微生物培养技术.doc

微生物培养技术一、学习目的微生物培养技术是研究微生物的基础，也是现代微生物技术的基石。微生物培养是生物培养的中的一种。所培养的微生物主要有病毒、细菌、放线菌、真菌等。微生物培养需要用到培养基，根据微生物的不同种类和生活习性来配制特定的培养基。微生物培养成功的关键在于无菌操作，如果培养器具和培养基不能彻底灭菌、培养的过程中有杂菌污染是很容易失败的。在本章中，同学们将学习与微生物培养相关的技术，如消毒灭菌技术、培养基制备技术和微生物接种、分离纯化技术等。二、技术介绍1、 消毒灭菌技术：消毒是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。通常用化学的方法来达到消毒的作用。用于消毒的化学药物叫做消毒剂。灭菌 是指把物体上所有的微生物（包括细菌芽孢在内）全部杀死的方法，通常用物理方法来达到灭菌的目的。灭菌是彻底的消毒，灭菌虽然要求达到无菌，但实际上是很困难的，一般规定灭菌后微生物生长几率应补高于10-6，工业上一般认为100万个处理对象中仅有一个带菌时可视为无菌。常用的消毒灭菌技术有：（一）加热灭菌使用加热灭菌法，在温度和压力等规定的灭菌条件下，要达到一定的加热时间，因灭菌物品的性质、灭菌容器的容积大小各异，所以，灭菌时间是从容器内全部达到规定的温度时开始计算。1、火焰灭菌法，是利用火焰加热杀灭微生物的一种方法。本办法以燃气为主，用于磁制与金属制口及在火焰中不会破损的物品。加热时间通常在喷灯或酒精的火焰中加热秒以上。2、干热灭菌法，是利用干热空气加热杀灭微生物的一种方法。本办法以燃气为主，用于磁制、金属制若干物品，纤维制物品，矿物油、脂肪、脂肪油、试验药物、固态的医药品等耐高温的物品；利用燃气和电能直接加热空气，将加热的空气进行循环，保持干燥与高温状态。通常，在以下几种条件下进行灭菌。135145 35小时；160170 24小时；180200 0.51小时；200以上0.5小时以上。在密封容器中装入医药品、水溶液等，这些物品属耐高温的物品，可用134138的热空气，加热3分钟以上进行灭菌。3、高压蒸气灭菌法，是利用适当温度和压力的饱和水蒸气加热杀灭微生物的一种方法。本办法以燃气为热源，用于磁制、金属制、橡胶制、纸制、纤维制的物品、水、培养基、试验药品、试验液体和液态医药品等的灭菌，总之，用于耐高温高压水蒸气的物品。为确实达到灭菌，灭菌容器中的原有空气在操作中要从排气中排除，进行灭菌时，高压蒸气必须饱满。通常可在以下条件下进行灭菌：121（1.0kg/cm2），20分钟。4、流通蒸气灭菌法，利用直接加热的流通水蒸气杀灭微生物的方法。本办法以燃气作为热源，对磁制、金属制、橡胶制、纤维制的物品、水、培养基、试验药品、试验液和液状的医药品等进行灭菌。用干热灭菌法或高压蒸气灭菌法，物品有变质的危险，所以在100流通水蒸气中灭菌需3060分钟。5、煮沸灭菌法，利用沉没在沸腾水中加热杀灭微生物的一种方法。本办法以燃气为能源，对磁制、金属制、橡胶制、纤维制的物品、水、培养基、试验药品、试验液体、液状的医药品等进行灭菌，用干热灭菌法和高压蒸气灭菌法进行灭菌的物品有变质的危险。所以为增加杀菌效果，可以在沸腾水中加入12%的碳酸氢钠。将物品沉入沸腾水中进行灭菌时，煮沸时间应在15分钟以上。6、间歇灭菌法，是利用80100水或流通水蒸气，24小时为一周期，每隔3060分钟反复加热35回；用来杀灭微生物的一种主法。用6080的水反复加温也是一种间歇式低温灭菌方法。本办法主要用于以橡胶为主的制品，培养基、试验用药品、液体和液态状的医药等。（二）过滤灭菌过滤灭菌法,即用筛除或滤材吸附等物理方式除去微生物,是一种常用的灭菌方法。对不耐热液体,过滤是唯一实用的灭菌方法. 滤器可分为深层型和过筛型两大类。深层滤器主要靠滤材的深度,通过机械性捕获或随机吸附进行过滤,多数滤材属此类型。过筛型滤器以物理过筛法将液体或气体中 。有些需要灭菌的材料不能受热，例如许多维生素溶液。因此，许多液体可以用过滤法来灭菌。过滤法不是将微生物杀死，而是把它们排除出去。滤膜一般由醋酸纤维素、硝酸纤维素、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等合成纤维材料制成。滤膜的孔径一般为0.2微米，它可以滤除绝大多数微生物的营养细胞。过滤法的最大缺点是不能滤除病毒。该方法主要用于气体、水、含有可溶性、不稳定物质的培养基、试验液体和液状医药品等。（三）照射灭菌1、放射线灭菌法，包括放射性同位素在内的，利用从放射源产生射线进行照射，是杀灭微生物的一种方法。本办法，主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品与纤维制品等耐受放射线照射的物品。通常使用的放射源有60CO、137C5等，根据进行灭菌物品的材质、性状和污染状况等，对照射的总线量进行调节，以达到灭菌的目地。2、紫外线灭菌法，是利用照射紫外线杀灭微生物的一种方法。本办法主要用于玻璃制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品和纤维制品等，还可用于设施、设备、水或医药品等，这些物品应对紫外线有良好的耐受性，通常，一般应用200300nm的紫外线。3、高频灭菌法，是直接用照射高频发热杀灭微生物的一种方法。本办法主要用于水、培养基、试验液体和液状的医药品等耐受高频照射的物品。通常采用915或2450兆周的频率。（四）化学消毒灭菌根据对病原体蛋白质作用，分为以下几类。1、凝固蛋白消毒剂 包括酚类、酸类和醇类。（1）酚类 主要有酚、来苏、六氯酚等。具有特殊气味，杀菌力有限。可使纺织品变色，橡胶类物品变脆，对皮肤有一定的刺激，故除来苏外应用者较少。苯酚（石炭酸）（carbolic acid）：无色结晶，有特殊臭味，受潮呈粉红色，但消毒力不减。为细胞原浆毒，对细菌繁殖型1：801：110溶液，20，30分钟可杀死，但不能杀灭芽胞和抵抗力强的病毒。加肥皂可皂化脂肪，溶解蛋白质，促进其渗透，加强消毒效应，但毒性较大，对皮肤有刺激性，具有恶臭，不能用于皮肤消毒。来苏（煤酚皂液）（lysol）：以47.5%甲酚和钾皂配成。红褐色，易溶于水，有去污作用，杀菌力较石炭酚强25倍。常用为25%水溶液，可用于喷洒、擦试、浸泡容器及洗手等。细菌繁殖型1015分钟可杀灭，对芽胞效果较差。六氯酚（hexochlorophane）：为双酚化合物，微溶于水，易溶于醇、酯、醚，加碱或肥皂可促进溶解，毒性和刺激性较少，但杀菌力较强。主要用于皮肤消毒。以2.53%六氯酚肥皂洗手可减少皮肤细菌8090%，有报告可产生神经损害，故不宜长期使用。（2）酸类 对细菌繁殖体及芽胞均有杀灭作用。但易损伤物品，故一般不用于居室消毒。5%盐酸可消毒洗涤食具，水果，加15%食盐于2.5%溶液可消毒皮毛及皮革，10l/kg加热30浸泡40小时。乳酸常用于空气消毒，100m3空间用10g乳酸熏蒸30分钟，即可杀死葡萄球菌及流感病毒。（3）醇类 乙醇（酒精）（ethyl alcohol）75%浓度可迅速杀灭细菌繁殖型，对一般病毒作用较慢，对肝炎病毒作用不肯定，对真菌孢子有一定杀灭作用，对芽胞无作用。用于皮肤消毒和体温计浸泡消毒。因不能杀灭芽胞，故不能用于手术器械浸泡消毒。异丙醇(isopropylalcohol)对细菌杀灭能力大于乙醇，经肺吸收可导致麻醉，但对皮肤无损害，可代替乙醇应用。2、溶解蛋白消毒剂 主要为碱性药物，常用有氢氧化钠、石灰等。（1）氢氧化钠 白色结晶，易溶于水，杀菌力强，24%溶液能杀灭病毒及细菌繁殖型，10%溶液能杀灭结核杆菌，30%溶液能于10分钟杀灭芽胞，因腐蚀性强，故极少使用，仅用于消灭炭疽菌芽胞。（2）石灰（CaO）遇水可产生高温并溶解蛋白质，杀灭病原体。常用1020%石灰乳消毒排泄物，用量须2倍于排泄物，搅拌后作用45小时。20%石灰乳用于消毒炭疽菌污染场所，每46小时喷洒一次，连续23次。刷墙2次可杀灭结核芽胞杆菌。因性质不稳定，故应用时应新鲜配制。3、氧化蛋白类消毒剂 包括含氯消毒剂和过氧化物类消毒剂。因消毒力强，故目前在医疗防疫工作中应用最广。（1）漂白粉应用最广。主要成分为次氯酸钙Ca(ClO)2，含有效2530%，性质不稳定，可为光、热、潮湿及CO2所分解。故应密闭保存于阴暗干燥处，时间不超过1年。有效成份次氯酸可渗入细胞内，氧化细胞酶的硫氢基因，破坏胞浆代谢。酸性环境中杀菌力强而迅速，高浓度能杀死芽胞，粉剂中用于粪、痰、脓液等的消毒。每升加干粉200克，搅拌均匀，放置12小叶，尿每升加干粉5克，放置10分钟即可。1020%乳剂除消毒排泄物和分泌物外，可用以喷洒厕所，污染的车辆等。如存放日久，应测实际有效氯含量，校正配制用量。漂白粉精的粉剂和片剂含有效氯可达6070%，使用时可按比例减量。（2）氯胺T（chloramine T） 为有机氯消毒剂，含有效氯2426%，性较稳定，密闭保持1年，仅丧失有效氯0.1%。微溶于水（12%），刺激性和腐蚀性较小，作用较次氯酸缓慢。0.2%1小时可杀灭细菌繁殖型，5%2小时可杀灭结核杆菌，杀灭芽胞需10小时以上。各种铵盐可促进其杀菌作用。12.5%溶液对肝炎病毒亦有作用。活性液体须用前12小时配制，时间过久，杀菌作用降低。（3）二氯异氰尿酸钠(soddichlorisocynurate)又名优氯净，为应用较广的有机氯消毒剂，含氯6064.5%。具有高效、广谱、稳定、溶解度高、毒性低等优点。水溶液可用于喷洒、浸泡、擦沫，亦可用干粉直接消毒污染物，处理粪便等排泄物，用法同漂白粉。直接喷洒地面，剂量为1020g/m2。与多聚甲醛干粉混合点燃，气体可用熏蒸消毒，可与92号混凝剂（羟基氯化铝为基础加铁粉、硫酸、双氧水等合成）以1：4混合成为“遇水清”，作饮水消毒用。并可与磺酸钠配制成各种消毒洗涤液，如涤静美，优氯净等。对肝炎病毒有杀灭作用。此外有氯化磷酸三钠、氯溴二氰尿酸等效用相同。（4）过氧乙酸(peroxyacetic acid)亦名过氧醋酸，为无色透明液体，易挥发有刺激性酸味，是一种同效速效消毒剂，易溶于水和乙醇等有机溶剂，具有漂白的腐蚀作用，易挥发的刺激性酸味，是一种高效速效消毒剂，易溶于水和乙醇等有机溶剂，具有漂白和腐蚀作用，性不稳定，遇热、有机物，重金属离子、强大碱等易分解。0.010.5%，0.510分钟可杀灭细菌繁殖体，1%5分钟可杀灭芽胞，常用浓度为0.52%，可通过浸泡、喷洒、擦抹等方法进行消毒，在密闭条件下进行气雾（5%浓度， 2.5ml/m2）和熏蒸(0.751.0g/m3)消毒。（5）过氧化氢36%溶液，10分钟可以消毒。1025%60分钟，可以灭菌，用于不耐热的塑料制品，餐具、服装等消毒。10%过氧化氢气深胶喷雾消毒室内污染表面；180200ml/m3，30分钟能杀灭细菌繁殖体；400ml/m3，60分钟可杀灭芽胞。过氧化氢蒸汽(HPV)消毒技术正迅速成为制药、生物技术和医疗卫生行业生物净化方法的选择，对与高压锅相同的生物指示剂-嗜热脂肪芽孢杆菌达到6-log的杀灭率。在试运行或停工期间可采用广泛的消毒产品和服务对设施进行生物净化。（6）过锰本钾 15%浓度浸泡15分钟，能杀死细菌繁殖体，常用于食具、瓜果消毒。4、阳离子表面活性剂（ Cationic surfactants）主要有季铵盐类，高浓度凝固蛋白，低浓度抑制细菌代谢。有杀菌浓度，毒性和刺激性小，无漂白及腐蚀作用，无臭、稳定、水溶性好等优点。但杀菌力不强，尤其对芽胞效果不佳，受有机物影响较大，配伍禁忌较多，为其缺点。国内生产有新洁尔灭，消毒宁（度米苍）和消毒净，以消毒宁杀菌力较强，常用浓度0.51.0，可用于皮肤，金属器械，餐具等消毒。不宜作排泄物及分泌物消毒用。5、烷基化消毒剂（1）福尔马林为3440%甲醛溶液，有较强大杀菌作用。13%溶液可杀死细菌繁殖型，5%溶液90分钟或杀死芽胞，室内熏蒸消毒一般用20ml/m3加等量水，持续10小时，消除芽胞污染，则需80ml/m324小时，适用于皮毛、人造纤维、丝织品等不耐热物品。因其穿透力差，刺激性大，故消毒物品应摊开，房屋须密闭。（2）戊二醛（glutaraldehyde）作用似甲醛。在酸性溶液中较稳定，但杀菌效果差，在碱性液中能保持2周，但强提高杀菌效果，故通常2%戊醛内加0.3%碳酸氢钠，校正pH值为化合物(杀菌效果增强，可保持稳定性18个月。无腐蚀性，有广谱、速效、高热、低毒等优点，可广泛用于杀细菌，芽胞和病毒消毒。不宜用作皮肤、粘膜消毒。（3）环氧乙烷(epoxyethane) 低温时为无色液体，沸点10.8，故常温下为气体灭菌剂。其作用为通过烷基化，破坏微生物的蛋白质化谢。一般应用是在15时0.40.7kg/m2，持续1248小时。温度升高10，杀菌力可增强1倍以上，相对湿度30%灭菌效果最佳。具有活性高，穿透力强，不损伤物品，不留残毒等优点，可用于纸张、书籍、布、皮毛、塑料，人造纤维、金属品消毒。因穿透力强，故需在密闭容器中进行消毒。须避开明火以防爆。消毒后通风防止吸入。6、其他（1）碘通过卤化作用，干扰蛋白质代谢。作用迅速而持久，无毒性，受有机物影响小。常有碘酒、碘伏（碘与表面活性剂为不定型结合物）。常用于皮肤粘膜消毒，医疗器械应急处理。（2）洗必泰(hibitane) 为双胍类化合物。对细菌有较强的消毒作用。可用于手、皮肤、医疗器械、衣物等消毒，常用浓度为0.21。2、 常用玻璃器皿的清洗与包扎技术清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，因此，玻璃器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作。清洗方法根据实验目的、器皿的种类、所盛放的物品、洗涤剂的类别和沾污程度等的不同而有所不同。现分述如下：1、新玻璃器皿的洗涤方法新购置的玻璃器皿含游离碱较多，应在酸溶液内先浸泡数小时。酸溶液一般用2的盐酸或洗涤液浸泡后用自来水冲洗干净。2、使用过的玻璃器皿的洗涤方法(1)试管、培养皿、三角烧瓶、烧杯可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至10次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于铁丝框内或有空心格子的木架上，在室内晾干。急用时可盛于框内或搪瓷盘上，放烘箱烘干。玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。装有固体培养基的器皿应先将其刮去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2煤酚皂溶液（来苏尔）或025新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸半小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物最好先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。盛放一般培养基用的器皿经上法洗涤后，即可使用，若需精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次，晾干或烘干后备用。(2)玻璃吸管吸过血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后应立即投入盛有自来水的量筒或标本瓶内，免得干燥后难以冲洗干净。量筒或标本瓶底部应垫以脱脂棉花，否则吸管投入时容易破损。待实验完毕，再集中冲洗。若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后再装入吸管自动洗涤器内冲洗，没有吸管自动洗涤器的实验室可用冲出棉花的方法多冲洗片刻。必要时再用蒸馏水淋洗。洗净后，放搪瓷盘中晾干，若要加速干燥，可放烘箱内烘干。吸过含有微生物培养物的吸管亦应立即投入盛有2煤酚皂溶液或025新洁尔灭消毒液的量筒或标本瓶内，24小时后方可取出冲洗。吸管的内壁如果有油垢，同样应先在洗涤液内浸泡数小时，然后再行冲洗。(3)载玻片与盖玻片用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸510分钟，用软布或脱脂棉花擦试，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡052小时，自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95酒精中保存备用。使用时在火焰上烧去酒精。用此法洗涤和保存的载玻片和盖玻片清洁透亮，没有水珠。检查过活菌的载玻片或盖玻片应先在2煤酚皂溶液或025新洁尔灭溶液中浸泡24小时，然后按上法洗涤与保存。空玻璃器皿的包装1、培养皿的包装培养皿常用旧报纸密密包紧，一般以58套培养皿作一包，少于5套工作量太大，多于8套不易操作。包好后行于热灭菌。如将培养皿放入铜筒内进行干热灭菌，则不必用纸包，铜筒有一圆筒形的带盖外筒，里面放一装培养皿的带底框架，此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。2、吸管的包装准备好干燥的吸管，在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段约1.5cm长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将微生物吸出管外。棉花要塞得松紧恰当，过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花会下滑。然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的近左端，与报纸约呈45度角，并将左端多余的一段纸覆折在吸管上，再将整根吸管卷入报纸，右端多余的报纸打一小结。如此包好的很多吸管可再用一张大报纸包好，进行干热灭菌。如果有装吸管的铜筒，亦可将分别包好的吸管一起装入铜筒，进行干热灭菌；若预计一筒灭菌的吸管可一次用完，亦可不用报纸包而直接装入铜筒灭菌，但要求将吸管的尖端插入筒底，粗端在筒口，使用时，铜筒卧放在桌上，用手持粗端拔出。3、试管和三角烧瓶等的包装试管管口和三角烧瓶瓶口塞以棉花塞，然后在棉花塞与管口和瓶口的外面用两层报纸（不可用油纸）与细线包扎好，进行干热灭菌。试管塞好棉花塞后也可一起装在铁丝篓中，用大张报纸将一篓试管口做一次包扎，包纸的目的在于保存期避免灰尘侵入。空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若需湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好再加一层牛皮纸。如果试管是盖的铝帽，则不必包纸，可直接干热灭菌。用塑料帽，则宜湿热灭菌。3、 培养基制备技术一般培养基的程序主要可分为：配料、 溶化、矫正pH 、澄清过滤、分装、灭菌及检定等8 个步骤。（一）配料按培养基处方准确称取各种成分，先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入各种成 分，以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水冲洗瓶壁。（二）溶化将各种成分混匀于水中，在电炉上溶化应随时搅拌，如有琼脂成分时更应注意防止外溢。溶化完毕，补足失去的水分。（三）矫正pH使用试纸测定溶液pH值，若测定值过酸或过碱可用01mol/L 氢氧化钠或01mol/L 盐酸溶液矫正，直至pH与标准要求相同为止，加碱或加酸时要精确缓慢，每加1滴后要充分混匀，比色后再加第2滴（有时仅加半滴）。（四）过滤澄清培养基配制后一般都有沉渣或混浊出现，需过滤成清晰透明后方可使用，常用的过滤方法如下：1、液体培养基液体培养基必须清晰，以便观察细菌的生长情况，常用滤纸过滤，亦可在加热前加 入用水稀释的鸡蛋白 （1000ml 培养基用1个鸡蛋白） 在100 加热后保持6070，4060 分钟，使其不溶性物质附于凝固的蛋白上而沉淀，然后再用虹吸法吸出上清液或以 滤纸过滤。2、固体培养基如系琼脂培养基，于加热融化后需趁热以绒布或两层纱布中夹脱脂棉过滤；亦可用自然沉淀法，即将琼脂培养基盛人铝锅或广口搪瓷容器内，以高压 （103.43kPa） 蒸汽 融化15 分钟后，静置高压锅内过夜，次日将琼脂倾出，用刀将底部沉渣切去，再融化即可收清晰的琼脂培养基。（五）分装1、根据需要将培养基分装于不同容量的三角烧瓶、试管中。分装的量不宜超过容 器的2/3以免灭菌时外溢。2、琼脂斜面分装量为试管容量的1/5，灭菌后须趁热放置成斜面，斜面长约为试管 长的2/3。3、半固体培养基分装量约为试管长的1/3，灭菌后直立凝固待用。4、高层琼脂分装量约为试管的1/3，灭菌后趁热直立，待冷后凝固待用。5、液体培养基分装于试管中，约是试管长度的1/3 。6、琼脂平板：将灭菌 （或加热融化） 后的培养基冷至50左右，以无菌手续倾人 灭菌平皿内，内径9cm 的平皿倾注培养基约1315ml ，轻摇平皿底，使培养基平铺于平 皿底部，待凝固后即成，倾注培养基时，切勿将皿盖全部启开，以免空气中尘埃及细菌落入。新制成的平板培养基（简称平板），表面水分较多，不利于细菌的分离，通常应将平皿倒扣搁置于37培养箱内约30分钟待平板平面干燥后使用。（六）灭菌不同成分、性质的培养基，可采用不同的灭菌方法。高压蒸汽灭菌法：高压灭菌的温度与时间随培养基的种类及数量的不同有所差别，一般培养基少量分装时高压（103.43kPa） 灭菌15 分钟即可，培养基分装量较大时，可 高压（103.43kPa） 灭菌30 分钟，含糖的培养基高压（55.16kPa） 灭菌15分钟。以免糖 类被破坏。（七）检定每批培养基制成后须经检定方可使用，检定时将培养基放37温箱内培养24小时后，证明无菌，同时用已知菌种检查在此培养基上生长繁殖及生化反应情况，符合要求者方可使用。（八）保存制好的培养基，不宜保存过久，以少量勤做为宜。每批应注明名称，分装量，制作日期等，放在4冰箱内备用。4、 微生物接种技术用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。用以挑取和转接微生物材料的接种环及接种针，一般采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备，使用时用火焰灼烧灭菌。而移植液体培养物可采用无菌吸管或移液枪。（1）斜面接种：从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。此法用于好气性微生物的接种。左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面划曲线或直线。 图1. 斜面接种示意图（2）液体接种：由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。 如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。 （3）穿刺接种：用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。 （4）平板接种：将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种： 1)斜面接平板a.划线法：见平板划线分离法。b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）即可。 2)平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。5、 微生物分离技术单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落（colony）。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔（lawn）。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板（culture plate）的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1、稀释倒平板法（pour plate method）先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000等），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。2、涂布平板法（spread plate method）由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图2-4）。3、平板划线法（streak plate method）用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 4、稀释摇管法（dilution shake culture method）用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式* 。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间（图2-6）。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡-石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。三、实验项目实验1: 微生物培养基的制备与灭菌（必修，3学时）1. 实验目的(1)了解细菌培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。(2)了解几种灭菌方法，掌握加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。(3)熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。2. 材料及器材介绍(1)药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、(2)高压蒸汽灭菌锅。(3)其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。3. 操作步骤一、培养基的制备与分装 (1)牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)配方及配量：牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 琼脂20g 水1000ml PH 7.4-7.6。(2)称量：按培养基配方比例依次准确地称取药品。可溶性淀粉先用少量热水溶化后再加入其他成份，补足所需水分，混匀后加入琼脂。(3)熔化：在沸水浴锅中加热熔化。(4)调pH：用1mol/L NaOH调pH至7.4-7.6。(5)过滤:趁热用多层纱布过滤(6)分装:将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。(7)加棉塞:培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上标签，注明培养基名称、日期、组别。二、器皿包扎为了灭菌后仍保持无菌状态，各种玻璃器皿均需洗净后包扎。(1)培养皿洗净烘干后每10套叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，外面用绳子捆扎，以免散开，然后进行灭菌。到使用时在无菌室中才打开取出培养皿。(2)吸管洗净烘干后的吸管，在口吸的一端用尖头摄子或针塞入少许脱脂棉花，以防止菌体误吸口中，及口中的微生物吸入管而进入培养物中造成污染。塞入棉花的量要适宜，棉花不宜露在吸管口的外面，多余的棉花可用酒精灯的火焰把它烧掉。每支吸管用一条宽约4-5厘米，以45左右的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，吸管的另一端用剩余纸条迭打结，不使散开，标上容量。若干支吸管扎成一束，灭菌后，同样要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽去吸管。(3)试管和三角瓶都要作合适的棉花塞。棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶。棉花塞的制作要求使棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，不能过松，过紧易挤破管口和不易塞入，过松易掉落和污染。棉花塞的长度不少于管口直径的二倍，约2/3塞进管口。若干支管用绳子扎在一起，在棉花塞部分外包，油纸或牛皮纸再在纸外用绳扎紧。三角瓶每个单独用油纸包扎棉花塞。三、高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌。(1)在灭菌锅中使用前，检查灭菌锅的状态，各配件是否完整，各仪表是否正常，管道是否通畅；(2)在灭菌锅中盛蒸馏水直至高水位灯亮；将用试管分装好的培养基、包装好的培养皿等玻璃器械放入灭菌器内；(3)旋紧上盖，设定灭菌条件：103kPa，121.3，开始灭菌；(4)加热，打开排气活门，放出冷空气（一般在水沸后排气5分钟左右），关闭放气活门，使压力逐渐上升至103kPa，温度达121.3，维持20分钟后，排气至压力显示“0”时，慢慢打开盖子。如果突然开盖，冷空气大量进入，蒸汽凝成水滴，使物品潮湿，且玻璃类易发生爆裂。四、倒平板、摆斜面(1)灭菌完毕，将试管培养基冷至50左右，将试管棉塞搁在玻棒（或木棍）上，搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。(2)在超净工作台上将三角瓶中无菌培养基倒入无菌培养皿中。(3)将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448h，以检查灭菌是否彻底。(4)将培养基放入4冰箱待用。4. 注意事项实验中尤其要注意高压灭菌锅的使用，此仪器是高压容器，具有一定的危险性。实验一定要每个人亲手操作，注意观察实验中的现象。5. 作业及思考题(1)配制牛肉膏蛋白胨培养基斜面有哪些操作步骤?用于筛选哪一类菌株？(2)培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养菌是无菌的？(3)管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉皮塞代替？为什么。实验2: 土壤中真菌的分离培养（必修，5学时）1. 目的要求(1)了解真菌选择性培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。(2)掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法，从而获得纯化培养技能。2. 材料及器材介绍（1）琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、NaCl、KH2PO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O、4.5mL无菌水6管，49.5mL无菌水(带玻璃珠)1瓶。（2）土壤样品、试管、培养皿、移液管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、称量纸、牛角匙、pH试纸、棉花、报纸、记号笔、线绳、纱布、酒清灯等。（3）电炉、立式高压蒸气灭菌锅、超净工作台等3. 操作步骤一、培养基的制备与分装马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：KH2PO4 1g，MgSO47H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，琼脂1520g，水1000mL，自然pH。（1）称量和溶解：先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。（2）分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。（3）链霉素的加入：链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20)，在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL ，使每毫升培养基中合链霉素30g。PDA培养基是用于培养真菌的培养基，PDA培养基配方如下:马铃薯(去皮) 200g，葡萄糖 20g，琼脂 15-20g，水 1000mL，pH 自然。（1）马铃薯煮汁的制备将马铃薯洗净去皮,称量200g,用小刀切成长,宽为2cm,厚度为3-5mm的土豆片,要求大小厚薄均匀.在1000mL水中煮沸15-20min,煮至无白心为止.用46层纱布过滤,补充水分至1000mL.（2）葡萄糖和琼脂的称量与溶化称取15-20g琼脂,加入土豆汁中,继续加热,并不断搅拌,当琼脂充分溶化后,加入葡萄糖,搅拌直至完全溶化.（3）分装,加棉塞,捆把,灭菌及灭菌同前。二、土壤中真菌的分离纯化（1）取土壤：取表层以下510cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4冰箱中暂存。（2）制备稀释液(要无菌操作)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡510min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-310-8的稀释液。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。 （3）微生物分离：取各管稀释各1mL，分别接入相应标号的马丁培养基平皿中，每个稀释度接两个平皿。将接种好平板倒置，即皿盖朝下放置，于2830中恒温培养，培养57d。观察生长的菌落，并进一步纯化分离或直接转接斜面。三、土壤中真菌的培养使用PDA培养基培养纯化好的真菌。四、纯菌种的进一步鉴定（选做）4. 注意事项注意采土壤样品时采样的土质和采样的深度，对最后结果有一定影响。注意各玻璃用品的灭菌消毒工作。5. 作业及思考题(1)在分离真菌时为什么需加链霉素（庆大霉素或氯霉素），而不加青霉素？(2)用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从哪个浓度开始？为什么？(3)怎样进一步鉴定分离得到的纯菌种？实验3: 噬菌体的分离纯化及效价的测定（选修，4学时）1. 目的要求（1）学习分离纯化噬菌体的基本原理和方法，观察噬菌斑。（2）掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的技能。2. 材料及器材介绍（1）敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。 （2）3倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.5%，试管分装，每管4mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%，含培养基10mL）。 （3）无菌小试管、无菌吸管，玻璃涂布棒，培养皿、三角瓶、无菌水，恒温水浴锅，离心机等。3. 操作步骤一、噬菌体的分离与纯化（1）噬菌体的分离宿主细胞培养：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入5mL牛肉膏蛋白胨培养液的试管中，混合均匀后置37度震荡培养过夜。噬菌体增殖：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中加入阴沟污水20mL和大肠杆菌过夜培养物0.3mL，混合后37度震荡培养12-24h。裂解液制备：将上述混合培养液倒入一支50mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中，所得裂解液经37度培养过夜，以作无菌检查，还可以加入几滴氯仿，稍作混合，备用。噬菌体检查：在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL大肠杆菌菌液，用无菌玻璃涂布棒涂布均匀。待平板菌液干后分别加数小滴裂解液于其上，置37度培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，则证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。（2）高效价噬菌体的制备将纯化的噬菌体裂解液与液体培养基按1:10的比例混合，再加入大肠杆菌悬浊液适量（可与噬菌体裂解液等量或为其1/2量），37度培养，使噬菌体增殖，如此重复数次，便可得到高效价的噬菌体制品。（3）噬菌体的纯化如果已证明确有噬菌体的存在，便用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1 毫升大肠杆菌悬液，使混合均匀。取上层琼脂培养基，溶化并冷至55（可预先溶化、冷却，放55 水浴箱内备用）, 加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2mL，立即混匀倒入含底层培养基的平板上，混匀。置37 培养24h。此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于37 震荡培养，直至试管中菌轩液又浑浊变清，培养物经离心后取上清液，再重复本实验操作步骤直至出现的噬菌斑形态一致为止。二、噬菌体效价的测定 （1）噬菌体液的稀释按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5mL液体培养液的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。 （2）噬菌体与菌液混合 将12支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照各3支。分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做3个管，在另外3支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.1mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。 （3）混合液与上层培养基混合将12支融化并保温于55的上层培养基4mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置，凝固后置37培养24h。 （4）观察并计数 观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿有30300个噬菌斑的平板计算噬菌体效价。 计算公式： 噬菌体效价=噬菌斑数*稀释倍数*10/mL4. 注意事项实验一定要保证无菌操作，所用的玻璃器皿一定要先期高压灭菌。指示菌密度是在平板上获得清晰噬菌斑效果的重要因素之一，其细胞密度不宜过高，一般控制在1107个细胞/mL为宜。5. 作业及思考题（1）有哪些方法可检查发酵液中确有噬菌体存在？比较其优缺点。 （2）测定噬菌体效价的原理是什么？要提高测定的准确性应注意哪些操作？实验4:牛乳的细菌学检查（选修，4学时）1. 目的要求（1）了解牛乳的消毒和细菌学检查的重要性，及其卫生质量的判断标准。（2）学习牛乳的巴斯德消毒法和细菌学检查方法。（3）巩固无菌操作、平板划线、显微镜计数、培养基制备等操作技术。（4）通过小组合作学习与实践，培养学生的团队精神与意识，使学生养成团队协作的工作习惯。2. 材料及器材介绍市售生鲜牛乳，牛肉膏蛋白胨培养基，紫红胆汁琼脂，美蓝溶液（1:250000），美蓝染液，无菌