（遗传学专业论文）病毒诱导的基因沉默体系优化及烟草dhs基因功能研究.pdf

中文摘要 随着植物基因组计划的深入开展 研究重点已转向重要基因挖掘及功能鉴定 但目前尚缺乏 有效的方法对d n a 序列在植物体中的生物学功能进行火规模鉴定 近儿年新发展的病毒诱导基 冈沉默 v i r u s i n d u c e dg e n es i l e n c e v i g s 技术 可以利用携带目标基因的病毒载体侵染植物 诱导相关基因沉默 根据基因被抑制的表型推断目标基因的功能 由于v 1 g s 技术操作简单 周 期短 有望成为大量分析c d n a 序列功能快速 有效的方法 为了v i g s 技术大规模应用于植物基因功能研究作好准备 以及探讨v i g s 技术用于植物发 育相关基因功能研究的可行性 本研究以p d s 作为报告基因对农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体 系进行优化 并利用该系统研究了烟草 n i e o t i a n ab e n t h a m i a n a d h s d e o x y h y p u s i n es y n t h a s e 基因的功能 取得如下进展 1 探讨了农杆菌接种浓度 接种植物的苗龄 病毒载体中插入片段与内源相关基因同源性对 病毒诱导基因沉默效率的影响 结果显示一定范围内农杆菌接种浓度 o d 值为o 6 20 对v i g s 效率影响不明显 6 叶龄幼苗是晟佳接种时期 当接种苗龄大于6 周的幼曲 无法诱导相关基冈 沉默 插入片段与内源相应基因的相似程度及完全一致片段的睦度影响v i g s 的发生效率 供试 的4 个巴口 杏 p r m d u c i s 同源片段 与烟草内源相关基因同源性分别为8 2 8 8 均未产生 预期的沉默症状 2 利用v i g s 系统 研究了烟草d h s 基因的功能 成功获得d h s 基因沉默表型 d h s 抑制 后植物表现多重反应 生长前期主要表现为生长增强 叶脉失绿 叶片n t 绿素含量下降 后期植 株的沉默表型有所分化 部分植株叶片自然衰老明显延迟 开花推迟 另一部分植株上部系统叶 片失绿 极少数植株表现十分矮小 生欧滞后 推测沉默表型分化与不同株系d h s 基因被抑制 的程度和持续时间及d h s 靶蛋白e l f 一5 a 功能分化有关 此研究结果表明d h s 基因参 j 多个生理 过程 在植物生k 与发育中起重要作用 可用于农作物 林木增产及园林绿化植物绿期延艮的遗 传改良研究及开发 本研究还证明 v i g s 技术可用于植物发育相关基因的研究 关键词 病毒诱导基因沉默 v i g s 基因功能 d h s a b s t r a c t w i t ht h ep r o g r e s si np l a n tg e n o m i c sr e s e a r c h t h es t u d yd i r e c t i o ni st u r n e di n t ot h ed i s c o v e r ya n d f u n c t i o n a la n a l y s i so fi m p o r t a n tg e n e s b u ta ne f f e c t i v em e t h o di sn e e d e dt oi n v e s t i g a t et h eb i o l o g i c a l f u n c t i o no f e d n as e q u e n c e si nl a r g e s c a l e w i t ht h en e w l yd e v e l o p e dt e c h n i q u e v i r u s i n d u c e d g e n es i l e n c i n g v 1 g s p l a n t si n f e c t e dw i t hv i r u sv e c t o rc a r r y i n gh o s t d e r i v e ds e q u e n c ei n s e r t sw i l l s h o wj o s s o f f u n c t i o no rr e d u c e d e x p r e s s i o nm u t a n t si nt h eh o s tg e n e t h es y m p t o m sw i l lt e l lt h e f u n c t i o n a li n f o r m a t i o no f t h eg e n e n o r m a l l yt h ep r o c e s so f c o n s t r u c t i n gav i r u sv e c t o ra n d m o n i t o r i n gs y m p t o m so ni n f e c t e dp l a n t sc a nb ec o m p l e t e dw i t h i naf e ww e e k s s u c ht h a tv i g sp r o v i d e s as i m p l e r a p i da n dh i g ht h r o u g h p u tm e a n so f a n a l y z i n gt h ef u n c t i o no f s e q u e n c e dg e n e s i no r d e rt oe x p e n dt h ea p p l i c a t i o no f v l g sw i d e l ya n de f f e c t i v e l yi np l a n t sf o ra n a l y s i so f g e n e f u n c t i o ni nl a r g e s c a l e a n dt ol e a r nw h e t h e rv i g sc o u l db eu s e di na n a l y s e so f d e v e l o p m e n t a lg e n e f u n c t i o n w eu s e dp d s a sar e p o r t e rg e n et oo p t i m i z et h ea g r o i n f e c t i o ns y s t e mu s e di nv i g s m o r e o v e r ap v x b a s e dv i g sa p p r o a c hw a su s e dt oi n v e s t i g a t et h ef u n c t i o no f t h en i c o t i a n ab e n t h a m i a n a d e o x y h y p u s i n es y n t h a s e n b d h s i n t h i ss t u d y t h ef o l l o w i n gp r e s e n t st h em a i np r o g r e s s 1 f i r s t l y t h ee f f e c t so f a g r o b a c t e r i u mc o n c e n t r a t i o n l e a f a g eo f p l a n ts e e d l i n g sa n d t h eh o m o l o g y o f t h ei n s e t sw i t ht h ec o r r e s p o n d i n ge n d o g e n o u sg e n e so nv i g se f f i c i e n c yw e r es t u d i e d t h er e s u l t s s h o w e d t h ea g r o b a c t e r i u mc o n c e n t r a t i o n o d 6 0 0 2 06 2o h a dn oo b v i o u se f f e c t so nv i g se f f i c i e n c y s i x l e a fo l ds e e d l i n gi st h em o s ts u i tf o ra g r o i n f e c t i o n a n dw h e nb e i n gm o r et h a ns i x w e e ko l dt h e i n f e c t e dp l a n t sw a sn o ta b l et ob ei n d u c e dv i g s t h es i m i l a r i t ya n dl e n g t ho ft h el o n g e s ti d e n t i c a l f r a g m e n to fi n s e r t sw i t he n d o g e n o u sg e n e sd r a m a t i c a l l ya f f e c t e dt h ea b i l i t yt oi n d u c ev i g si ni n f e c t e d p l a n t s a n dt h ef o u rp r u n u sd u l c i se d n af r a g m e n t st e s t e d s h a r i n gi d e n t i t y8 2 8 8 w i t hc o r r e s p o n d i n g e n d o g e n o u sg e n e w e r en o ta b l et oi n d u c ev i g so f t a r g e tg e n e si nn i c o t i a n ab e n t h a m i a n a 2 i nt h ep r e s e n ts t u d y w ea l s oo b t a i n e df u n c t i o n l o s sp h e n o t y p eo f n i c o t i a n ab e n t h a m i a n ad h s f n b d h s b yu s i n gv i g si n b e n t h a m i a n a t h es u p p r e s s i o no f d h s r e s u l t e di np l e i o t r o p i ce f f e c t si n b e n t h a m i a n a a tb e g i n n i n gd h ss i l e n c e dp l a n t se x h i b i t e da l li n c r e a s ei nl e a f b i o m a s s l o s so f g r e e ni nt h ev i c i n i t yo f v e i n a n dd e c r e a s ei nl e a f c h l o r o p h y l lc o n t e n t l a t e rp l a n t ss h o w e dd i f f e r e n t s i l e n c i n gp h e n o t y p e s s o m ed i s p l a y e dd e l a yi nn a t u r a ll e a f s e n e s c e n c ea n df l o w e r i n gt i m e a n do t h e r s l o s tg r e e ni nt h eu p p e rl e a v e s a n daf e wh a dad r a w fp h e n o t y p e w et h i n kt h a tt h ep l e i o t r o p i ce f f e c t s b yd h ss i l e n c i n gi n b e n t h a m i a n aa r er e l a t e dt ot h ee x t e n ta n dd u r a t i o no f d h ss i l e n c i n gi nd i f f e r e n t s i l e n c e dp l a n t sb yv 1 g ss y s t e mo nt h eo n eh a n d a n do nt h eo t h e rh a n dt od i f f e r e n t i a lf u n c t i o n so f t a r g e t p r o t e i ne l f 5 ai s o f o r m s t h er e s u l t ss h o w e dt h a td h s m e d i a t e ss e v e r a lp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e sa n d p l a y si m p o r t a n tr o l e si np l a n tg r o w t h d e v e l o p m e n ta n ds e n e s c e n c ea n dh a sp o t e n t i a l l yi m p o r t a n t a p p l i c a t i o ni ng e n e t i cm o d i f i c a t i o no fc r o p s w o o d sa n dh o r t i c u l t u r a lp l a n t s i tw a sa l s op r o v e dt h a t v i g sc o u l d eb eu s e di na n a l y s e so f d e v e l o p m e n t a lg e n ef u n c t i o n k e yw o r d s v i r u s i n d u c e dg e n es i l e n c i n g v i g s g e n ef u n c t i o n d h s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意 研究生签名 丑 云乞时间 石一s 年 f 月5 同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩印或扫描等复 制手段保存 汇编学位论文 同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 研究生签名 导师签名 曼 琵皂 纠刃雾 时间 2 0 o s 年t 月2 口同 时间 2 一 年 f 月力日 第一章文献综述 第一节病毒诱导的基因沉默及其在植物功能 基因组学研究中的应用 随着基因组计划的深入开展 其研究重点由结构基肉组学转向功能基因组学研究 结构基冈 组学以建立生物体遗传 物理和转录图谱为主 是基冈组学研究的初级阶段 功能基田组学是利 用结构基因组学提供的信息 运用高通量序列分析技术 人规模实验技术及计算机统计分析技术 研究基因功能 是基因组学研究的高级阶段 在结构基因组学研究阶段 g e n b a n k 中累积了大量未知功能的d n a 序列 如何鉴定这些基 因的功能将成为功能基因组学研究的重点课题 目前 获得一段d n a 序列功能信息的最简单方 法是将该d n a 序列与g e n b a n k 中公布的基因序列进行同源性比较 如利用b l a s t 软件进行核茁 酸和氮基酸序列同源性比较 或者借用各种生物信息学软件进行分析 同源性检索及生物信息学 软件分析仅仅为该d n a 片段的功能鉴定提供了问接证据 基因功能分析还需实验上的数据1 4 j 尤其是生物学实验上的直接证据 通常 此类生物学实验需要获得该序列在植物体中过量表达或 表达被抑制的证据 然而 面对数据库中海量的d n a 序歹口信息 大规模功能基园组学研究尚缺 少有效的方法来鉴定大量的d n a 序列在植物体中的生物学功能 在遗传学与分子生物学研究中 确定表型与相关基冈的对应关系 一分重要 有时甚至是分子遗传学研究的瓶颈 随着病毒诱导的基因沉默 v i r u si n d u c e dg e n es i l e n c e v i g s 研究的深入和相关操作技术 的发展 v i g s 已成为一种快速 高通量的基因功能分析方法 可以在较短时间内鉴定基因序列 的生物学功能 有望成为功能基因组学研究潜在的有效方法i v i g s 是近年来发现的一种转录后基因沉默 p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g p t g s 现象 研究表明 这是植物体中普遍存在的遗传免疫机制 在正常情况f 保护植物免受外源核酸的入 侵1 6 j 植物病毒的行为主要受这种机制影响 病毒的许多致病蛋白被这种遗传免疫机制抑制 烈 性病毒能够克服这种遗传免疫的抑制作用 而温和病毒则无法克服 这种机制可以应用到植物功 能基冈组学研究中1 7 即在植物中利用遗传免疫方法 使某个特定基冈的表达发生系统性沉默 然后通过表型鉴定推断该目标基因在植物生长发育中的作用及对外晃环境刺激的反应 现就 v i g s 的发现 技术原理和机制 v i g s 技术应用丁植物功能基因组学研究的原理 庶州现状羽i 前 景等进行详尽叙述 lv i g s 的发现 1 1r n a 介导的病毒抗性 r m d 的发现 在病毒与宿主植物互作的研究中 b a u l c o m b e 教授发现 转马铃薯x 组病毒 p v x 复制酶基因 的植物 对p v x n 抗性与蛋白表达量呈反相关 表达量低的转基因植株表现高抗 而表达量高的株 中国农业大学博 学位论文第一章文献综述 一病毒诱导的皋凼沉默及其枉植物功能基凶组学研究中的应用 系则表现感病 进一 步研究表明 转基冈植物对病毒的抗性不是由蛋白质介导的 而是由r n a 介导的一种基因沉默现象 称为r n a 介导的抗性 r m d 这种基因沉默现象可分为两个类型 一是转病毒基因诱发的基因沉默 二是接种病毒诱导的基因沉默 1 2 v i g s 的提 i 在自然情况下 有些病毒侵染植物后也町发生与l 面描述的基因沉默相类似的恢复现象 经 过多方面的对比研究 b a u l c o m b e 等首先提出病毒诱导基因沉默概念嗍 植物的病毒防御和基刚 沉默具有相似性 带有病毒e d n a 片段的转基因植物既可以由该病毒诱导沉默义可以抑制该病毒 的侵染 2v i g s 技术原理和机制 2 1 v i g s 是转录后基冈沉默 目前研究表明 引发v i g s 的r m d 机制与p t g s 有关 9 该机制中 与目标基因序列相似 度较大的r n a s 被特异性降解 b a u l c o m b e f 6 椎断v i g s 机制中存在一种类似f i g s 过程中的 复制基因运动相关基因 图1 1 以马铃薯x 组病毒为倒 说明v l g s 机制中存在系统沉默信号 病毒运动蛋白缺失后 重组病毒接种后被限制在接种叶片卜 但目标基因仍出现系统沉默症状 基因沉默信号 可在植物体中传递并诱发r m d 使非侵染组织具有抑制病毒的能力 这种信号 可能是般链r n a 或者一种与沉默有关的短r n a 1 2 t l v i o n n e t 等4 1 棚利用缺失运动蛋向的重组病 2 中固农业大学博上学位论文第章文献综述一 病毒诱导的基因沉默及j e 在植物功能基因组学研究中的忠用 系则表现感痫 进一步研究表明 转摹因植物对病毒的抗性不是由蚩白质介导的 而是由r n a 介导的一种基因沉默现象 称为r n a 介导的执性 r m d 这种基闻沉默现象可分为两个类型 足转病毒蕉固诱发的基网沉默 二是接种病毒诱导的基因沉默 1 2 v i g s 的挺h 在自然情况f 有些病毒侵染植物后也町发生与l 面描述的基因沉默相类似的恢复现象 经 过多办面的对比研究 b a u l e o m b e 等首先提出病毒诱导基因沉默概念一i 植物的病毒防御和基冈 沉默具有相似性 带有病毒e d n a 片段的转基w 植物既可以南该病毒诱导沉默义可以抑制该病毒 的侵染 2v i g s 技术原理和机制 2 1v i g s 是转录后基因沉默 e l 前研究表明 引发v i g s 的r m d 机制与p t g s 有关i 坤 该机制中 与目标基因序列相似 度较大的r n a s 被特异性降解 1 b a u l c o m b e l 6 1 推断v i g s 机制中存在一种类似p t g s 过程中的 复制基j 矧厦动相关甚川 圄卜1 毗马铃薯x 组病毒为仔9 说明vj g s 机制中存在系统沉默信号 病毒运动蛋白缺支后 重组病毒接种后被限制在接种叶片卜 但目标基因仍山现系统沉默症状 基因沉默信号 可在植物体巾传递升诱发r m d 使非侵染组织具有抑制病毒的能力 这利 信号 可能是双链r n a 或者一种与沉默有关的短r n a 1 2 v i o n n e t 等 1 4 1 利用缺失运动蚩白的重组病 可能是双链r n a 或者种弓沉默有关的短r n a 忆1 v i o n n e t 等 1 4 1 利用缺失运动蛋白的重组病 2 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 稿毒诱导的基因沉默及其在植物功能基因组学研究中的应用 n l 曼皇曼曼 皇皇曼 皇曼曼曼曼 鼍 曼蔓曼曼曼曼 曼鼍曼曼曼 曼鼍曹曼曼 毒载体p v x g f p a t g b a c p 同样使表达绿色荧光蛋白 g f p 的转基因烟草发生系统性高效 沉默 图1 1 示v i g s 机制中存在系统沉默信号 可长距离地进行细胞间传递 如果在病毒基因 组中插入目标基因或其核苷酸片段 所引发的针对目标基因的信号同样可以在植物体中传递 从 而诱发系统的特异性抑制作用 2 2v i g s 的本质是植物体对病毒侵染的防御机制 许多研究表明当植物体受到病毒侵染时 会激发一种针对病毒基因组的 核苷酸序列特异性 的 由r n a 介导的防御机制 r n a m e d i a t e dd e f e n c e r m d 1 6 1 8 1 病毒侵染后 该机制可抑制 病毒的发生 使病毒累积下降 这种病毒诱导的基因沉默的机理类似于r n a 干扰 r n a i 及转 基因引起的 共抑制 现象 属于r n a 沉默 图1 2 概括了r n a 沉默机制 说明v i g s 是植物 图卜2r 沉默机制模式图 此模型包含参与拟南芥单拷贝正义转基因沉默的作用园子 一般认为 正义转基因沉默的发生首先产生异常r n a 被转变成艰链r n a d s r n a 拟南芥中通过s d e s g s 监督复制系统完成 后 诱导基因沉默 具有反向或重排 结构的转基斟可以通过分子内碱基配对直接产生d s r n a 不需要s d e s g s 系统参与 r n a 病毒存复制循环中会 产生d s r n a 其诱导的基因沉默也不需要此系统的参与 有些r n a 病毒 如c m v 或p v x 也会产生异常r n a 通过s d e s g s 途径后 诱导基因沉默 综合分析p v x 编码的p 2 5 和p o t y v i m l h c p r o 推测系统沉默信号在s d e s g s 途径中产生或者也可能是2 1 2 3 n tr n a 的前体分子 r n a 沉默的各种可能分支 最终都归结到d s r n a 的积累 之后 d s r n a 被加工成2 1 2 3n t r n a 后者与一种核酸酶复台物结合 以序列特异性的方式降解单链r n a 3 中国农业大学博十学位论文第一章文献综述 一病毒诱导的基凶沉默及其在植物功能基因组学研究中的麻用 对病毒感染的白然反应 病毒侵染植物细胞可能引起双链r n a d s r n a 的累积 然后形成小 分子干扰r n a 与r n a 酶 s i r n a r n a s e 的复合体 特异性降解病毒单链r n a 在病毒侵染的 初始阶段 由i d s r n a 数量很少 而不足以引发s i r n a r n a s e 复合体 随着病毒繁殖 d s r n a 与s i r n a 也大量形成 s i r n a r n a s e 复合体开始特异性降解病毒r n a 病毒累积开始下降 许多植物病毒编码一些抑制蛋白可以阻抑这种针对病毒r n a 的基因沉默现象 有时 这些抑制 蛋白是病毒的致病因子 抑制蛋白只有在病毒大量复制时才被合成 因此它不能完全抑制植物对 病毒r n a 的降解 但可以影响病毒的积累 强抑制蛋白可使病毒的累积量很高 反之 如果病 毒累积量较低 可能由于抑制蛋白的活性较低 l 3v i g s 技术应用于植物功能基因组学研究的原理 如果通过d n a 重组技术 在病毒基因组中插入一段目标基闶或其核苷酸片段 受侵染的寄 主植物激发的r m d 机制不仅对病毒产生抑制作用 同样可抑制与插入片段同源的寄主内源基因 的表达 即s i r n a r n a s e 复合体会特异性降解与插入片段同源的寄主植物本身的r n a 结果被 侵染的寄主植物表现出目标基因功能丧失或表达水平f 降的表型 1 v i g s 技术就是利用携带目 标基因的病毒载体侵染植物 使被侵染的植株表现出目标基冈突变的性状 从而直接推断目标基 因的确切功能 或提供问接的生物学证据 图1 3 以马铃薯x 组病毒 p v x 为例 说明v i g s 应用于植物功能基冈组学研究的原理 通常构建v i g s 病毒载体及观察被侵染植物的表型仅需数 星期 因此利剐v i g s 可建立一种简单 快速的桥梁 将序列已知但功能未知的基因与其生物学 功能联系起米 2 复制基因运动相关基因 图卜3v 1 6 s 应用于植物功能基因组学研究的原理示意图 以p v 为例 o 灰色方抠代表马铃薯x 组病毒p v x 基冈组的开放阅读框柴 o r f 第一个o r f 编码与病毒在寄主细胞中 复制相关的蛋白质 另外一个与病毒运动有关 外源基凼的插入没有破坏这两部分o r f 的功能 4v i g s 技术的发展和应用 4 1 v i g s 技术的发展 4 中国农业大学博 l 学位论文第一章文献综述 一病毒诱导的基因沉默及其在植物功能基圳组学研究中的成用 v i g s 采用的病毒多为r n a 病毒 最初v i g s 技术需要先进行体外转录以激活病毒后进行侵 染 操作比较复杂 现已发展了一种由根瘤土壤杆菌介导的病毒感染技术 称为 根瘤菌感染 a g r o i n f e c t i o n 口 操作方便 简单 快速 即将病毒d n a 整台在t i 质粒t d n a 区 组成 混合的载体系统 整合在t i 质粒载体上的植物病毒基因组 通过根瘤土壤杆菌 a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s 导入植物细胞并表达 产生病毒感染症状 诱发r m d 机制 根瘤菌感染的接种方 法也在不断改进 对幼苗叶片进行浸润注射 a g r o i n f i l t r a t i o n 1 7 1 是目前广泛使用的方法 此方法要 求接种幼旨具有多片完全展开的叶子 通常为4 5 片 目前又有研究者报道了更为简便的淋透 a g r o d r e n c h 方法口4 1 即用根瘤菌悬浮液淋透植物根附近的土壤 达到接种病毒的目的 此方 法可以对浸润注射无法接种的更小幼苗进行接种 因此适用的植物范围更广 可以更有效地沉默 植物根特异表达基因 操作简便 快速 适用于大规模基因功能分析 由于v i g s 系统诱发的信 号可以在植物细胞问传递 因此沉默的发生是系统性的 如果病毒载体携带了目标基冈 针对目 标基因的v i g s 也被激活 8 1 整株植物表现出病毒诱导的目标基因沉默现象 4 2v i g s 技术成功应用于基因功能研究的植物种类和载体系统 v i g s 应用最成功的植物是病毒学家常用的模式植物一本生烟草 b e n t h a m i a n a 与包括普通 烟草 t a b 口c u r n 在内的其他植物相比 本生烟草对许多病毒都比较敏感 且产生v i g s 性状也 更为持久 其原因尚不完全清楚 w a i g m a n n l 2 5 1 认为可能与本生烟草的原生质体膜的排组限 e x c l u s i o nl i m i t 较大有关 或者它体内阻止病毒积累的防卫机制存在天生缺陷 也可能与病毒 侵入分生组织细胞的能力有关1 1 由于v 1 g s 技术潜在的应用价值 引起了众多学者厂j 泛的研究 兴趣 适j 1j 的植物范围在不断扩大 最初只能在烟草队阿红柿 2 6 大麦 和拟南芥1 2 8 1 等少数植 物上应川 目前成功的报道日渐增多 有茄科的马铃薯口t j 青椒和矮牵牛u 豆科的豌豆 p i s u m 5 口t i v u m 1 和人戟科的木薯 c a s s a v a 3 2 随着大量研究的开展 有理由相信 借助v i g s 技术人们 可从越来越多植物中发现新基因 并非所有的病毒均适用于v i g s 有些病毒可编码某些因子 对p t g s 产生抑制作j j 削弱 v i g s 目前已有烟草花叶病毒 t m v 1 3 3 1 大麦条纹花叶病毒 b s m v 1 2 7 马铃薯x 组病毒 p v x 吼甘蓝卷叶病毒i 1 c b l c v 烟草脆裂病毒 t r v j 番茄金花叶病毒 t g m v 1 3 3 1 豌豆 早褐病毒 p e b v 3 1 1 和非洲木薯花叶病毒 a c m v 3 2 等被应用为v 1 g s 载体 其中有些病毒载 体还存在 些缺陷 首先 有些病毒本身所诱发的黄矮 卷叶与腐烂症状影响真正目标基困被抑 制的表型观察 有时甚至被遮盖 其次 上述有些病毒并非侵染所有细胞 如t m v p v x 与t g m v 等病毒不能侵染生氏点 不能使分生组织中表达的基因沉默 因而也就不能用来研究植物组织发 育及决定基冈的功能 尽管如此 并不影响这些载体应用于植物基因功能的研究 由于t r v 载体独有的优点 这里以其为例 详细介绍v i g s 载体的构建过程及应用方法 t r v 载体是v i g s 技术应用于植物基冈功能研究的一个重要的优选载体系统 是从t r v 基冈组 发展的一种v i g s 载体1 该病毒本身诱发的症状较轻 侵染人面积相邻细胞 而1 r 斑点状 井 可侵染生k 点 这样 在利用t r v 作为v i g s 载体研究基因功能中 目标基因沉默表型更明显 而易鉴定 同时可用来研究植物组织发育及组织决定基因的功能 r a t c i f f 等 7 l 构建了t r v 的r n a l 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 一病毒诱导的基因沉默及其查植物功能基因组学研究中的应用 与r n a 2c d n a 的双元表达载体 分别命名为p b i n t r a 6 与p t v 0 0 启动子均为c a m v 3 5 s 在 d b i n t r a 6 中整合的r n a l 的r n a 聚合酶编码基因 r d r p e p 插入了拟南芥 a r a b i d o p s i s 硝酸 盐还原酶的内含子 i n t 利于p b i n t r a 6 在大肠杆菌 正c o l d 中的稳定存在 p t v 0 0 中的 r n a 2 基因组序列仅保留57 和37 非编码序列及病毒外壳蛋白编码基因 切去了2 9 4k d 及3 28k d 蛋白质的编码基冈 并插入一段多克隆位点 m c s 可用来插入目标基因序列 图l 4 这两个载 体分别被导入不同的农杆菌中 在侵染时 将其混合 通过注射 划伤等手段侵染烟草等寄主植 物 当病毒基因组c d n a 导入植物并表达后 病毒即被激活 则可诱发r m d 同时 也会诱发 与插入到p t v 0 0 多克隆位点片段同源的内源基因的表达沉默 目前 w 病毒衍生的v 1 g s 载 体已在本生烟草 7 番茄 2 6 1 拟南芥 2 及马铃薯 等植物中成功诱发内源基因沉默 图1 4 烟草脆裂病毒基因组结构和相应的v lg s 载体的卜d n a 区结构 1 r a l v i g s 载休p b i n i r a 6 的t d n a 区结构 含有t r v r n a l 的c d n a 克隆 b 野生型t r v 的r n a 2 箍斟组 结构 c v i g s 载体p t v 0 0 的t d n a 区结构 含有r n a 2 来源的病毒外壳蛋白基因 c p c d n a 和一个多克 隆位点 m c s 5v i g s 技术应用于植物功能基因组学研究中的进展和应用前景 51v 1 g s 应用于植物基因功能研究的进展 v 1 g s 已在多种植物中得到应用 显示了这种新技术潜在的应用价值 r a t c l i f f 等 7 1 使用t r v 载体 己成功地使转基因烟草的绿色荧光蛋白基因沉默 还使内源八氢番茄红素脱饱和酶 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 病毒诱导的基因沉默及其在植物功能基因组学研究中的应用 p h y t o e n ed e s a t u r a s e p d s 基因沉默 引起光漂白现象 将烟草n f l n i c o t i a n af l o l e y 基 因的4 2 1 个核营酸c d n a 片段插入p t v 0 0 中 诱发v i g s 由于n f l 基因与开花性状有关 其 表达沉默引发次生及三生侧枝 花的表型异常 萼片卷曲 花序变形 无雄蕊或无花瓣 这些表 型与拟南芥 v 突变体类似 l i u 等1 36 j 利用t r v 有效诱导了烟草花器官发育相关基因d e f i c i e n s 此基因在a b c 模型中属b 类基因 的沉默 使花瓣转变成萼片 雄蕊转变成心皮 所有这些 研究表明t r v 诱导的v i g s 可以应用于分生组织及花发育相关基因的功能研究中 此外使t r y 诱导的v l g s 还使二磷酸核酮糖羧化酶 r i b u l o s eb i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e 的小 基编码基冈 r b c s 发生表达沉默 使用p v x 载体在烟草中确定了一个纤维素合酶 c e s a 基因的功能t r b c s n c e s a 为多基因家族 说明v i g s 同样可使多基因家族发生基因沉默 番茄金花叶病毒为种传病毒 p e e l e 等 1 用其作为载体 诱导镁离子鳌合酶的一个亚基编码 基因与细胞核增殖抗原蛋白 p c n a 编码基因沉默 免疫定位检测到分生组织中p c n a 蛋白信号 减弱 表明以种传病毒为载体的v i g sa 7 被用于研究分生组织中基因功能 植物与原生动物中 c a 依赖蛋白激酶 c d p k s 被认为在植物抗病反应中起重要作用 是一 类包含丝氨酸与苏氨酸激酶的庞大家族 r o m e i s 等 j 分离了两个c d p kc d n a n t c d p k 2 和 n t c d p k 3 并利用v i g s 对n t c d p k 2 在烟草中的功能进行了验证 c d p k 被抑制的植株表现出超 过敏反应滞后的特征 且无伴随的萎蔫表型 s l a y m a k e r 等 卅以p v x 载体抑制烟草叶绿体中一个 碳酸酐酶 c a 基闲的表达 结果寄主烟草中p t o a v r p t o 介导的免疫抗性也被抑制 j i n 等 心t r v 载体抑制烟草中一个分裂素激活蛋白激酶 m a p k k k 级联反应中的n p k l 基困的表达 结果由 划草n 编码的蛋白赋予烟草对烟草花叶病毒的抗性 该蛋白为t o i l 白细胞介素l 受体 含有富亮 氨酸重复区 西2 雨i r x 基因介导的植物对病毒的抗病性降低 而p t o y f 日c f 4 基因介导的抗病性没有 变化 同样利用v i g s 技术 研究了砌r e d s l n p r l n i m l 类基因在烟草 基因介导的对t m v 抗性反应中的作用 4 k4 研究表明e d s l 可能是t i r n b s l r r t o l l i n t e r l e u k i n 一1r e c e p t o r n u c l e o t i d e b i n d i n 2s i t e l e u c i n e r i c hr e p e a t 类抗性蛋白 该蛋白为t o l l 白细胞介素1 受体 含有核苷酸结合位点和 富亮氨酸重复区 介导的植物对细菌 真菌及病毒抗性反应信号途径中的一个通用组分 另p l l i u 等首次证明由t i r n b s l r r 1 c c n b s l r r c o i l e d c o i lm o t i f n u c l e o t i d eb i n d i n gs i t e l e u c i n e r i c h r e d e a t 该蛋白含有n 端卷曲螺旋型基元 此外含有核苷酸结合位点和富亮氨酸重复区 两类蛋白 分别介导的抗病性反应信号途径存在结点 1 l i u 等 4 3 1 n p e a r t 等1 4 4 1 利用v i g s 技术也证明了 s c f s k p l c u i l i n f b o xp r o t e i n 承l c o p 9 信号体参与j v 基因介导的植物抗病性和防御反应 上述研究 充分表明 v i g s 技术可方便 有效地应用于植物防御和抗病反应信号途径 机理以及其他信号途 j 寻 的研究 b e c l i n 等 利用携带硝酸盐还原酶 n i a 或b 一葡萄糖苷酶 u i d a 基因的黄瓜花叶病毒侵 染烟草与拟南芥 结果表明正在发育的叶片中产生了类似转录后基因沉默的现象 f a l 5 u i d a 表 达均受到抑制 但在分生组织中并没有基因沉默现象发生 h o l z b e r g 等 以大麦条花叶病毒为载体 成功地诱导大麦中尸d s 基因沉默 这是目前惟一将 7 v 1 g s 应用于单子叫 植物的报道 j o n e s 等 4 6 1 对导入转基因烟草中的g f p 基因进行v i g s 研究 分别使用含有g f p 编码序列和 c a m v 3 5 s 启动子序列的v i g s 载体 结果发现二者均可引发g f p 基因沉默 不仅诱发转录后基 因沉默 还均诱发转录水平基因沉默 即出现g f p 基因d n a 的甲基化 但启动子序列诱发的 d n a 甲基化可以遗传 而编码序列诱发的基因沉默不能遗传 s o e n 等 也认为转基因的双链r n a d s r n a 结构可引起内源基因启动子在转录水平沉默 这些结果使v i g s 的机制研究更为复杂 同时表明v i g s 不仅可用于编码序列的功能研究 也可用于非编码序列的启动子功能研究 但在 v i g s 载体中 内含子序列不能诱发目标基因沉默pj 尤其值得关注的是英国j o h n i n n e s 研究中心b a u l c o m b e 领导的研究小组用t r v 载体抑制烟草 的近5 0 0 0 个不同的c d n a 有1 5 的c d n a 被抑制后使植物出现生长发育异常特征 获得了许 多有关这些片段的生物学功能信息 表明v i g s 可应用于大规模的序列己知的植物基因功能研 究 目前我国已有此方面的研究报导 周晓馥等1 4 8 1 利用病毒诱导的基因沉默系统研究了烟草r b e s 基因的功能 5 2 v i g s 技术在植物功能基因组学研究中的应用前景 v i g s 技术独有的优点 有望成为大量分析c d n a 序列功能快速 有效的方法 它的优点是 1 速度快 高通量 对于已知序列或部分己知序列的基因 可将其整合到病毒载体中 在病 毒侵染后的7 2 1 d 就可使非侵染叶片开始呈现v i g s 相关的症状 基因与表型的对应关系可在几 个星期内建立起来 目前发展的基因测序 微阵列 s a g e s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n 等均 为高通量的核酸分析方法 需要高通量的技术提供生物学证据米研究基冈功能 v i g s 町在短州 内人规模地鉴定那些序列已知但功能未知的基晤l 2 对引起致死突变基冈的功能进行研究 传统的止向遗传学研究方法有t d n a 插入与转座子突变体 很多基因都是采用这些方法发现的 5 用这些方法研究细胞基本功能或发育早期基因的功能具一定的困难 因为往往这些相关基因 的突变为致死突变 而v i g s 可解决 或部分解决 该问题 例如p e e l e 等i j 对细胞核增殖抗原 蛋白编码基因的沉默进行了报道 p c n a 是细胞核内d n a 聚合酶6 的辅助蛋白 是d n a 台成所 必需的物质 在细胞增殖过程的s 期含量最高 p c n a 为关键基因 其突变属致死突变 只有采 用v i g s 技术才能有效地研究此类基因的功能 3 与r n a i 技术相比 v 1 g s 的载体构建更为 容易 可直接将目标基因片段插入到v i g s 载体中 无需反向重复结构 反向重复结构有时在细 菌中不稳定 因此v i g s 载体构建更为方便 另外 r n a i 技术需转基因操作 实验周期较长 v 1 g s 技术无需对目标植物进行遗传转化操作 可短期内完成 4 可鉴定多基因家族的基因功 能 植物中某些基因以基因家族的形式存在 在突变体研究中 如果突变基因是一个多基因家族 中的一员 插入突变技术可能不产生预期的表型 只要基冈家旅中有一个成员术发生插入突变 通