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几种常见维生素C测定方法的比较一、还原型抗坏血酸测定方法1、2，6- 二氯靛酚滴定法原理：2，6- 二酚氯靛酚吲哚钠盐在酸性条件下将还原型抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸，其本身被还原成无色的衍生物，该衍生物在酸性条件下呈粉红色，根据2，6- 二酚氯靛酚吲哚钠盐的用量计算样品中的还原型维生素C 的含量。2，6- 二酚氯靛酚吲哚钠盐的颜色表现两种特性，一种是取决于其氧化还原状态，氧化态为深蓝色，还原态为无色：二是受其介质酸度的影响，在碱性介质中呈深蓝色，在酸性介质中呈粉红色。氧化型2,6DCIP与还原型抗坏血酸常在稀草酸或偏磷酸溶液中进行反应。即先将样品溶于一定浓度的酸性溶液中或经抽提后，再用2,6DCIP标准溶液滴定至终点。该方法的优点是无需特殊的仪器，操作简便、快速，适用于大批量样品的快速测定和维生素C 含量的监控。缺点：该法也受到试剂本身的质量、配制溶液的稳定度及其它操作条件的影响。不同厂家生产的2，6- 二氯靛酚染料试剂会导致染料滴定度（T）的差异，进而影响到检测结果的差异；另外配置好的染料溶液随着保存时间的延长，T 值也会发生变化，所以每次测量时必需重新校准T 值2。样品中同时存在的Fe2+、Sn2+、SO2、SO3、S2O32- 等还原性杂质对该方法有干扰。由于大多数的水果蔬菜均有颜色，影响了终点颜色的判定，我们在多年的检测中发现使用高岭土并不能达到理想的效果，反而延长了测定时间，破坏了一部分还原型抗坏血酸，导致测定结果偏低。另外许多水果蔬菜样品处理后会出现大量的泡沫，我们称取样品时要尽量除去泡沫（可用辛醇），以免影响了定容，最终影响测定结果。该方法最大的缺点是不适用于深色样品的测定。消除其他还原物质对定量测定的干扰，可用抗坏血酸氧化酶处理，破坏样品中还原型抗坏血酸后，再用2,6DCIP 滴定样品中其他还原物质。然后从滴定未经酶处理样品时2,6DCIP标准溶液的总消耗量中，减去滴定非抗坏血酸还原物质2,6DCIP 标准溶液的消耗量，即为滴定抗坏血酸实际所消耗的2,6DCIP标准溶液的体积，由此可以计算出样品中抗坏血酸的含量。注意事项 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水； 滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考； 样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，损失维生素C； 贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子（Fe2+），要用8%的醋酸代替2%草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原2，6-二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生； 整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化； 在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除； 测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。2、碘量滴定法（反滴定法）原理：铜盐或碘酸钾与过量的KI反应生成游离的碘，游离的碘可氧化还原型抗坏血酸生成脱氢型抗坏血酸，反应持续进行直到还原型抗坏血酸全部被氧化成脱氢型抗坏血酸，剩余的游离碘与淀粉指示剂作用呈现蓝色，达到滴定终点。发现KI的浓度对该方法影响较大，通过实验发现随着KI的浓度的降低，样品中测定的还原型抗坏血酸的含量升高，原因：可能一方面浓度低的KI碘含量少，自身消耗样品中的还原型抗坏血酸少，使测量值误差较小；另一方面高浓度的KI暴露在空气、阳光下容易氧化生成碘单质，从而对实验产生干扰。直接碘量法是深色样品还原型抗坏血酸含量的测定的比较理想的方法。在没有杂质干扰的条件下, 一般也可以得到较好的结果, 是各种还原型抗坏血酸测定方法中需要仪器设备最少、便捷、快速的测定方法之一。但是在对植物样品的测定时与方法2，6- 二氯靛酚滴定法有同样的问题此外, 测定的显色反应往往较慢、不太稳定且相对迟缓, 有灵敏度不足的问题, 测定误差变化也相对较大。二、总抗坏血酸测定方法1、2，4- 二硝基苯肼比色法原理：是用活性炭把还原型抗坏血酸氧化成脱氢型抗坏血酸，在强酸性环境下，脱氢型抗坏血酸发生分子重排，其内酯环开裂生成2，3- 二酮古乐糖酸，其与2，4-二硝基苯肼偶联生成红色的脎，其呈色的强度与样品中抗坏血酸的浓度成正比。研究发现该方法中活性炭的用量对测定结果影响较大，尤其是对测定标准曲线的影响，活性炭用量不足，其所能吸附的空气中的氧相应减少，直接导致其氧化能力的降低，最终导致脎的形成不充分，影响样品的测定结果。研究结果表明2，6- 二氯靛酚的氧化率比活性炭高。两者标准曲线的线性都较好，活性炭法比2，6- 二氯靛酚法的线性范围更大。活性炭作为氧化剂用量较多，氧化时间不太好控制。而2，6- 二氯靛酚作为氧化剂可以直观地从溶液颜色的变化来判断加入量与氧化时间，容易控制。由此可见，用不同的氧化剂、不同的量，其最终的目的是保证还原型抗坏血酸完全被氧化成脱氢型抗坏血酸，氧化这一步骤是 2，4- 二硝基苯肼比色法的关键点。2、荧光分光光度计法经典的荧光光度法原理是样品中的还原型抗坏血酸被氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成有荧光的喹唔啉，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与邻苯二胺（OPDA）反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022 g/ml。利用荧光法测定时反应在暗室或避光条件下进行，各部反应要准确、迅速，作用时间一致；方法灵敏度高，结果准确，重现性好。荧光光度法测定抗坏血酸最突出的优点是方法具有强的专一性，生成荧光物质所需的时间短，能在短时间内测定抗坏血酸的含量。由于具有高灵敏度、高选择性,应用于临床代谢研究和病理检测的较好方法。缺点：实验发现，反应溶液的PH 值与缓冲液的种类对荧光强度有较大影响；另外DNA的浓度和反应的温度也对荧光强度有影响。注意事项 1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生C。 2 某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽