0 4 3 2 紫外滴定法 4 l 4 3 3 紫外一可见光谱 4 3 4 3 45 b 2 0 的荧光光谱 4 9 一 一 4 4 本章小结 结论 参考文献 硕士期间发表论文 个人简历 致谢 附录 一 第一章前言 第一章前言弟一早刖百 1 1 研究背景 核酸是有机生命体最主要的组成部分之一 是遗传信息的携带者和传递 着 同时 核酸结构的变化和生命异常情况密切相关 如 肿瘤的发生 遗 传性疾病 放射损伤等n 1 因此 核酸的研究已成为现代分子生物学和化学 生物学的重要课题之一 核酸分为两大类 脱氧核糖核酸 d n a 和核糖核酸 r n a 二十世纪 4 0 年代 a v e t y 等发现d n a 是遗传物质的基础 5 0 年代w a t s o n 和c r i c k 提 出关于d n a 双螺旋模板学说 并在n a m r e 上发表了文章说明 6 0 年代 k h o r a n a 等首次破译了遗传密码 7 0 年代初 d n a 限制性内切酶的发现和基 因工程技术的建立 促进核酸研究的飞速发展 2 近几十年来因从事这方面 的研究并获得诺贝尔奖的科学家就有几十人之多 1 9 7 8 年a r b e ra n ds m i t h 发现细菌限制性内切酶以及限制性内切酶的作用方式 分别获得诺贝尔奖 w a t s o n 和c r i c k 提出d n a 双螺旋模板学说 为现代分子生物学奠定了基础 被誉为2 0 世纪自然科学发展历程中最伟大的成就之一 3 在w a t s o n c r i c k 的d n a 双螺旋模型的推动下 核酸的研究走向全面和纵深发展的道路 d n a 体外重组技术的建立 推动了分子生物学在广度和深度两个方面飞速发展 而且核酸的断裂和基因重组技术是分子生物学的核心技术 其中的重点是对 d n a r n a 的定位断裂 d n a 核苷酸序列分析 基因片段的体外切割重组 等 都要用到限制性内切酶 虽然限制性内切酶在特定位点切割d n a 分子 但其识别位点仅为4 8 个核苷酸 并且只能在数目有限的位点断裂d n a 这就给飞速发展的基因工程技术带来一定的限制 另外 这类生化试剂制备 困难 价格昂贵 而且无论从品种上及数量上都不能满足要求 因此 探索 金属配合物作为人工限制性内切酶成为当前生物有机化学十分活跃的前沿 研究领域之一 4 j 2 0 0 3 年第一届亚洲生物无机化学会议将生物大分子的切割 作为专题讨论 从分子水平更深入的研究d n a 和r n a 的切割反应变成了现 实 构建人工酶体系 从生物模拟到合成金属配位 酸碱催化 亲核进攻水 解激发核酸磷酸二酯键体系等已经成为人们关注的焦点 5 因此 致力于研 第一章前言 究具有高效及高选择性的人工酶长期以来一直是科学家的工作重点 1 2 研究意义 研究人工核酸切割试剂 切割机理能够更好的促进核酸酶的开发研究 6 首先 对切割机理的研究能帮助了解核酸酶催化机理 从分子水平认识化 学反应 对金属离子催化核酸机理的研究 有助于人们理解会属离子参与核酸 酶催化核酸时所起的作用 7 1 其次 定点切割试剂可用于基因治疗 在疾病预防中有着十分重要的价值 能专一性的把有害蛋白的信使r n a 失活或者解体 使害蛋白的合成得到抑制 以达到治疗疾病的目的瞄j 再次 核酸切割试剂可作为重要的分子生物学工具 有选择性地水解切断 磷酸二酯键是基因工程的重要研究方向 具有巨大的应用前景和经济效益 但 是天然的核酸限制性内切酶所能识别的碱基序列非常短 只有4 6 或8 个碱基对 在较长的核酸链中 这样短的识别序列出现的频率会很高 所以当其被限制性 内切酶切断时 产生的碎片较多 并且被破坏很难被利用 而定点切割试剂可 识别的序列要大于8 个碱基对 因而其专一性比限制性内切酶要好 所产生的切 割碎片也少 可被进一步利用 9 1 此外 生物金属聚合物的分子量很大 使其很难得到金属配位微环境高分 辨率的结构信息 其他的性质也由于分子的复杂性而难以测定 所以人工设计 合成模型配合物 尽可能重现生物聚合物的物理和化学性质具有非常重要的意 义 10 1 1 3 人工核酸酶的研究与切割系统 化学合成的d n a r n a 定点切割试剂是8 0 年代初发展起来的一类新型的非 酶切割工具 又被称为人工核酸酶 a r t i f i c i a ln u c l e a s e s 所谓核酸切割 就是 通过化学反应将长链的核酸分子断裂成较短的碎片 核酸定点切割试剂是 a r t i f i c i a ln u c l e a s e s 的核心 与限制性内切酶相比 它即能使核酸底物在某个特定 位置发生断裂 又能在预先设计的任何位点对d n a r n a 进行专一性切割 化学核酸酶可表示为r s 一般由核酸识别结合系统r r e c o g n i z e 和化学断 裂系统s s p l i t 两部分组成 1 2 识别结合系统r 可以是天然存在或人工合成的具有 第一章前言 特定结构与识别功能的寡聚核苷酸 蛋白质 多肽及d n a 结合药物等 r 与核酸 分子上的特定碱基序列 r n a 或d n a 的二级结构的特定区域结合 并通过非共 价键 形成超分子体系 化学断裂系统s 通常是一个小分子的会属络合物 如 e d t a f e i i t 1 3 1 4 l 1 0 o p 邻菲咯啉 c u i 1 5 16 1 金属卟啉 1 7 1 等 其主要作用是 通过一定的方式实现对核酸链的断裂 近几年来研究工作主要集中在以氧化还 原作用方式断裂d n a 或r n a 上 基因工程涉及到对d n a 序列进行切割 修饰和联接等复杂的过程 d n a 的定位断裂是过程中的关键 在生理条件下 d n a 中的磷酸二醋键非常稳定 不易被水解 我们推测在p h7 0 和3 7 时的半衰期很长 这样长的半衰期对 d n a 作为遗传信息的载体是非常有益的 但对于基因工程中最重要的d n a 断 裂技术却是一个挑战 它要求催化剂必须在数分钟内提供高达1 0 1 7 数量级的反 应加速度来促成磷酸二醋的水解断裂 l8 1 这一过程中最常用的断裂手段是天然 限制性内切酶 天然限制性内切酶是基因工程中的 分子剪刀 如图1 1 所示 的是酶的切割过程 目前现分离提纯到的有3 0 0 0 多种 识别的碱基序列有2 5 0 多种 但这还远远不能满足基因技术的需求 连 接 链 d n a 分子链 图1 1 化学核酸酶的识别与切割术的需求 大分子的偶联体具有定点切割的特性 可以作为重要的分子生物工具 弥 补上述天然核酸酶的缺陷 这也是研究人工化学核酸酶的终极目标 目前人们 对人工化学核酸酶的主要研究成果还是针对上述的前两方面 而对于后一方面 第一章前言 基i n r 程的研究成果相对较岁19 1 1 4 人工化学核酸酶切割d n a 的作用机理 由于d n a 本身的特殊性 其反应在实验室难于模拟 d n a 的稳定性可能 源于带负电荷的磷酸二酯骨架和潜在亲核试剂间的排斥力 所以磷酸二酯键被 分子断裂的文献主要集中在d n a 的氧化断裂或者活性底物的水解 人工化学核 酸酶按照切割d n a 的作用机理大体分为水解切割机理 氧化切割机理和消除切 割机理 2 们 下面就这三种机理分别作一下介绍 1 4 1 水解切割机理 水解机理断裂d n a 的试剂分子要与d n a 链结合并相互作用 一般是金属 离子直接或间接与磷酸骨架上的氧原子配位 进攻磷酸二酯键而引起水解反应 并导致链断裂 但并不破坏戊糖环 断裂产物可被重新连接 其机理与天然核 酸酶基本相同 但是 在生理条件及非酶条件下 磷酸二酯键的半衰期很长 因此该方式没有外界的辅助因子 往往需要较长的反应时间 d n a 的水解断裂过程可简化为两步机理 如图2 所示 首先 是可逆性的 一步 形成的氢氧根离子进攻磷原子 形成一个五配位中间物 其次 p o 键发 生断裂 带有羟基的脱氧核苷酸离去 形成产物 2 图1 2d n a 水解机理裂解示意图 另外 大环多胺是很好的金属配体之一 以大环多胺为配体的双核人工核 酸切割试剂受到科学家的重视 南京大学陆国元课题小组 2 2 1 研究以大环多胺为 配体的双核配合物 及其对p u c l 9 质粒d n a 的切割作用 其切割机理如图1 3 u c o 第一章前言 所示 c n u d e o p h n i ca t t a c b 图1 3 双金属大环多胺水解机理 1 4 2 氧化切割机理 氧化切割主要是人工化学核酸酶通过进攻核酸的糖环或碱基 进行夺氢氧 化 而引起核酸链的断裂 这种断裂虽是破坏性的 会导致遗传信息的丢失 但反应时间短 切割准确率高 对于核酸链上的糖环一磷酸骨架和杂环碱基有 很好的切割选择性 2 3 1 4 2 1 糖环 磷酸骨架的氧化 从机理上说是 从d n a 脱氧核糖上夺去氢原子 产生的碳正自由基重组 使核酸链断裂 如图1 4 所示 在d n a 链的脱氧核糖上五个部位共有七个氢原 子可以被氧化剂或自由基夺去 h 0h i h 2 h 未h 和h 乡h 5 2 4 寡聚核苷酸的x 射线晶体数据表明 h i 和h 4 位于d n a 的小沟内 比较 不易接触溶剂 与小沟插入分子反应 夺去氢原子 在小沟内生成具有氧化活 性的组分 h i h 2 和h 二深埋在大沟中 h 原子反应活性较低 较不易发生反应 第一章前言 h 5 h 5 位置上的一个氢原子伸向小沟内 另一个远离d n a 骨架伸向溶剂内 非 常容易受到攻击 2 5 总得来说 d n a 中处于小沟内的h 二和h 一5 h s 氢原子是最 易被进攻的 不同的氧化切割试剂 特别是那些能与核酸键合的分子 引发d n a 链断裂的机理和途径不同 夺取的h 原子也不同 图1 4 脱氧核糖上的七个氢原子的位置 1 4 2 2 杂环碱基氧化 d n a 双链含有四种碱基鸟嘌呤 g 腺嘌呤 a 胞嘧啶 c 和胸腺嘧啶 t 如图1 5 所示 嘌呤和嘧啶杂环是富电子的 常受到亲电试剂如烷化剂 卤 素等的攻击 2 6 1 图1 5d n a 双链碱基的位置 在核酸的四个碱基中鸟嘌呤g 的单电子氧化还原电势是最低的 且最易被 氧化 所以大多数氧化剂选择g 为进攻目标 在导致核酸碱基断裂的多种氧化 剂中我们最为关心的是金属及其配合物 不同金属离子引发核酸碱基损伤的机 理和模式也不同 铬 v i 盐在h 2 0 2 的参与下生产羟基自由基进攻鸟嘌呤 g 氧 化生成8 o x o g 锰 i i i s a l c n s 和锰 i i i 卟啉配合物在氧化剂作用下生成高价锰 氧物种m n o 进攻核酸碱基 c o n h 3 6 3 配合物产生单线态氧活性物种氧化 鸟嘌呤 镍大环配合物n i c r 与暴露在鸟嘌呤上n 7 配位氧化损伤d n a 这一配 第一章前言 合物也可用作探针来研究d n a 结构 2 由碱基氧化损伤进而引起d n a 断裂的 方式和途径有多种多样 不同的金属及其配合物有不同的碱基和序列选择性 如锰和饿盐的胸腺嘧啶选择性 金属镍配合物的鸟嘌呤特异性f 2 8 1 另外 同一 种金属 配体不同时 氧化电位也会改变 从而改变其碱基选择性 引起d n a 不同部位断裂 许多金属配合物作为化学核酸酶仅仅研究它们对质粒的断裂能力和d n a 链 剪切模式 并没有就它们对核酸碱基的氧化损伤作用进行研究 这是由于研究 的配合物不同 研究的侧重点也不同 事实上许多切割试剂在氧化切割d n a 过 程中氧化糖环和氧化碱基两种作用模式都在发挥作用 2 9 1 1 4 2 3 自由基氧化机理 主要是切割试剂产生的自由基进攻核酸的糖环或者是碱基 夺去氢原子使 其氧化破坏 从而使核酸链发生断裂的过程 目前研究的切割双链d n a 的两种机理 3 0 可概括如下 一种说法为 1 抗坏血酸还原铜配合物 c u i i r e d c u i 2 通过还原的铜配合物的芳香环或氢键在d n a 外部与其相连 c u i a d n c u i 一a n d 3 c u i 配合物与h 2 0 2 发生反应得到 o h f e n t o nr e a c t i o n c u i h 2 0 2 c u i i 0 h 0 h 4 游离的 o h 尽力靠近d n a 与它发生应 o h d n a d n ac l e a v a g e 5 c u i 配合物与内部的0 2 发生反应得到超氧化物阴离子 c u i 0 2 c u i i 0 2 6 超氧化物阴离子的不均匀性 2 0 2 2 h h 2 0 2 0 2 另一种说法为 c u i 与h 2 0 2 发生反应直接产生铜 氧类化合物 d n a 7 c u i h 2 0 2 c o p p e r o x os p e c i e s 8 c o p p e r o x os p e c i e s d n a d n ac l e a v a g e 氧化型人工化学核酸酶在机理方面还存在许多有分歧的地方 3 l 直接切割 需要更深 单核配合物 单核配合物是一个金属离子与配体相结合 结构简单 易于研究 比较有突出贡献的是杨频课题组 致力于磷酸二酯键水解断裂的配位化学 模拟 陆续发现一些具有水解d n a 或磷酸二酯键模型化合物的体系 3 3 1 如图 1 6 所示 双核配合物 鉴于天然核酸酶分子的活性中心多为双核金属或三核金属 通常是m g i i c o 及一些过渡金属离子 的配位结构 人们对双核金属配合物模拟酶水解切 割核酸格外关注 k r a m e r 等 报道了双咪唑配体的双核z n i i 配合物 图1 7 所示 对r n a 的 催化水解 在6 5 的乙醇 水体系中 配合物催化r n a 水解活性大大增加 第一章前肓 a h 图1 6 组氨酸与c u 2 形成的配合物 h b 图1 7 双咪唑配体 据估计 双核静电效应可使水分子质子解离作用的p k a 值至少下降3 4 单 位 这些特征使双核金属酶适合于促进某些特殊反应的进行 另外 双金属中 心协作能促进以下过程进行 1 底物的活化 2 水分子的电离 3 过渡态的稳 定化 4 底物的识别与选择 三核及多核配合物 k o m i y a m a n 3 6 比较了三角架配体 图1 7 所示 的单核 双核 三核的z n i i 配合物 z n 为现场加入 对二聚核苷酸的水解作用 发现他们对各种磷酸二酯键 的水解速率依次显著增大 如腺苷二倍体在化合物1 存在下 2 4h 后观察不到反 应的发生 而用化合物2 3 水解后的半寿命分别为1 5 0 0 0 s 1 4 0 0 s 化合物1 化合物2 第一章前言 化合物3 图1 8k o m i y a m a 等合成的三角架配体 1 5 2 自由基氧化切割试剂 自由基氧化切割过程产生的自由基体积很小并且易于扩散 这类切割试剂 常用作性能良好的足迹试剂 37 此类切割试剂主要包括过渡金属配合物和一些 抗生素类药物 此类的金属配合物主要有铜配合物 铁配合物 钴配合物 锌 配合物等 3 引 目前此类试剂还有 1 f e i i e d t a h 2 0 2 体系 e d t a 与f e i i 形成配合物 使h 2 0 2 还原生成 o h 自由基 作用于d n a 的糖环 引起d n a 链断裂 2 f e 1 i p e n t a d e n t a t e h 2 0 2 体系 在h 2 0 2 存在下能氧化切断d n a 3 三核铬配合 物体系 在h 2 0 2 存在下 能通过产生的自由基切断d n a 4 还有铜配合物体系 例如 c u e t i 2 2 体系 c u i i 胆红素体系 大环铜配合物 h 2 0 2 体系 该类切割 体系也主要是通过铜与h 2 0 2 的作用产生一些 o h 自由基 进而破坏磷酸的戊糖环 或碱基 从而引起d n a 链的断裂 3 引 此外 许多具有抗肿瘤功能的抗生素在一定条件下也能够断裂双链d n a 并具有一定的区域选择性 如博莱霉素可以切割i a 以及d n a r n a 杂交分子 1 5 3 消去机理切割试剂 以消除机理进行切割的切割试剂的例子很少 不具有普遍性 最早研究的 是在1 9 8 1 年 h e l e n e 和l a v a l 的实验室同时分别发现了l 赖氨酰 l 色氨酰 l 赖氨酸三肽 k w k 3 9 这是目前最著名的消去试剂 它的应用价值小 所以 就不作详述 第一章前言 1 6 光谱法研究配合物与核酸的相互作用 小分子与d n a 作用主要有三种模式 插入模式 外部结合在d n a 沟槽以 及沿d n a 螺旋表面的静电自堆积 4 0 1 1 插入模式是化合物与d n a 相互作用 最重要的模式之一 最直接的方式是直接插入到d n a 的双螺旋结构的g c 富集 区 并同d n a 中碱基对发生瓢 s t a c k i n g 相互作用 小分子配合物被作为很好 的探针 2 外部结合在沟槽是结合于d n a 分子的浅凹槽处 没有破坏d n a 结构 仅引起d n a 分子构型发生变化 使它同d n a 分子间的范德华力增大 3 沿d n a 螺旋表面的自堆积是通过自身所带正电荷与d n a 分子内的磷酸二 酯结构间的静电作用 4 1 1 对于一些金属配合物大分子来说 自身的特点决定了它以静电模式或部分 嵌插的形式与d n a 相互作用 当分子以嵌入方式结合于小牛胸腺d n a 双螺旋碱基对之间时 其吸收光谱 表现出减色效应 当分子以静电方式结合于小牛胸腺d n a 时 其吸收光谱表现 出增色效应 从而可通过吸收光谱判断金属配合物与d n a 的作用模式 例如紫 外光谱法就是一种比较方便和常用的研究物质与d n a 相互作用的技术 d n a 分子中的碱基具有光活性 在2 6 0n m 附近有吸收 许多能与d n a 相互作用的物 质分子具有光活性或与d n a 结合后具有光活性 因此可以通过紫外光谱方法来 研究d n a 与切割试剂相互作用后是否导致其吸收谱带变化 吸收峰红移及减色 效应来研究结合机理 4 2 1 1 7 本硕士论文的提出背景及研究内容 纵观吗啡啉络合物的研究现状 虽然合成了不少金属离子与吗啡啉的配合 物 但研究其生物活性的很岁4 3 1 四聚磷腈是以p n 双键交替排列形成的八元环 结构稳定 磷原子与两 个氯原子相连 氯原子具有较高的反应活性 可以与不同的亲核试剂发生反应 形成结构发散的树枝状化合物 在其末端连上相应的含氮杂环配位基团可形成 多齿配体 且引入后增强了环的稳定性 与金属离子配位可以形成人工金属酶 切割试剂 分析研究文献m 可以看出 人工金属酶已经被成功的用做核酸的印迹试剂 序列特异性的靶分子等 许多工作集中在氧化降解d n a 上 因为更容易借助外 第一章前言 界条件研究切割机理 另外 考虑到天然酶中活性中心的结构特点 选择铜 锌作为配合物中心 因为这些金属离子在人体内大量存在 且是酶的活性中心 和辅助因子 我们的工作从选题 开题 到实验的深入进行 一直本着这样的目的进行 本论文主要工作 一 合成母体 合成四聚磷腈 并通过磷谱跟踪找到了最佳催化剂 优化了实验条件 并 通过本实验室的经典反应合成了大批量的三聚磷腈 二 设计合成配体 1 设计合成了化合物 并通过i r 1 hn m r cn m r 孔p n m r e s i m s 等检测手段对目标化合物进行了结构确证和表征 三 配合物与d n a 的作用研究 1 利用琼脂糖凝胶电泳对比研究了两种配体和金属离子作用后对质粒 p u c l 9 的切割活性 2 利用紫外吸收光谱 荧光光谱等研究了配合物与小牛胸腺d n a c t d n a 的相互作用 3 利用紫外滴定法研究金属离子与配体的配位 第二章八氯环四聚磷腈的合成与条件优化 第二章八氯环四聚磷腈的合成与条件优化 2 1 引言 聚磷腈是一类以p n 双键交替排列为主链的线型或环状的聚合物 其性质 介于无机化合物 有机化合物和高分子化合物之问 被称为 无机橡胶 4 5 1 在 聚磷腈分子中 由于磷原子上含有可取代的氯原子 故可以生成多种衍生物 2 0 世纪中期 聚磷腈的研究取得了突破性进展 a l l c o k 和k u g e l 制得了可溶于 有机溶剂的非交联聚二氯磷腈 并用亲核试剂取代p 原子上的c l 原子生成稳定 的有机磷腈 而且通过实验证明了聚磷腈衍生物的结构具有多样性 由此他们 产生的特殊性能才引起人们的重视 聚磷腈分子根据结构可分为环状聚磷腈和线状聚磷腈两大类 发展最早的 是线状磷腈 而环状聚磷腈 环磷腈 发展最迅速 以环三磷腈 简称环三聚体 和环四磷腈 简称环四聚体 为主 早在1 8 3 4 年 没有制得环二氯磷腈之前 第一个制得的环磷腈化合物就是 六氯环三磷腈 一直被认为是聚磷腈中最小的环状物 八氯环四磷腈 n p c i 2 4 只是制备六氯环三磷腈的副产物之一 从未引起人们的关注 六氯环三磷腈是氮 磷交替的六元环结构 其结构式如图2 1 所示 它几乎为 一个平面环 环平面内的p n 键之间存在着d p 共轭效应 所以具有芳香性 磷上的氯不在氮磷所构成的平面上 类似于苯 一些性质也与苯相似 俗称 无 机苯 矧 而八氯环四磷腈 n p c i 2 4 的分子结构却截然不同 其结构式如图2 1 所示 氮 和磷所构成的八元环不在同一平面内 其结构有以亚稳的k 形式 船型构型 也 有稳定t 形式 椅式构型 存在 不具有芳香性 常温时也微溶于石油醚 苯等 4 7 两者的性质有很多相似之处 对水敏感 不能在潮湿空气中存在 聚合物 上的氯原子极易被烷氧基 芳氧基 胺类和有机金属等亲核试剂所取代 4 引 常 温下 环状结构稳定 高温下可进行开环聚合反应 生成环二磷腈 环三磷腈 等 他们性质的不同之处在于 六氯环三磷腈能溶于9 8 的浓硫酸 而八氯环四 磷腈不溶 鉴于此 可分离两者 第二章八氯环四聚磷腈的合成与条件优化 c l c ic i 斜 p c l 环三磷腈环四磷腈 图2 1 聚磷腈的结构式 斗n 一 卜 c l 聚磷腈 参考环三磷腈的合成1 4 纠 一般情况下 反应产物中大约含7 0 的环氯磷腈 其余为线型磷腈 在以p c i 5 幂t l n h 4 c 1 为原料合成环三聚体时 常伴有环四聚体 即 八氯环四聚磷腈 产生 此外尚有少量更大的环状氯化磷腈和低聚的线状氯化磷 腈 反应所得的混合物经石油醚或正庚烷处理 可以除去大环氯化磷腈和低聚 线状氯化磷腈 而得到由环三聚体和环四聚体组成的环状氯化磷腈混合物 5 0 1 这一领域发展至今 仍存在着合成方法繁杂 分离耗时且产率低等缺陷 寻求收率高 操作简便的合成方法以及高效的分离方法仍是该领域研究的热点 在研究反应条件对聚磷腈形成的主副反应的影响时 希望不经分离 直接 测定反应混合物中环三聚体和环四聚体的含量 近几年常用的方法是用3 1 p n m r 谱法 是一种快速 准确的方法 5 本论文把此方法用于跟踪反应 优化反应条件 从而提高反应产率 2 23 1 p n m r 跟踪环磷腈反应的研究 2 2 1 实验仪器 b r u k e ra m4 0 0 型核磁共振仪 电子天平 b s l1 0 s 灵敏度1m g 北京赛多利斯天平有限公司 电子分析天平 b p 2 11 d 灵敏度0 0 1m g 北京赛多利斯天平有限公司 磁力搅拌器 8 5 2 型恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司 熔点仪 x t 4 a 显微熔点测定仪 北京科仪电光仪器厂 2 2 2 实验药品 实验所用原料 c a 冬n 吧 n p 一一 c p n c ai久 n a 拳 夕 怯 乏 一 一 c l p i n ya 牛 第二章八氯环四聚磷腈的合成与条件优化 所用溶剂均按照标准处理 2 2 3 测定条件 溶剂 p h c l 外标 9 0 正磷酸 谱宽 2 0m h z 扫描次数 5 采样时间 4 0 9 5s e e 脉冲宽度 2 3l x s e c 脉冲延迟 1 0s e e 测试温度 室温 高分辨的超导磁场 4 0 0m h z 2 2 4 实验步骤 反应方程式如下 p c i 5 n h 4 c 1 1 n n p c i 2 n 4 h c l c a t 实验一 不加催化剂 在十个1 0m l 三颈瓶中 分别依次加入一氯代苯8 m l 氯化铵o 4g o 0 0 7 4 8m 0 1 电磁搅拌 通n 2 加热 在回流状态加入五氯 化磷1 0g 0 0 0 4 9 9t 0 0 1 反应固定的时间 停止加热 冷却至室温 移液枪移取 固定量的清液 放入核磁管 分别测量反应时间为5m i n 3 0m i n 6 0m i n 9 0m i n 1 2 0 m i n 1 5 0 m i n 1 8 0 m i n 的3 1 p n m r 谱 实验二 加合适量的催化剂 在十个1 0m l 三颈瓶中 分别依次加入一氯 代苯8m l 氯化铵0 4g 0 0 0 7 4 8m 0 1 电磁搅拌 通n 2 加热 在回流状态加 入五氯化磷1 0g o 0 0 4 9 9m 0 1 固定量的催化剂 反应固定的时间 停止a n 热 第二章八氯环四聚磷腈的合成与条件优化 冷却至室温 移液枪移取固定量的清液 放入核磁管 分别测量反应时间5m i n 3 0 m i n 6 0 m i n 9 0 m i n 1 2 0 m i n 1 5 0 m i n 1 8 0 m i n 的3 1 p n m r 谱 向粗产品加入适量石油醚 3 0 一6 0 回流两小时 并趁热过滤出油状 物 再用9 8 浓硫酸多次反萃取石油醚 浓缩 冷却至0 得少量固体 用 5m l 环己烷重结晶 得白色固体 收率1 2 熔点1 2 4 1 2 5 文献值 1 2 3 1 2 4 2 2 5 实验结果与讨论 2 2 5 1 实验条件优化 为了优化四聚体反应的实验条件 以p h c l 为溶剂 用3 1 p n m r 谱跟踪了实 验的过程 图2 5 和图2 6 分别是没加催化剂和使用催化剂的3 1 p n m r 核磁图 图2 5 中 在6 8 0 0p p m 处 观察到反应物p c i s 的共振吸收峰在1 8 0m i n 时消 失 可以表明此时反应物p c i 5 完全参与了反应 图中 5 2 0 0 5p p m 被认为是六 氯环三磷腈的共振吸收峰 在1 2 0m i n 时出现 6 6 7 2p p m 是八氯环四磷腈的化 学位移 在1 8 0m i n 时才刚刚出现 也就是反应三个小时后才有八氯环四磷腈产 生 加入催化剂后 如图2 6 所示 在反应3 0m i n 时 反应物6 8 0 2p p m 处的 共振吸收峰已经消失 六氯环三磷腈的化学位移 1 2 0 0 5p p m 开始出现 证明是 八氯环四磷腈的化学位移6 6 7 2p p m 也开始出现 并随时间的延长 产物逐渐 增多 因此得出结论 在相同温度 相同p c i 5 与n h 4 c l 的比例下 加入适量的催 化剂 可以缩短反应时间 加快反应速率 提高环磷腈的产率 为更好的说明情况 我们做了比较图 从图2 4 中可以看出 八氯环四聚磷 腈在没有催化剂的情况下 反应进行1 8 0m i n 才产生 用催化剂在3 0m i n 时已 经有产物出现 并随时间的延长 产率呈直线增强 从而认定提高了产率 第一 章八氯环四聚磷腈的合成与条件优化 p 1 5 3 i pn m p h c l 碍 午 j mij j j j j二1 i o l l i ii ir ij 正 i l 1 j l 脏 一 j l 6 7 一 f l v i 一 一 i 儿一 一 儿 5 j 1 i 4 0 2 0o 图2 2不加催化剂p c i 5 与n h 4 c 1 反应的3 1 p n m r 谱跟踪图 j ii i l 宰 1 8 m i n 八 l 山 1 5 0 m i n 山 1 2 0 m i n i 一i io 9 0 m i n i 凡 l j l 1 1 一 6 0 m i n i 3 0 m i n a 1 一5 m i n i fl 3 0 2 01 00一1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 p p m 图2 3 加催化剂后p c i 5 与n h 4 c i 反应的3 1 p n m r 谱跟踪图 一1 7 第二章八氯环四聚磷腈的合成与条件优化 图2 41 8 0 m i n 之内八氯环四聚磷腈a n 不加催化剂的时间 产率比较图 另外 我们还对温度和时间进行跟踪 研究表明温度和反应时间的长短对 该反应均有较大影响 温度越高 反应时间长 产物越复杂 对应产物的产率 越低 这是因为发生了交联反应 反应容器底部会出现黑色的粘稠状物质 但 反应时间不足时 不利于成环 反而使线性高聚物增加 这可从分离过程中石 油醚不溶物增多现象看到 此外 在反应过程中 发现反应物p c i 5 与n h 4 c 1 最佳摩尔配比为1 1 5 反 应中n h 4 c i 稍过量 能促进环状衍生物的形成 而过量的p c i 5 会导致链状化合 物比例的增加 因此反应的最佳条件为 反应时间控制在5h 左右 反应物p c i 5 与n h 4 c l 最佳摩尔配比为1 1 5 温度在1 3 0 1 4 0 之间 2 2 5 2 八氯环四磷腈的红外光谱分析 八氯环四聚磷腈的红外图 如图2 5 所示 5 3 2c n l 1 强吸收峰为p c l 振动吸 收峰 8 7 4c l l l 1 为p n 吸收峰 1 2 11c l t i 1 和1 3 1 3c l t i 1 为p n 吸收峰 第二章八氯环四聚磷腈的合成与条件优化 o o 一 僭 昌一 r w y伽 卜 g甍崇 i 霉 岛 r i1 l 爨 葛 i 8 c jl e 簧 歪导 卜 高一 人 o j 曩 f 3 0 0 2 5 0 02 d 0 01 鄹ol i i 鄹0 v 址h 日1 n b 可a 1 1 图2 5 八氯环四磷腈的红外图 2 2 5 3 八氯环四磷腈的核磁爿 振磷谱分析 l j 南南 i o j一 o 一知南 4 0赢 6 0 南 8 0 p p m 图2 6 八氯环四聚磷腈的3 1 p n m r 1 9 第二章八氯环四聚磷腈的合成与条件优化 八氯环四聚磷腈的核磁共振 pn m r 4 0 0 m h z t h f 6 6 4 2 0 4p p m 谱峰为 单峰 说明结构中四个磷原子化学环境是相同的 2 2 5 4 反应机理 八氯环四聚磷腈的合成是一个非常复杂的过程 其合成机理目前也没有确 切的定论 认为可能的历程是先形成中间体并经过链增长 环化而生成的 5 2 1 1 中间体链的引发 p c i 5 n h 4 c i 坚竺 c 1 4 p n h 2 坚竺 c 1 3 p n h 三兰 c 1 3 p n p c i 4 竺 c 1 3 p n p c i 3 p c i 6 2 中间体链的增长 c 1 3 p n p c i 3 p c i 6 n h 4 c i 兰旦竺l c 1 3 p n p c i 2 n p c i 3 c i c 1 1 p n h c 1 3p n p c i 2 n p c i 3 c r 哥哥斗 c i s p n p c i 2 n p c i 2 c l 3 关环环化 c 1 3 p n t a 2 n n p c i 3 c i c 1 3p p 巾c 1 2 n p a 3 c 1 n h 4 0 o k a p a一三芷a x oii 毗 a 夕b 线