显微注射.doc

实验目的1 了解细胞显微注射的基本原理2 掌握细胞显微注射基本技术实验原理显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内， 再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不 含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达100kb ；实验周期相对比较短。它的不足之处是：需要昂贵精密的设备；显微注射操作复杂，需专门技术人员；导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点 附近宿主DNA 片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。尽管如此，由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。显微注射技术在植物、动物的细胞发育研究的应用，为研究体内生理和体外的生化过程架起桥梁，将特定的分子探针及衍生的细胞间质成分导入活体细胞，为研究控制细胞功能的调控机制提供了新的视野。仪器、材料和试剂（一）仪器和用具：倒置显微镜（如Nikon TMS 和Diaphot 300/2；Zeiss Axiovert 100或135，或Axioskop FS）；Leitz重型基座（用于安放显微镜和微操作仪）；微操作仪：Leitz（手动系统，安在平台上）或Eppendorf 5171（自动轴向微注射系统，可固定在显微镜的载物台上）；微注射器：Eppendorf 5242，也可选用螺旋推柄的玻璃注射器。拉针仪：水平拉针仪P87型（如Sutter Instrument Co.(Novato,USA)），或垂直拉针仪720型（如David Kopf Instruments(Tujunga,California,USA)。玻璃注射针头：可购买厂商拉制好的商品，也可用拉针仪自行拉制（可参照方法与步骤中的1.1注射针头的拉制）。细胞培养设备：细胞培养箱、超净工作台、塑料平皿和盖玻片等。（二）材料： （三）试剂： 缓冲培养基（含25mmol/L HEPES pH7.2）；注射缓冲液（10mmol/L H2PO4-和HPO42-，pH7.2，84mmol/L K+，17mmol/L Na+，1mmol/L EDTA）方法与步骤1材料准备1.1注射针头的拉制水平拉针仪：装上一根毛细管，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。设定好电流、拉力和时间。然后按开始键，等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。垂直拉针仪：把玻璃毛细管固定在上面的夹子上，使其对准加热丝后旋紧。抬起下面的滑夹，固定在毛细管上。调整热度和螺线管范围。使用拉针仪自行拉制的微注射针头，最好使用硼硅酸盐玻璃的毛细管。可以采用硅烷对注射针头进行处理，以防样品和培养基成分与玻璃的亲水表面相互作用，从而引起针尖阻塞而影响注射。1.2盖玻片的处理1把盖玻片放在陶瓷或金属架上，相互不要接触。2在装有自来水的烧杯中，快速浸泡和冲洗。3 在纸巾上把架子控干，再放入盛有0.1mol/L HCl的烧杯中，温育过夜。4用自来水冲洗盖玻片，每次10min，共5次。5把架子浸入70%的乙醇中，温育60min。6用去离子水短暂冲洗，放在纸巾上控干。7在室温下自然干燥30min。8在220250烤6 h。1.3 显微注射用细胞的准备1 在注射前一天，把细胞铺到直径为1015mm的盖玻片上，每个盖玻片2501000个细胞。2 在注射前，把带有需要注射细胞的盖玻片转移至新的组织培养皿中，迅速用金刚石笔在盖玻片上划一个十字或一个圆圈标记（金刚石笔使用前用70%乙醇冲洗，并在超净台中用火焰烧一下），然后加入3ml有缓冲液的培养基。2显微注射操作过程2.1针头装液1使用无菌的微量加样器从微注射针头的后部加入0.51l的注射样品。2使用玻璃毛细管拉出毛细管针头，里面有与毛细管平行的细丝，有利于液体从后部向针头方向运动。只需在针头后部浸入1mm深度，不需使用手指或其他东西接触，就足以使少量的样品到达针尖部。2.2针头定位1将装液后的针头的游离端安在连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定到微操作仪的托针管上。2把载有待注射细胞的盖玻片转移到里面有缓冲培养基的平皿中，将其放在中央。3将培养皿放在显微镜载物台上，尽量将盖玻片上所画圆圈的一个对准光照的中心区，这时光的亮度最好。4用低倍物镜对准细胞调焦。5将针头推入视野中心，在视野中针头呈阴影状。6轻轻的落下针头，直至到达培养基中后停下。7通过显微镜观察，移动针头，必要时调整微操作仪，直到针头的阴影在视野的上方。然后确定针头的位置，使其约处在视野中心。8轻轻下调针头，直到针头变得清晰一些2调到工作放大倍数，调准细胞焦距，找到针尖。3如果找不到，重新使用低倍镜，尽量将针头调到视野的中心，重复上述的步骤。10小心下调针尖，直到其完全聚焦。1.3显微注射的操作2.3.1手动细胞核内注射1使 用最低放大倍数（50），把焦距对准位于盖玻片上注射标记区域的细胞平面上。用肉眼将注射针头对准到照度最亮处的中心，降下针头，直到进入培养基。把针 头调入到视野的中心，轻轻放下针头，直到看清楚为止。然后将放大倍数调至工作倍数，即320，对准细胞表面调焦。将针头调整到中心，下降针头，对准焦距。移动显微镜载物台，使针尖对准细胞核或核周的胞质。2小心落下针尖，使其进入细胞核或核周的胞质。3使用注射器施加注射压4轻轻上提针头，直到离开细胞。5移动显微镜载物台，找到下一个细胞，重复24步骤.。2.3.2自动细胞核内注射和细胞质内注射1按上述手动系统的方法将针头调整至视野中间，不同的是通过控制面板自动控制微操作部分。2工作放大倍数为320，下降针头，使之触及细胞核或核周间隙上方的细胞表面，直到细胞表面见到一个轻微的压迹。3通过控制部分，设定细胞核内或细胞质内注射的定位参数。4将针头略提起，离开细胞表面几微米，选择一个新细胞，按下操纵杆上方的按钮进行微注射。针头首先在水平面上做逆向轨迹运动，然后朝向细胞做出一个迅速的轴向 运动，正好刺入细胞内预先设定好的坐标位置，这时微操作仪的控制部分，激活注射压力，持续时间已经预先设定好。针头回到原来的位置。5在必要的情况下，可以在控制面板上修正各种参数，因为盖玻片和平皿的表面不是十分平整，所以当从盖玻片的一个地方移动到另一个地方进行注射时，一定要重新调整细胞核内或细胞质的坐标。3对注射了荧光标记物的细胞的分析荧光标记物，如FITC-葡聚糖等常用来作注射用标记物，以分辨出已经注射的细胞。浓度为0.25%1%时，这种物质的毒性很小，而且在细胞增殖的24天仍可见。3.1在PBS中轻轻冲洗注射过的细胞两次。3.2用甲醇（2min）或PFA/GA（5min）快速固定3.3用去离子水快速冲洗盖玻片。3.4滴一滴Mowiol，将盖玻片装到载玻片上。注意事项1在整个过程中，注射针尖应远离人员和实验室中的仪器。注射针在持针器上安装不牢时，注射器、管子及注射针内的压力，可能将注射针射出。2在反向充填液体时，适当地在显微镜下观察注射针尖，以决定在加压时是否注射针阻塞或偏斜。阻塞通常可通过将针尖轻轻敲击一个固定物而得以缓解。针尖偏斜的注射针是适合于显微注射的，但其使用应做细微调整或补偿注射中加压所造成的额外偏斜。胞质成分，细胞裂解或细胞从底层移位。当注射体积小于估计的细3注射速度过快能扰乱细胞体积的50%，并且注射样品的流动速度几乎不导致可见的细胞质移位时，注射效果最好。4用紫外光可看到注入标记物后的活细胞，但会对细胞造成不可恢复的损伤，因此应尽可能缩短紫外光照射时间。5如果