细菌会往有东西吃的地方跑.doc

國立中山大學生物科學系98級97學年度專題討論論文集December 12-13, 2008細菌會往有東西吃的地方跑Bacteria can move to somewhere that food exists張逸軒 CHANG Yi-Hsuan國立中山大學生物科學系Department of Biological Sciences, National Sun Yat-Sen University文獻來源Parales RE, Ditty JL, Harwood CS. 2000. Toluene-degrading bacteria are chemotactic towards the environmental pollutants benzene, toluene, and trichloroethylene. Applied and Environmental Microbiology 66(9): 4098-4104.摘要許多細菌對醣類、胺基酸及其他有機物都具趨化現象，有研究者甚至證實土壤中的細菌（Pseudomonas putida G7）也會受芳香族碳氫化合物的萘（naphthalene）吸引，但細菌對苯及甲苯這些普遍存在的芳香族的趨化現象仍未經過檢測。Parales等人培養五種經由不同代謝途徑分解甲苯的細菌，透過瓊脂醣塞測定（agarose plug assay）與毛細管測定（capillary assay）等不同趨化測定方式觀察這五種細菌受甲苯吸引的情形。其中一種細菌（P. putida F1）更被深入探討它對其他芳香族以及氯化合物的趨化情形。結果是三種細菌會被甲苯吸引，而P. putida F1對其他並非是生長基質（growth substrate）的化合物也有趨化反應。基因在趨化過程中扮演重要的角色，而Parales等人抑制P. putida F1甲苯分解基因中的調控區域後，它便失去原本對甲苯的反應，此結果暗示趨化反應是受到不同基因共同調控。只要了解趨化反應後，便能助於人類選擇對污染物具有優秀趨化及分解能力的細菌。關鍵詞：甲基接收趨化蛋白（methyl-accepting chemotaxis proteins，MCPs）、氯化脂肪族化合物（chlorinated aliphatic compound）、甲苯分解基因（toluene degradation gene，tod genes）、生物分解（biodegradation）、誘導（induce）一、前言圖一、五種有氧代謝甲苯的初反應現今在環保措施上，人們時常會利用細菌清除污染物，進行污染場址的生物復育，例如將滲漏出的石油排除，或是將廢棄的有機物轉變成為肥料等。但實務上在執行時必須確保細菌能夠接觸到汙染物，爾後才能將其代謝分解，否則如果僅是有細菌存在，卻無法自行與汙染物接觸，則只有污染場址的部分區域能夠被細菌淨化，無法全面性地進行生物復育。具有鞭毛的細菌（monotrichous、lophotrichous、 amphitrichous、peritrichous）擁有移動能力，一旦在生長基質上受到某種相對高濃度物質的刺激後，便會改變原本維持的隨機運動狀態（swim & tumble），而聚集到該物質所在處（attractants），或是遠離此物質（repellents），這就稱為細菌的趨化反應。因為這種趨化能力，使細菌與汙染物接觸的問題得以解決，細菌會自動向著污染物濃度高的地方靠近，加速了生物復育的進行。趨化反應對於細菌來說並不是特殊的現象，因為有許多細菌都具有此種特性，舉例來說，Escherichia coli對glucose及serine（絲氨酸）有趨化反應；而Pseudomonas putida PRS2000則對benzoate（苯甲酸）及salicylate（水楊酸）有趨化反應（Harwood et al，1984）。Toluene（甲苯）是一種常見的芳香族化合物，按照常理推斷，細菌對它也應該會具有趨化反應，因此Parales等人選了五種能夠在有氧狀態中分解toluene的細菌，分別是Pseudomonas putida F1、Ralstonia pickettii PKO1、Burkholderia cepacia G4、Pseudomonas mendocina KR1、Pseudomonas putida PaW15，它們分別利用五種不同的途徑將toluene氧化，部分代謝途徑如圖一所示。Parales等人透過兩種趨化測定方法，篩選出對於toluene具有感受能力並且可以對它做出趨化反應的細菌。二、研究材料與方法(一) 菌種培養進行趨化測定的實驗時，Parales等人將P. putida F1及其突變株培養於添加40mM pyruvate（丙酮酸）的基礎培養基（MSB）中，這些細菌又被分為兩組，一組是額外加入了汽化的toluene作為誘導組，另外一組則是沒有加入汽化toluene的非誘導組。另外的四株細菌則是培養於添加10mM succinate（琥珀酸）的MSB中，同樣分為誘導組及非誘導組。其中培養P. putida PaW15時還另外加入了50g/ml的leucine（白胺酸）。進行不同碳源的測試時，若是要使用易揮發的化合物，則以汽化的狀態加入。如果細菌經過培養後而能繼續生長於以某化合物作為唯一碳源的基質上時，則稱此細菌在該基質上的確具有生長能力。(二) 瓊脂醣塞測定(Agarose plug assays)如圖所示（Yu Alam，1997）。首先混合2低熔點的agarose、chemotaxis buffer（趨化緩衝液）、體積百分比10的toluene、以及少許的Coomassie blue結晶作為染色對照用。接著將10l的混合液滴到載玻片上，在其左右兩旁各放上一條塑膠片，然後以蓋玻片置於上方，於是形成一個獨立的空間。除了toluene以外的待測物也是以10的濃度加入（單位為wt/vol或vol/vol），例外的有：toluene cis-dihydrodiol與TFT cis-dihydrodiol的濃度為1mg/ml，succinate的濃度為1mM，而Casamino Acids的濃度則為2（wt/vol）。實驗進行時，取chemotaxis buffer加入生長曲線於log phase時的菌液中，調整其OD660值直至接近0.7，之後便可將菌液與緩衝液的混合液加入載玻片與蓋玻片之間，使plug得以完全被包圍住。此方法適合測定易揮發的物質。(三) 修改之毛細管測定(Modified capillary assays)將1低熔點的agarose溶於chemotaxis buffer後加入到一端封閉的1l毛細管中，而各種待測物的加入毛細管的濃度為：toluene、benzene、TFT、TCE為1 mM至3 mM；Casamino Acids為2（wt/vol）；TFT cis-dihydrodiol為1 mg/ml。實驗進行時，首先以載玻片、U型玻璃管、與蓋玻片垂直疊合，形成一個空間，接著以chemotaxis buffer調整生長曲線於log phase時的菌液直至OD660值大約為0.05，並加入到上述的空間當中。最後將含有agarose、chemotaxis buffer、及待測物的毛細管插入到充滿了菌液的空間當中，以X40的放大倍率觀察細菌的動作，從0時間起開始紀錄，直到15分鐘為止。此方法所花費的時間遠少於瓊脂醣塞測定（5至30分鐘）。三、結果(一) 瓊脂醣塞測定結果由圖二中可以看到，被toluene誘導（induced）的P. putida F1、R. pickettii PKO1、B. cepacia G4三種細菌會在含有 toluene的瓊脂醣塞周圍聚集成明顯的環狀，這種現象便是在此種測定方法中認定為具有趨化反應（注意到在此處細菌並沒有直接與瓊脂醣塞接觸，原因是由於toluene會從瓊脂醣塞中擴散出來，並以此為圓心向外形成一個濃度漸低的梯度，而細菌便會找尋一個最適濃度而聚集在該處）。至於P. putida PaW15的趨化反應則較微弱，而P. mendocina KR1在此種測定方法中不具反應。當瓊脂醣塞中的成分以Casamino Acids（牛奶中的蛋白（casein）被分解後所產生的一群胺基酸）取代時，不論是否被誘導，五種細菌均顯現出強烈的趨化反應。圖二、五種細菌對甲苯的瓊脂醣塞測定情形(二) 修改之毛細管測定結果針對被誘導的P. putida F1所做的毛細管測定結果如圖三所示。由於是連續性的紀錄，因此可以清楚看到細菌對toluene的反應過程是不斷地從外圍聚集，向著毛細管中擴散出的toluene靠近，因此P. putida F1對toluene的確有趨化現象。在兩種測定方法中，Parales等人觀察細菌在環狀帶中的運動情形時，發現它們並不是平順地朝著toluene移動，而是會在環狀帶中來回振動，然後才越來越向toluene逼近；相反的，細菌對於Casamino Acids的情形則是儘可能的貼近它，沒有來回移動的情況出現。綜合這兩種不同的趨化情形，Parales等人推論因為toluene既是營養源，同時也是毒物，所以細菌才會在不同的toluene梯度之間尋找一個最適合存在的濃度，而且這個濃度範圍狹窄，才會產生來回振動的現象。圖三、P. putida F1對甲苯的修改之毛細管測定連續變化情形(三) P. putida F1對不同物質的趨化反應除了對五種細菌進行toluene的趨化測定以外，Parales等人還將其中一株細菌，P. putida F1做了其他的測試。將瓊脂醣塞測定與修改之毛細管測定中的待測物更換為toluene之外的其他化合物後，發現P. putida F1仍然對許多物質具有趨化反應，這些物質包括芳香族的benzene（苯）、ethylbenzene（乙基苯）、TFT等，以及氯化脂肪族的DCE、TCE、PCE等，不過P. putida F1對這些物質的趨化反應只有發生在誘導組當中。除此之外，P. putida F1對於succinate及Casamino Acids也同樣有趨化反應，但是這種反應是細菌固有的（constitutive），因此在誘導組及非誘導組當中都有發生。上述測試的結果如圖四及表一所示。值得注意的是，會使P. putida F1產生趨化反應的一群化合物似乎有某種程度上的相似性，舉例來說，在芳香族的化合物當中，具有單取代基的toluene、ethylbenzene、isopropylbenzene、及TFT等，都會吸引P. putida F1，但是多取代基的xylene的同分異構物、toluene cis-dihydrodiol、及TFT cis-dihydrodiol卻都不會引發P. putida F1的趨化反應。圖四、P. putida F1對不同化合物的瓊脂醣塞測定情形表一、P. putida F1對芳香族及其取代物與氯化脂肪族的趨化測定情形註：Response: +, strong response; +, weak response; -, no response; n.d., not determined Assay: P, agarose plug assay; C, modified capillary assay Growth: +, growth; -, no growth; n.t., not tested Substrate: Y, yes; N, no; n.t., not tested(四) 甲苯分解基因（tod genes）突變對趨化的影響在P. putida F1（PpF1）的染色體上有一段與分解toluene相關的基因（tod genes），其排列順序為todXFC1C2BADEGIH（圖五）（Zylstra Gibson，1989；Menn et al，1991；Lau et al，1994；Wang et al，1995），它們負責轉錄轉譯出代謝toluene途徑上的一連串酵素（圖六）。除了上述的構造基因外，另外在其上游處有一段todR，為nonfunctional regulator；而在下游處則有一段todST，為2-component regulator，這兩段調控性基因序列也同樣屬於tod genes的一部份。Parales等人利用PpF1的突變株來測試tod genes的各個部份對於細菌的生長及趨化作用的影響，各種突變株的瓊脂醣塞測定結果如圖七所示。首先，PpF4與PpF106分別在todC1與todC2發生突變，這兩段基因負責生產toluene dioxygenase的及次單元；PpF39/D在todD突變，使toluene cis-dihydrodiol dehydrogenase無法正常作用。以上三種突變株均無法利用toluene維持生長，但對toluene的趨化反應仍是存在的。接著，PpF1todX:Km在todX發生極性突變（polar mutation），使膜上的toluene運輸蛋白無法被轉錄轉譯出來，因為極性突變會影響下游基因的表現，造成此突變株無法生長於toluene中；而PpF1todR:KmtodX則是非極性突變，只影響todR（產生一種nonfunctional truncated LysR-type regulator）與todX的表現，因此這種細菌仍能在toluene中維持正常的生長速率。上述兩種突變株同樣都會對toluene產生趨化反應。目前為止的實驗結果可以得到兩個結論，第一，在todX發生突變後，其所表現出的toluene運輸蛋白失去作用，但這些突變株卻都還可以被toluene吸引，證實PpF1不需要todX的產物（TodX）就可以對toluene產生趨化反應；第二，在toluene代謝途徑上，前兩步驟是由toluene dioxygenase與toluene cis-dihydrodiol dehydrogenase所執行，不論是哪個酵素因突變而遭到破壞，PpF1還是會被toluene吸引，證實讓PpF1產生趨化反應的刺激物就是toluene本身，而不是任何toluene經過代謝以後的產物。圖五、 P. putida F1的 tod genes組成及鄰近的代謝基因圖六、 P. putida F1的甲本分解途徑及酵素圖七、 P. putida F1及其突變株對甲苯的瓊脂醣塞測定情形前面提到的突變株雖然有的可利用toluene生長，有的不行，但都會對toluene產生趨化反應。既然控制PpF1產生此種反應的基因不在構造基因區域，也不在調控區域的todR部分，還有一種可能就是在調控區域的todST部分。todST的產物組成2-component的感覺傳導系統，一個component是由todS表現的sensory hybrid kinase，另一個則由todT表現的response regulator（Lau et al，1997）。Parales等人發現如果抑制todS（PpF1todS:Km）或使todT產生突變（PpF1todT:Km），會導致PpF1生長緩慢甚至無法生長，而且也無法對toluene產生趨化現象（見圖七）。從這種結果歸納出在toluene存在的情況下，控制PpF1對toluene做出趨化反應的基因是由TodS、TodT（todST的產物）及構造基因（表現出分解toluene的酵素）共同調控。四、討論(一) 甲苯雙氧化酶（toluene dioxygenase）及三氯乙烯（TCE）由圖七的結果，Parales等人證實toluene dioxygenase在PpF1對toluene的趨化反應上並非必要，值得注意的是即使並非必要，許多吸引PpF1（誘導組）的化合物卻也都是它的受質，例如ethylbenzene、TFT、TCE等（見表一），其中的TCE更是被美國環境保護局（U.S. Environmental Protection Agency）列為重要的地下水污染物（Nelson et al，1987；Wackett Gibson，1988；Zylstra et al，1989；Li Wackett，1992；Leathy et al，1996；Newman Wackett，1997），現在世界上已經利用P. putida F1、B. cepacia G4、及P. mendocina KR1清除TCE及其他污染物，對污染場址進行生物復育（Folsom Chapman，1991；Krumme et al，1993；Ensley Kurisko，1994；Massol-Deya et al，1997；Yee et al，1998）。(二) 甲基接收趨化蛋白（MCPs）訊息傳遞是由受體與受器結合後所觸發的一連串過程，而MCPs是一種在E. coli細胞膜上的受器蛋白，它可以與醣類或胺基酸結合，進而引發趨化反應（Falke et al，1997；Aizawa et al，2000）；另外P. putida G7對naphthalene（萘）的趨化現象也同樣是透過MCPs所引發（Grimm Harwood，1999）。因為P. putida F1之於toluene就如同P. putida G7之於naphthalene一般，所以P. putida F1也可能具有MCPs，但是觀察圖五，在tod genes附近只有分解p-cymene（isopropyltoluene）與p-cumate（isopropylbenzoate）的相關基因，並沒有類似能夠表現出MCPs的基因，因此Parales等人推測針對芳香族化合物的MCPs也許存在，只是尚未被找到而已。(三) 其他可能的甲苯受器除了MCPs之外，可能有其他蛋白扮演受器的角色，負責接收toluene並且啟動趨化反應，這些蛋白包括由tod genes下游的sep genes（圖五）表現出的SepABC（一種solvent efflux pump）（Phoenix et al，1999），以及由tod genes本身所表現的TodS sensor，後者尤應注意，因為許多能夠引發toluene dioxygenase genes表現的化合物可能都是由TodS sensor來負責接收並且啟動代謝途徑。不過從表一中也要注意到，對P. putida F1來說，不是所有能夠引發toluene dioxygenase genes表現的化合物（即toluene dioxygenase的受質）都是趨化物（chemoattractant）。(四) 廣受質專一性受器（broad-substrate-specificity chemoreceptor）之優點趨化，可以幫助移動性的細菌感知到某一特定化合物的存在，並且得以接近，主要就是靠著受質與受器的結合來啟動訊息傳遞路徑。不論受器到底是何種蛋白，究竟是什麼原因導致細菌表現出能與許多不是生長基質的受質結合的受器？可能的推測如下：此種受器讓細菌可以對許多化合物做出趨化反應，如果引發反應的刺激物正好是生長基質，那麼細菌便可以聚集上去，形成生物膜（biofilm）及製造界面活性劑（surfactant），增加該化合物的分解性及利用性。所以即使可能會遇到不是生長基質的化合物也無妨，因為趨化反應早已使得細菌的存活機率大大地提高。現在，科學家不斷地利用細菌的趨化特性來加速生物復育的