磁珠分选肿瘤干细胞操作规程.doc

肿瘤干细胞的分选工作0 l2 E% ?- i( n4 R9 v( 一、消化4 _- t% a) c7 M T) j4 _0 B（1）取出肿瘤组织，低温保存（离体组织冰上最多能保存多久仍可以用来分离CSCs？）（2）PBS漂洗，尽可能去除血细胞; 9 B 6 G. W% b1 a（3）放在DMEM/F12中尽量剪碎或剁碎组织3 W, z: g# - V$ 5 Q+ r% P（4）用胶原酶和透明质酸酶37C 摇床中消化一小时（透明质酸酶是否必要？）5 W- h) - C4 l) L% R（5）慢速离心，去上清。DMEM/F12混悬沉淀，% H5 s5 r+ r9 my+ I（6）过滤（请问40微米筛是否可以？）。+ B9 x, Q! Q; G0 g! （7）滤液用histopague-1077去除红细胞（据文献报道，请问是否有必要？）% L l# Q1 u) 3 W; _（8）离心，沉淀用无血清CSCs培养液混悬。接着进行分选（请问细胞养一天影响大不大？）( n8 O% b0 g- 二、分选（据文献看流行的做法是磁珠分选，再流式检测纯度）, T t# - 1 - V （1）负选：去除CD45标记的血干细胞及CD117、FAP标记的间质细胞（请问各位大侠是否做这一步？）9 ) J( : V0 r: c( W （2）正选目的细胞1 y+ u( J. uF)5 v9 s6 s- e7 b( M5 x; j磁珠分选步骤G8 a# a7 ! r6 _试剂和设备：0 N3 Y( x) I. d. C2 JBuffer：无Ca，Mg离子的PBS，PH 7.2, 含0.5%BSA，2mM EDTA, 是用autoMACS稀释液（美天旎货号130-091-222）稀释MACS BSA储备液（130-091-376）制成，保持Buffer冰冷（48），使用前脱气，避免气泡堵塞分选柱。+ 8 n5 7 o4 B一磁性标记2 z Q% / iu1 M保持细胞冰冷，108或小于次数的细胞则使用下述体积试剂，磁性分选前获取较佳的单细胞悬液，可以将细胞通过40um尼龙筛，去除可能阻塞分选柱的细胞团块。高温和延长孵育时间会导致非特异性细胞标记。+ # K& A* G! w! P* p* W/ ) U1.细胞计数0 r9 w- o7 Q3 |, N3 T- i9 K3 M4 e2 Y, w2.300g离心细胞悬液，尽量去除上清, Y; Z9 S7 4 M: q- N3.用350 uL buffer重悬# W/ x+ _+ I q* o* n# o0 T# |4.加100 uL FcR 封闭试剂/ q& M6 g z: F) d; N5.加50 uL CD133/1(AC133)-Biotin6 i) ( R4 E6 r% D5 H5 p6.充分混合后冷处孵育10分钟（48）% 2 H5 h: z9 B. w4 N7.加50uL PE连接CD133抗体（#130-090-853）遮光冰箱孵育5分钟( i: k; I2 K( T8.用10-20倍标记样体积的buffer洗细胞300g离心10分钟。充分洗,去上清。( N7 Q4 t2 T1 f9.重复清洗细胞5 g# c! X6 f7 D6 % 8 Y10.用400uL buffer 重悬细胞5 / ; E( w/ : 11.加100 uL抗生物素微珠. P# # & l8 y* F2 E12.充分混合冰箱孵育15分钟3 t- |* k) r* $ m( k13.用10-20倍体积buffer洗细胞并300g离心10分钟，充分吸去上清 c4 B7 # V: 14.用500uL buffer 重悬细胞 _2 S1 N5 R- , e15.继续磁性分选步骤5 c7 l9 M9 h8 k二磁性分选1 n: k H+ ! 4 q& q8 o1.安装分选柱+ Z8 f$ a% b1 i3 ! J2.用500uL buffer冲洗分离柱# R) A o2 I# o& d; O3.细胞悬液上柱6 U. g! m, l0 b k, S4.收集过柱的未标记细胞，用适量Buffer洗柱子，洗三次，每次等柱内Buffer流干再加，MS柱：3500uL， 收集总流出液。这部分就是未标记细胞组分; s2 N. ) Y% Q$ d- S9 _ l* u5.将MS柱从分离器上取下，放在新收集管上. |+ 5 r/ U9 r8 N/ ?6.加1mL buffer 到分离柱中，立即用活塞坚定地吹洗出磁性标记的细胞& q! Q8 _* # K/ c2 0 c, c7.要想进一步纯化CD133细胞，洗出的细胞可再次上柱，即用新分离柱重复16步骤注意：所有过程在超净台和冰上进行以保证细胞活力: S1 _, R5 q7 R. T/ f; T1用冰预冷的MACS buffer 重悬108胶质母细胞瘤细胞7 C, M0 ) x2用冰预冷的MACS buffer 洗几次: ) y/ Q Q: g/ h34下在90uL 冰预冷的MACS buffer中用PE连接的CD133抗体10uL 与5105细胞结合30分钟（抗体浓度需要被调整） 2 ?9 K H- e4用MACS buffer洗几次细胞! r# o b& q4 o* x0 l6 ? N5 4用微珠连接的抗PE的抗体处理细胞30分钟（20uL微珠连接PE抗体/5105在80uL冷MACS buffer中）7 p9 C J1 s/ n0 q i1 S 9 R6用冷MACS buffer洗几次细胞1 Q2 N- q |U; . s l7用500uL 冷MACS buffer重悬抗体黏附的胶质母细胞瘤细胞 u4 -8附图，准备MS柱2 c! a( f$ Z; n( 9细胞悬液上柱. m% W N( Z c7 p10收集过柱的未标记细胞，用500uL 冷MACS buffer 洗MS柱三次，每次当柱内积液干时加buffer，收集总流出液为未标记细胞部分2 v7 ?; t, A6 C1 U+ i%