细胞生物学教学主要内容二.ppt

细胞生物学教学主要内容二 第一节细胞周期概述 1细胞周期 2细胞周期时相与主要事件 3细胞周期同步化 1细胞周期 细胞周期概述细胞周期指连续分裂的细胞从一次分裂中期到下一次分裂的中期所经历的过程 正常情况下 沿着G1SG2M期运转 细胞周期经历的时间称为细胞周期时间 Tc 从增殖的角度看 细胞可分为3类 连续分裂细胞 周期中细胞 在细胞周期连续运转 上皮组织的基底层细胞 静止期细胞 G0期细胞 终端分化细胞 分化程度很高 一旦生成后 则终生不再分裂 静止期细胞 Go细胞 暂时脱离开细胞周期 停止分裂 去执行一定的生物学功能 给予适当的刺激 又可以重新进入细胞周期进行分裂增殖的细胞 如 肝细胞 G0期是细胞周期以外的一个时期 不含在正常的细胞周期之内 去向未定 向G0期细胞的转变 多发生在G1晚期 而再进入细胞周期发生在G1初期 终端分化细胞 终末分化细胞 分裂程度很高 终生不在分裂 但保持生理机能的细胞 如 横纹肌细胞 G0期细胞和终末分化细胞的界限有时难以划分 有的细胞过去认为属于终末分化细胞 目前可能被认为是G0期细胞 细胞周期 分为4个期 G1期 gap1 指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间 S期 synthesisphase 指DNA复制的时期 G2期 gap2 指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间 M期又称D期 mitosisordivision 细胞分裂开始到结束 3细胞周期同步化 细胞同步化是指自然的 或经人为选择或诱导产生的细胞周期同步化 前者称为自然同步化 后者称为人工同步化 1 多核体如粘菌只进行核分裂 而不发生胞质分裂 形成多核体 数量众多的核处于同一细胞质中 进行同步化分裂 使细胞核达108 体积达5 6cm 疟原虫也具有类似的情况 细胞分裂的类型 无丝分裂 amitosis 又称直接分裂 由Remark 1841 发现于鸡胚血细胞 不涉及纺锤体形成及染色体变化 有丝分裂 mitosis 又称为间接分裂 由Fleming 1882 年首次发现于动物 Strasburger 1880 发现于植物 减数分裂 meiosis 染色体复制一次 细胞连续分裂两次 第二节细胞分裂 一 有丝分裂过程 前期 prophase 前中期 prometaphase 中期 metaphase 后期 anaphase 末期 telophase 胞质分裂 Cytokinesis 概述 前期前期的主要事件是 染色质凝缩 分裂极确立与纺锤体开始形成 核仁解体 核膜消失 前期最显著的特征是染色质通过螺旋化和折叠 变短变粗 形成光学显微镜下可以分辨的染色体 每条染色体包含2个染色单体 早在S期两个中心粒已完成复制 在前期移向两极 两对中心粒之间形成纺锤体微管 当核膜解体时 两对中心粒已到达两极 并在两者之间形成纺锤体 前期 prophase 标志前期开始的第一个特征是染色质开始浓缩 condensation 形成有丝分裂染色体 mitoticchromosome 这种染色体由两条染色单体 chromatid 构成 前期 染色质凝缩 分裂极确立与纺锤体开始形成 核仁解体 核膜消失 S期中心粒已完成复制 在前期移向两极 两对中心粒之间形成纺锤体微管 核膜解体时 中心粒已到达两极 并形成纺锤体 纺锤体有三种微管结构 极体微管 polarmt 两极间的微管 在纺锤体中部重叠 重叠部位结合有分子马达 着丝点微管 kinetochoremt 是从着丝点到另一极的微管 星体微管 astralmt 由中心粒放射出来的微管 植物没有中心粒和星体 其纺锤体称无星纺锤体 有两类马达蛋白参与染色体和分裂极的分离 一类是动力蛋白 dynein 另一类是驱动蛋白 kinesin 植物没有中心粒和星体 其纺锤体叫作无星纺锤体 分裂极的确定机理尚不明确 前中期 prometaphase 指由核膜解体到染色体排列到赤道面 equatorialplane 这一阶段 纺锤体微管向细胞内部侵入 与染色体的着丝点结合 着丝点处的分子马达使染色体向微管的负端移动 前中期核膜解体到染色体排列到赤道面 equatorialplane 上 在光镜下可以看到 此时染色体也就是既向一极移动也向另一极移动 是以振荡的方式移向纺锤体中部的 其原因是姊妹染色单体的着丝点都结合有微管和分子马达 中期 metaphase 所有染色体排列到赤道板 MetaphasePlate 上 标志着细胞分裂已进入中期 确保染色体正确排列在赤道板上机制 着丝粒微管动态平衡形成的张力 后期 anaphase 排列在赤道面上的染色体的姐妹染色单体分离产生向极运动 中期染色体排列到赤道面上 后期指妹妹染色体单体分开并移向两极的时期 分为后期A 后期B两个过程 后期A 动粒微管去装配变短 染色体产生两极运动后期B 极间微管长度增加 两极之间的距离逐渐拉长 介导染色体向极运动 末期 telophase 染色单体到达两极 即进入了末期 telophase 到达两极的染色单体开始去浓缩 核膜开始重新组装 Golgi体和ER重新形成并生长 核仁也开始重新组装 RNA合成功能逐渐恢复 有丝分裂结束 动物细胞胞质分裂 胞质分裂 虽然核分裂与胞质分裂 cytokinesis 是相继发生的 但属于两个分离的过程 例如大多数昆虫的卵 核可进行多次分裂而无胞质分裂 某些藻类的多核细胞可长达数尺 以后胞质才分裂形成单核细胞 动物细胞胞质分裂 1 Inanimalcells furrow 胞质分裂 cytokinesis 开始于细胞分裂后期 在赤道板周围细胞表面下陷 形成环形缢缩 称为分裂沟 furrow 分裂沟的位置与纺锤体极性微管和钙离子浓度升高的变化有关 收缩环 肌球蛋白和肌动蛋白参与 胞质分裂开始时 大量肌动蛋白和肌球蛋白在中间体处组装成微丝并相互组成微丝束 环绕细胞 称为收缩环 contractilering 收缩环收缩 收缩环处细胞膜融合并形成两个子细胞 分裂沟位置的的确立 肌动蛋白聚集 收缩环形成 收缩环收缩 收缩环处细胞融合 2 Inplantcells 与动物细胞胞质分裂不同的是 植物细胞胞质分裂是因为在细胞内形成新的细胞膜和细胞壁而将细胞分开 植物细胞末期近两极处纺锤丝消失 中间微管保留 并数量增加 形成成膜体 来自高尔基体囊泡沿微管转运到成膜体中间 融合形成细胞板 cellplate 囊泡的内含物形成初生壁和中胶层 囊泡膜形成质膜 融合留下的管道形成胞间连丝 动粒与着丝粒 动粒 着丝点 是附在着丝粒上的结构 每条中期染色体上有两个动粒 分别位于着丝粒的两侧 分裂时进入子细胞 S期时动粒复制 电镜下 动粒为园盘状的结构 分内 中 外三层 动粒和着丝粒结构和功能联系紧密 常被称为着丝粒 动粒复合体 1 减数分裂前间期的特点 S期持续时间较长 S期仅复制全部DNA的99 7 99 9 其余的0 1 0 3 将在前期I的偶线期才复制 5000 10000片段 长1000 5000bp L蛋白与DNA片段结合 阻止复制 DNA片段与减数分裂前期染色体配对与重组有关 特点 细胞仅进行一次DNA复制 随后进行两次分裂 意义 既有效获得了父母双方的遗传物质 保持后代的遗传性 又可以增加更多的变异机会 确保生物的多样性 增强生物适应环境变化的能力 称前减数分裂间期或前减数分裂期 premeiosis 间期也可分为G1期 S期和G2期 G2期是有丝分裂向减数分裂转化的关键时期 减数分裂的S期时间较长 部分DNA 约0 3 左右 是在合线期合成的 间期 分裂期 一 减数分裂I1 前期I 持续时间较长 减数分裂的特殊过程主要发生在前期I 通常分为5个时期 细线期 leptotene 偶线期 zygotene 粗线期 pachytene 双线期 diplotene 终变期 diakinesis 1 细线期 染色体呈细线状 具有念珠状的染色粒 端粒通过接触斑与核膜相连 2 偶线期 亦称合线期 是同源染色体配对的时期 概念 联会复合体 synaptonemalcomplex SC 二价体 bivalent 四分体 tetrad 这一时期合成约0 3 左右的DNA 称为Z DNA 3 粗线期 同源染色体的非姊妹染色单体间发生交换的时期 合成P DNA 大小为100 1000bp 编码一些与DNA点切和修复有关的酶类 合成减数分裂期专有的组蛋白 并将体细胞类型的组蛋白部分或全部的置换下来 4 双线期 时间较长 联会的同源染色体相互排斥 四分体清晰可见 开始分离 交叉开始端化 terminalization 联会复合体消失 补充 植物细胞双线期一般较短 许多动物卵细胞中双线期停留的时间非常长 人的卵母细胞在五个月胎儿中已达双线期 而一直到排卵都停在双线期 排卵年龄大约在12 50岁之间 鱼类 两栖类 爬行类 鸟类以及无脊椎动物的昆虫中 双线期的二阶体解螺旋而形成灯刷染色体 这一时期是卵黄积累的时期 5 终变期 二阶体显著变短 由于交叉端化过程的进一步发展 故交叉数目减少 通常只有一至二个交叉 RNA转录停止 核仁此时开始消失 四分体较均匀地分布在细胞核中 核被膜解体 2 中期I 纺锤体装配 3 后期I二价体的两条同源染色体分开 分别向两极移动 同源染色体随机分向两极 染色体重组 人类染色体重组概率有223个 4 末期I5 减数分裂间期 二 减数分裂II可分为前 中 后 末四个四期 与有丝分裂相似 一个精母细胞形成4个精子 一个卵母细胞形成一个卵子及2 3个极体 四 减数分裂与有丝分裂的比较 1 减数分裂发生在有性生殖的组织中 分裂后形成性细胞 有丝分裂发生在正在生长的组织中 分裂后形成体细胞 2 减数分裂的前间期的S期时间长 并且仅合成99 7 的DNA剩余的在合线期合成 有丝分裂的间期短 合成全部的DNA 3 减数分裂的前期I变化复杂时间长 发生同源染色体的配对及非姐妹染色单体之间片段的交换与重组 有丝分裂中每条染色体独立活动 不发生配对及交换现象 4 减数分裂的中期I同源染色体的着丝点位于赤道板的两侧 有丝分裂的中期着丝点位于赤道板上 减数分裂与有丝分裂的异同 5 减数分裂后期I同源染色体分离 而姐妹染色单体不分离 有丝分裂的后期着丝点分离 姐妹染色单体分离成为两条独立的染色体 6 减数分裂的末期II形成四个1n的性细胞 有丝分裂的末期形成两个2n的体细胞 7 减数分裂DNA复制一次 细胞连续分裂两次 有丝分裂DNA复制一次 细胞分裂一次 8 减数分裂在遗传性状上有变化 有丝分裂前后亲代与子代在遗传性状上无变化 A Thecell cyclecontrolsystemtriggers 触发 themajorprocessesofthecellcycle B Thecontrolsystemcanarrestthecellcycleatspecificcheckpoints C Thecellcyclecontrolsystemisbasedoncyclicallyactivedproteinkinases cyclin dependentkinases 周期蛋白依赖的蛋白激酶Cdks Enginemoleculesforcellcycle 第三节细胞周期的调控 Cell CycleControl CDK CDC2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性 故名细胞周期蛋白依赖性激酶 cyclin dependentkinase CDK CDC2又被称为CDK1 可将特定蛋白磷酸化 促进细胞周期运行 又称作细胞周期引擎 如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体 核膜消失 将H1磷酸化导致染色体的凝缩等 在动物中已知7种CDK 均含有一段相似的激酶结构域 这一区域有一段保守序列 即PSTAIRE 与周期蛋白的结合有关 CDK1的调节与活化 CAK CDK1 ActivitingKinase M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累 结合cyclinB的CDK1被Wee1将Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性 使CDK cyclin不断积累 M期CDK的激活 CDK1的调节与活化 CAK CDK1 ActivitingKinase M期CDK的激活 在M期 Wee1的活性下降 CDC25使CDK去磷酸化 去除了CDK活化的障碍 CDK的激活需要Thr161的磷酸化 它是在CDK激酶 CDKactivatingkinaseCAK 的作用下完成的 细胞周期调控系统的主要作用 在适当时候激活细胞周期各个时相的相关酶和蛋白 然后自身失活 正调控 确保每一时相事件的全部完成 负调控 对外界环境因子起反应 如多细胞生物对增殖信号的反应 第十四章程序性细胞死亡与细胞衰老 一 2013 5 26 一动物细胞的程序性死亡 概念 体内外因素诱导下 由基因严格调控而发生的一种生理性细胞自杀过程 又称程序性细胞死亡 programmdcelldeath PCD 动物细胞的死亡方式主要包括3种1凋亡 Apoptosis 2坏死 Necrosis 3自噬 Autophage 定义 由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡 1 2动物细胞凋亡过程中的形态学变化 1 凋亡的起始细胞膜变化 细胞凋亡的特征是细胞首先变圆 随即与邻周细胞脱离 失去微绒毛 细胞膜完整 微绒毛 细胞突起和细胞表面皱褶消失 胞膜迅速发生空泡化 blebbing 内质网不断扩张并与胞膜融合 形成膜表面的芽状突起 称为出芽 budding 2 凋亡小体的形成 细胞膜内陷将细胞自行分割为多个外有膜包裹 内涵物不外泄的细胞凋亡小体 凋亡小体 apoposisboby 由透亮空泡和不透光的浓密的核碎片两部分组成 3 凋亡小体被清除 被吞噬细胞或邻周细胞所识别 吞噬 或自然脱落而离开生物 不引起炎症反应和次级损伤 1 3细胞凋亡的生理病理意义 确保正常发育 生长 清除多余的 失去功能价值的细胞 指趾间组织细胞 维持内环境稳定 清除受损突变细胞 自身反应细胞 衰老细胞 发挥积极的防御功能 感染病毒细胞凋亡 阻止病毒复制 2细胞坏死 特征 线粒体膨胀 细胞骨架降解 溶酶体释放酶 细胞核内染色质沉淀靠近核膜边 蛋白质合成下降 由于膜破裂 出现炎症反应 一般过程 因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜 或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞 从而导致细胞吸水膨胀 最终破膜而死 细胞凋亡与坏死的区别 坏死凋亡 1 性质 2 诱导因素 强烈刺激 随机发生 较弱刺激 非随机发生 3 生化特点 4 形态变化 5 DNA电泳 6 炎症反应 7 凋亡小体 8 基因调控 被动过程 无新蛋白合成 不耗能 主动过程 有新蛋白合成 耗能 细胞结构全面溶解 破坏 细胞肿胀 胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩 核固缩 弥散性降解 电泳呈均一DNA片状 DNA片段化 180 200bp 电泳呈 梯 状条带 溶酶体破裂 局部炎症反应 溶酶体相对完整 局部无炎症反应 有 病理性 非特异性 生理性或病理性 特异性 无 有 无 3细胞自噬 自噬体 autophagosome 细胞内衰老的细胞器等被内质网或高尔基体的膜包裹而形成的小体 细胞中出现大的双层膜包裹的自噬泡 称为自噬小体 autophagosome 双层膜来自内质网或细胞质中的膜泡 自噬小体中包裹着整个的细胞器和部分细胞质 自噬小体与溶酶体融合后 内含物被溶酶体中的水解酶消化 动物细胞为了维持细胞内环境的动态平衡 需要不断降解功能失常或不需要的细胞结构 如各种蛋白 细胞器以及各种胞质组分 通常 寿命较短的蛋白如调控蛋白等通过泛素 蛋白酶体系统进行降解 而寿命较长的细胞结构及蛋白则通过细胞自噬途径 由溶酶体进行降解 自噬作用对细胞的生命活动有什么意义 酶系统的更新 细胞质中某些暂时不需要的酶系统 需要通过自噬作用进行更新 旧细胞器的清除 细胞器都有一定的寿命 为了保证细胞正常的代谢活动 必须不断地清除衰老的细胞器和生物大分子 很多生物大分子的半衰期只有几小时或几天 肝细胞中线粒体的寿命平均约10天左右 参与细胞发育 如红细胞发育成熟后 所有的细胞器都要通过自噬作用被清除 应激反应 在细胞饥饿条件下 自噬作用也特别强 主要是为细胞提供能量 维持细胞的生命活动 4细胞凋亡的信号转导 Caspase依赖性途径Caspase非依赖性途径当受到凋亡诱导因素作用 两种途径均会被激活 caspase依赖的细胞凋亡又包括三种方式 受体介导的细胞凋亡 外源通路 线粒体介导的细胞凋亡 内源通路 内质网介导的细胞凋亡 内源通路 Caspase依赖性细胞凋亡 途径主要有两条 通过胞外死亡受体信号激活细胞内的凋亡酶caspase 外源途径 通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase 内源途径 1 外源途径 细胞表面的凋亡受体是属于肿瘤坏死因子受体 TNFR 家族的跨膜蛋白 它们包括Fas Apo 1 CD95 TNFR1 DR3 WSL DR4 TRAIL R1和DR5 TRAIL R2 其配体属于TNF家族 目前已比较清楚的是Fas介导的细胞凋亡途径 Fas基因介导的细胞凋亡机制 3种机制 Fas基因介导的细胞凋亡过程可能是三聚体形式FasL配体和Fas受体结合激活Fas 被激活的Fas通过死亡功能区之间的相互作用和FADD受体蛋白结合 FADD又通过它的MORT结构域 同凋亡蛋白酶caspase8结合 激活caspase8活性 后者再去激活其他的caspase蛋白酶 这样 通过这一级联系统的凋亡信号传递作用 最终导致细胞凋亡 Fas具有三个富含半胱氨酸的胞外区和一个称为死亡结构域 Deathdomain DD 的胞内区 Fas的配体FasL Fasligand 与Fas结合后 Fas三聚化使胞内的DD区构象改变 然后与接头蛋白FADD Fasassociateddeathdomain 的DD区结合 FADD的N端DED区 deatheffectordomain 就能与Caspase 8 或 10 前体蛋白结合 形成DISC death inducingsignalingcomplex 胞外区 胞内区 FADDN端通过DED区 deatheffectordomain 与Caspase 8前体蛋白和CAP3结合 引起caspase 8 10通过自身剪激活 它们启动caspase的级联反应 使caspase 3 6 7激活 这几种Caspase可降解胞内结构蛋白和功能蛋白 最终导致细胞凋亡 Fas介导的细胞凋亡还可能以神经酰胺作为第二信使传递信号 通过激活一系列蛋白激酶和转录因子最终激活共同信号传递通路 引起细胞凋亡 这一过程被称为神经鞘磷脂循环 另外有丝分裂原蛋白激酶 MAPA 的两个亚类JNK和ERK也可以传递Fas的凋亡信号 5细胞凋亡的检测 诱发因素 抑制因素 形态学观察 生物化学检测 分子生物学检测 免疫学检测 检测手段 细胞凋亡的形态学分析 细胞凋亡的形态学变化主要表现为 细胞皱缩 cellshrinkage 失去细胞连接 celljunction 微绒毛 microvilli 消失 发泡 blebbing 染色质浓集并靠近核膜 形成沿核膜收缩的新月状体 crescents 形成凋亡小体 apoptoticbody 等 细胞凋亡的形态学检测方法 形态学简单检测方法 1 HE染色 光镜观察 凋亡细胞呈圆形 胞核深染 胞质浓缩 染色质成团块状 细胞表面有 出芽 现象 2 丫啶橙 AO 染色 荧光显微镜观察 活细胞核呈黄绿色荧光 胞质呈红色荧光 凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧 可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体 3 台盼蓝染色 如果细胞膜不完整 破裂 台盼蓝染料进入细胞 细胞变蓝 即为坏死 如果细胞膜完整 细胞不为台盼蓝染色 则为正常细胞或凋亡细胞 此方法对反映细胞膜的完整性 区别坏死细胞有一定的帮助 4 透射电镜观察 可见凋亡细胞表面微绒毛消失 核染色质固缩 边集 常呈新月形 核膜皱褶 胞质紧实 细胞器集中 胞膜起泡或出 芽 及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象 2 DNA凝胶电泳法检测DNA降解 DNA降解过程的特点 1 发生于凋亡早期 由内源性核酸内切酶激活引起2 DNA在核小体连接部位断裂 产生180 200bp为最小单位的单体或寡聚体片断3 DNA碎片可被细胞膜包裹 形成凋亡小体 原理 凋亡细胞降解产生一系列规则的DNA片断 其电泳结果呈典型的 梯状带 ladder 而坏死或凋亡后坏死细胞的DNA分解是随机的 产生的碎片分子量大小不一 在电泳时形成 涂片状 smear 普通琼脂糖凝胶电泳 Southernblotting 放射自显影 32PdATP或32PdCTP连接到DNA片断的3 端 生化改变 特点 cysteine containingaspartate specificprotease 含半胱氨酸的天门冬氨酸特异水解酶 apoptosis 凋亡过程与调控 和凋亡有关的两个酶 作用 切割染色质DNA DNase 特点 Ca2 Mg2 增强活性 Zn2 抑制其活性 Caspases 作用 灭活凋亡抑制物 水解蛋白质结构 形成凋亡小体 水解凋亡相关活性蛋白 使抑制凋亡因子失活 如CAD ICAD破坏细胞结构 如Lamina 形成凋亡小体将调节区与催化区分离 使蛋白失活 如Gelsolin Caspase作用机理 Caspases家族简介 1993年Yuan从哺乳类细胞中发现第1个Ced 3同源分子 叫白细胞介素 1 转换酶 Interleukin 1 ConvertingEnzyme ICE Pro ICE含404个氨基酸 分子量45KD 在一定形式下可自身催化产生20KD和10KD二个片段 聚合形成 p20 2 p10 2杂四聚体 为活化的ICE 到1998年底为止共发现有14个Ced 3同源分子 分别定名为Caspase1 14 caspases蛋白酶半胱氨酸蛋白酶家族 称为caspases Caspase可译为胱冬肽酶家族 与线虫CED 3同源的调控哺乳动物细胞凋亡的蛋白酶家族 体内均以酶原 相对分子质量30000 50000 形式存在 包括3个功能区 N端区 抑制区域 大亚单位 约20000 小亚单位 约10000 死亡区域 被激活的过程相似 即通过功能区间特异位点的蛋白酶解 继而以大小亚单位形式形成异源二聚体 Caspases的分子的结构特征 Caspases的分子均具有下列的结构特征 以无活性的Pro Caspases形式存在 在Pro Caspases的N端均含有一段P2 P27的前区域 Prodomain 活性形式均是由2个大亚基 17 20KD 和2个小亚基 10 12KD 组成的杂四聚体 一分子Pro Caspase只能分裂产生1个大亚基和1个小亚基 在大亚基的C端均含有QACXG X R Q或G 的活性中心 其中半胱氨酸 C 是必需氨基酸 故Caspase是属于半胱氨酸蛋白酶类 TUNEL法检测TUNEL TdTmediateddUTPnickendlabeling 终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记技术 原理 在TdT的作用下 带有标记物的dUTP被连接在断裂DNA3 末端 然后通过相应的方法检测标记物 从而判断是否有凋亡发生 应用范围 石蜡包埋的组织切片 冰冻组织切片 培养细胞 组织中分离的细胞 ELISA法原理 以抗组蛋白抗体包被微孔板壁 加入标本 凋亡细胞的核小体可与抗体结合 再加入抗 DNA片断 POD复合物 与核小体中的DNA片断结合 最后加入POD显色底物 以酶标仪测定光密度以进行定量分析 细胞凋亡发生机制 1氧化损伤2钙稳态失衡3线粒体损伤 一 氧化损伤机制 氧自由基可破坏机体正常的氧化 还原的动态平衡 造成生物大分子的氧化损伤 干扰正常的生命活动 形成严重的氧化应激状态 后果 诱导细胞凋亡 氧化损伤引起细胞凋亡的依据 各种氧化剂 H2O2 可直接诱导细胞凋亡 抑制超氧化物歧化酶 SOD 活性可诱导细胞凋亡 抗氧化剂 VitE 胡萝卜素等 可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素 TNF 电离辐射 引起的细胞凋亡 引起DNA损伤 激活P53基因 引起DNA损伤 活化多聚ADP核糖合成酶 耗竭辅酶 NAD 消耗大量ATP 攻击细胞膜不饱和脂肪酸 脂质过氧化 细胞膜损伤或产生过氧羟基24碳四烯酸 激活Ca2 Mg2 依赖的核酸内切酶 细胞膜损伤 Ca2 内流增多及损伤线粒体 通透性增加膜电位改变 活化核转录因子NF B AP 1 加速凋亡相关基因表达 氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制 细胞钙稳态失衡引起细胞凋亡依据 各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程 凋亡发生时胞浆Ca2 浓度显著上升 并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用 核酸内切酶激活 需钙蛋白酶 磷脂酶 谷氨酰胺转移酶的激活 细胞膜的空泡化 钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病 神经退行性疾病 2钙稳态失衡引起细胞凋亡 激活Ca2 Mg2 依赖的核酸内切酶 降解DNA链 激活谷氨酰胺转移酶 催化肽链间的酰基转移酶 肽链间形成共价键 使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联 有利于凋亡小体形成 激活核转录因子 加速凋亡相关基因表达 Ca2 在ATP的配合下使DNA链舒展 暴露核小体之间的连接区内的酶切位点 有利于DNA内切酶切割DNA 钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制 2钙稳态失衡引起细胞凋亡 线粒体的改变 线粒体内膜通透性增大 线粒体内膜跨膜电位 m 下降 能量代谢水平显著降低线粒体改变引起细胞凋亡依据 抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡 在细胞核出现凋亡改变之前 常先有线粒体内膜跨膜电位 m 下降 阻止线粒体通透性的改变 可防止细胞凋亡 Bcl 2 3线粒体损伤 第四节细胞衰老 1 细胞衰老的概念一般指的是复制衰老 体外培养的正常细胞经过有限次数分裂以后 停止分裂 细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的过程 这个改变过程即老化过程 19世纪魏斯曼学说 有机体终究会死亡 因为组织不可能永远能够自我更新 细胞凭借分裂来增加数量的能力是有限的 20世纪40 50年代Carrel和Ebeling学说 细胞不死通过培养鸡心脏细胞无限增殖 使得这观点卷土重来 后来 L系小鼠细胞和HeLa细胞系的建立 更巩固了这种观点 Hayflick界限 Hayflicklimitation 细胞增殖能力和寿命是有限的 细胞 至少是培养的细胞 不是不死的 而是有一定的寿命 它们的增殖能力不是无限的 而是有一定的界限 这就是著名Hayflick界限 二 细胞衰老的特征 一 形态变化1细胞核变化 在衰老变化中细胞核结构的最明显变化是核膜内折 电镜检测可见衰老细胞核形状不规则 内陷和断裂 在体内细胞中也观察到核膜的不同程度的内折 神经细胞尤为明显 这种内折随年龄增长而增加 最后可能导致核膜崩解 染色体固缩化是衰老细胞核中另一个重要变化 在衰老细胞中 细胞核固缩 还常常出现核内容物 核质染色加深 核的细致结构逐渐消失 核仁也发生明显的变化 2内质网的变化在衰老细胞中 内质网排列变得无序 膜腔膨胀扩大甚至崩解 膜面上核糖体数量减少 3衰老过程中线粒体的变化多数研究工作表明 细胞中线粒体的数量随着年龄的增大而减少 而其体积则随着年龄的增长而增大 衰老的神经元 肝脏细胞和肌细胞的线粒体数目减少 但体积增大 同时 线粒体的结构也发生变化 肿胀空泡化 内部嵴大大减少 线粒体崩解是细胞衰老变化的重要标志 线粒体变化主要是自由基损伤的结果 因为线粒体的呼吸链是损伤性自由基的发源地 线粒体DNA成为自由基的主要攻击目标 使线粒体DNA呈逐渐减少或使线粒体DNA的转录产物逐渐减少 直接影响与线粒体呼吸和能量转换过程有关的蛋白质的合成 造成ATP合成和细胞能量供应不足 引起细胞功能紊乱 直到细胞死亡 4致密体的产生由溶酶体或线粒体转化而来 5膜系统的变化膜相年轻的功能健全的细胞的膜相是典型的液晶相 这种膜的脂双层比较柔韧 脂肪酸链能自由移动 每个脂质分子与起想林分子见的文职交换极其频繁 埋藏于其中的蛋白质分子表现出最大的生物学活性 细胞间间隙连接衰老细胞中减少 使得细胞间代谢协作减少了 细胞膜P面的膜内颗粒衰老细胞中明显减少 这这种变化反映了衰老细胞中膜内颗粒在膜平面上进行侧向运动能力的丧失 小结 二 分子水平的变化 1 DNA 复制与转录受阻 端粒DNA mtDNA缺失 DNA氧化 断裂 缺失和交联 甲基化程度降低 2 RNA 含量降低 3 蛋白质 含成下降 发生修饰 交联 4 酶分子 活性中心被氧化 金属离子丢失 酶分子的二级结构 溶解度 等电点发生改变 酶失活 5 脂类 不饱和脂肪酸被氧化 二衰老过程中分子水平总体改变情况 细胞衰老的主要特征 1 细胞内水分减少 新陈代谢减慢2 有些酶的活性降低3 细胞内的色素逐渐积累 信息传递受阻4 细胞呼吸减慢 核增大 染色质收缩 染色加深 5 细胞膜通透性改变 运输功能降低 细胞衰老的分子机制 1遗传学派观点 1 端粒和端粒酶 2 基因学说2差错学派观点 1 氧化损伤 2 代谢废物积累 差错学派观点 差误成灾学说是由Orgel明确提出的 认为在DNA复制 转录和翻译中发生误差 这种误差可以不断扩大 造成细胞衰老 死亡 如DNA转录mRNA的过程发生微小的差异 带有该微小差异的mRNA会翻译出进一步偏离的蛋白质 该蛋白质如果属于DNA聚合酶会合成差异程度更大的DNA 这样的差错经过每一次信息传递都扩大一些 形成恶性循环 使细胞内积累许多差错分子造成灾难 细胞正常功能不能发挥 致使细胞衰老 死亡 1 端粒和端粒酶 细胞有限分裂学说 Hayflick 极限 即细胞最大分裂次数 L Hayflick 1961 报道 人的成纤维细胞在体外培养时增殖次数是有限的 60 70代 细胞增殖次数与端粒DNA长度有关 端粒学说由Olovnikov提出 认为细胞在每次分裂过程中都会由于DNA聚合酶功能障碍而不能完全复制它们的染色体 因此最后复制DNA序列可能会丢失 最终造成细胞衰老死亡 端粒是真核生物染色体末端由许多简单重复序列和相关蛋白组成的复合结构 具有维持染色体结构完整性和解决其末端复制难题的作用 端粒酶是一种逆转录酶 由RNA和蛋白质组成 是以自身RNA为模板 合成端粒重复序列 加到新合成DNA链末端 在人体内端粒酶出现在大多数的胚胎组织 生殖细胞 炎性细胞 更新组织的增生细胞以及肿瘤细胞中 正因如此 细胞每有丝分裂一次 就有一段端粒序列丢失 当端粒长度缩短到一定程度 会使细胞停止分裂 导致衰老与死亡 端粒是由简单的富含T和G的DNA片段的重复序列组成 人类端粒结构为染色体末端重复上千次的TTAGGG序列所组成 DNA聚合酶不能完成线性染色体末端DNA的复制 由于RNA引物的原因 DNA聚合酶一定会留下染色体末端的一段DNA 一段端粒 使其不被复制 那么真核细胞染色体末端的端粒就会随着细胞分裂而缩短 这个缩短的端粒传给子细胞后 随着细胞的再次分裂进一步缩短 染色体末端端粒随着每次细胞分裂逐渐缩短 直到不能分裂走向衰老 人类种系细胞一生中维持分裂 不断增殖的原因是该细胞表达端粒酶 端粒酶以自身一段RNA为模板 通过逆转录酶 转录出一段端粒片段并使之连接于染色体的端粒末端 使端粒不缩短 维持完整 从而保持了细胞的永生化生长 在单细胞生物 多细胞生物的种系细胞中都显示出弱的端粒酶活性 而在人类正常组织的体细胞均无端粒酶活性 值得注意的是 在绝大多数恶性肿瘤细胞中显示明显的端粒酶活性 这可能是肿瘤细胞具有永生性生长的原因之一 1990年 Harley等人通过人工合成的 TTAGGG 3作为探针 对不同年龄的人的成纤维细胞的端粒长度测量 提出了 有丝分裂钟学说 即 随着细胞的每次分裂 端粒不断缩短 当端粒长度缩短到一定阈值时 细胞就进入衰老 但是 不少研究报告不支持这一学说 如某些小鼠终生保持较长的端粒 也没有因此而获得延长寿命 2 基因学说 子女的寿命与双亲的寿命有关 各种动物都有相当恒定的平均寿命和最高寿命 成人早衰症 平均39岁时出现衰老 47岁生命结束 婴幼儿早衰症 1岁时出现明显的衰老 12 18岁生命结束 早衰症患者体内解旋酶发生突变 Caenrhabditiselegans的平均寿命仅3 5天 该虫age 1单基因突变 可提高平均寿命65 提高最大寿命110 SGA1基因 WRN基因与衰老 重复基因失活学说 如哺乳动物rRNA基因数随年龄而减少 SGS1基因对酵母的野生型和sgs1突变株分裂次数的研究得出该基因的缺陷或丧失明显影响了寿命 对突变株核仁的观察研究得出转录的SGS1蛋白向核仁转移 抑制其分裂 可延长寿命 WRN基因对Werner综合症的研究得出 WRN基因是维持正常寿命所必须的 因此 这两个基因是保证细胞正常生命周期所必需的 如果发生突变 会引起衰老的提前发生或寿命的缩短 衰老基因学说 衰老基因与抗衰老基因衰老基因人类 载脂蛋白E 4基因 淀粉样蛋白基因p16 p53p21RB基因2 抗衰老基因WRNbcl 2 差错学派 自由基或活性氧集团或分子 Reactiveoxygenspecies ROS 氧化性损伤学说 haman衰老自由基理论 指那些在原子核外层轨道上具有不成对电子的分子或原子基团 通常所说的自由基是指氧自由基 如 02 OH H2O2等 它们的高度活性 引发脂质 蛋白质和核酸分子的氧化性损伤 从而导致细胞结构的损伤乃至破坏 如 氧化质膜的不饱和脂肪酸 从而导致膜结构破坏 膜的运输功能紊以致丧失 自由基对细胞的损伤性作用 细胞中的自由基若不能及时除去 过多的自由基对许多细胞造成损伤 例如 它们能使质膜中的不饱和脂肪酸氧化 使蛋白质中的巯基氧化造成蛋白质交联 变性和酶钝化 使糖类化合物降解 使DNA链断裂 交联 碱基羟基化和碱基切除等等 同时还能抑制蛋白质 核酸和脂肪酸的生物合成 其中可能对磷脂的氧化和对DNA造成损伤是主要的 也是很致命的 清除ROS 延长寿命 SOD 超氧化物岐化酶 抗氧化物物质如维生素E 维生素C等 但是 进一步的研究使人们对这一类抗氧化因子对衰老的影响提出了疑问 实验中去除这种基因 并未引起衰老的加速 代谢废物积累 如 脂褐质线粒体与衰老 mtDNA中存在衰老DNA Sen DNA mtDNA突变积累与衰老有关自由基攻击 导致DNA 蛋白质变异 正常细胞内存在清除自由基的防御系统 酶系统 超氧化物歧化酶 SOD 过氧化氢酶 CAT 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH PX 非酶系统 维生素E 醌类等电子受体 线粒体产生ATP为细胞内进行的大多数生命过程提供能量 不幸的是线粒体从营养物中获取能量的同时作为副产物产生自由基 细胞中 许多自由基是由线粒体制造出来的比如超氧自由基O2 点代表不配对的电子 O2 本身有破坏作用还能转为成H2O2 虽然H2O2不是自由基但可形成氢氧自由基 OH 当自由基一旦形成就能损伤细胞内的蛋白质 脂类和DNA 其中以线粒体中合成ATP的组分和线粒体DNA首当其冲 它们更易受到自由基的损伤 这是因为线粒体DNA处于自由基产生的邻近部位 故易被氧化攻击 此外线粒体DNA不像核DNA那样被包围着的蛋白质保护 因而线粒体DNA比核DNA更易受氧化损伤 线粒体自由基假说认为自由基引起的线粒体损伤最终干扰了ATP产生的效率并增加了自由基的输出 自由基加速了线粒体组分的氧化损伤因而进一步抑制了ATP的产生 机体虽然具有一定的抵消氧化剂影响的能力 比如细胞产生抗氧化酶能解毒自由基 细胞制造其它的酶也能修复氧化损伤 但是 损伤是随着时间累积的 大分子交联学说 该学说由Bjorksten于1963年提出的 后经Verzar加以发展 其主要论点是 机体中蛋白质 核酸等大分子可以通过共价交叉结合 形成巨大分子 这些巨大分子难以酶解 堆积在细胞内 干扰细胞的正常功能 这种交联反应可发生于细胞核DNA上 也可以发生在细胞外的蛋白胶原纤维中 目前有一些证据支持交联学说 皮肤胶原的可提取性以及胶原酶对其消化作用随增龄降低 而其热稳定性和抗张强度则随年龄的增高而增强了 大鼠尾腱上的条纹数目及所具备的热收缩力随年龄的增高而增加 溶解度却随年龄增高而降低 这些结果表明 在年老时胶原的多肽链发生了交联 并日益增多 该学说与自由基学说有类似之处 亦不能说明衰老发生的根本机制 第十四章细胞分化与基因表达调控 西北大学生命科学学院细胞生物学课题组 2013 6 1 第一节细胞分化 1细胞分化的基本概念 2影响细胞分化的因素 3细胞分化与胚胎发育 细胞分裂 细胞数目增多的过程 分裂产生的子细胞与亲代细胞在形态结构和功能上往往一样 细胞分化 细胞种类增多的过程 使细胞由非专一性 非特化性 状态向形态和功能的专一性 特化性 状态转变 成为具有不同表型结构的各种类型细胞 1 1细胞分化是基因选择性表达的结果 遗传物质选择性丢失 选择性表达 在同一时间内不是所有的基因都具活性 而是有的有活性 有的无活性 有些细胞是这部分基因有活性 有些细胞则是另外一些基因有活性 分子杂交技术 1 2组织特异性基因与管家基因 管家基因 house keepinggenes 是指所有细胞中均要表达的一类基因 其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的 如微管蛋白基因 糖酵解酶系基因 核糖体蛋白基因等组织特异性基因 tissue specif