细胞周期调控的分子机制.doc

河北大学2007届学年论文细胞周期调控的分子机制摘 要细胞周期是生命活动中的一个最重要的过程，对它的研究是现代生命科学研究的一个重要内容。细胞周期的动力主要来自于细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)，它的活性则是通过细胞周期蛋白(Cyclin)和周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI)进行调节。关键词：细胞周期 分子调控 细胞周期蛋白 周期蛋白依赖性蛋白激酶ABSTRACTCell cycle is one of the most important processes of the life. It is an important content of the study of modern life science research. The main driving force of the cell cycle comes from the cyclin-dependent kinase (CDK) and its activity is through the cyclin and cyclin-dependent kinase inhibitor (CKI) to regulate.Key words: Cell cycle Molecular Regulation Cyclin Cyclin-dependent protein kinase一 前言近年来,以Cyclin-CDK为中心的细胞周期分子调控机制已经确立并取得了很大的进展,即细胞周期蛋白(Cyclin)与细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)结合后通过磷酸化调节一系列靶分子,这些下游分子激发一系列下游事件的贯序发生,最终导致DNA的复制和有丝分裂,使细胞周期严格按照G1-S-G2-M循环运转。另一方面在细胞周期正常事件受到干扰时,细胞会采取补救措施进行调控,杜绝差错的发生。例如,在哺乳类细胞中,中等剂量X辐射导致的DNA损伤,可以通过G1/S期关卡点或G2/M期关卡点来阻断细胞周期的异常运行,以赢得充分的时间来修复损伤的DNA。这就是细胞周期关卡调控(checkpoint control)1。关卡调控通过监测细胞分子事件的程序,也即保证细胞周期在上游事件正确完成的前提下,才启动下游事件,确保细胞周期期相转换的正确性,与Cyclin/CDK中心控制体系比较,它具有更为特殊的生物学意义2。由于细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)通过控制Cyclin/ CDK激酶复合物的有序激活和失活从而抑制细胞分裂并阻滞细胞周期期相的转变,CKI又被视为细胞周期关卡调控元件,对细胞周期进行负调控,特别是在G1/S期、G2/M期、中期/后期转换点起重要作用。对于多细胞真核生物而言,细胞增殖还受机体的整体调控,所以各个细胞增殖的调控除了上述细胞内源性因子的调控以外,还有细胞外源性因子的调控。二 本论2.1细胞周期及其中心控制体系2.1.1细胞周期细胞周期(cell cycle)是保证细胞正确增殖的过程,对一个细胞而言,在分裂过程中获得生存所必需的物质是最关键的环节,尤其是合成遗传所需物质。细胞周期可划分为4个时相,即G1、S、G2和M期。在G1期中,细胞不断生长发育。当达到一定体积时,细胞就会进入DNA合成(S)期,细胞内遗传物质开始复制,最终形成两套完整的染色体组,细胞便进入有丝分裂前的准备(G2)期。在有丝分裂(M)期,染色体组分离、细胞质分裂,两套染色体平均分配给两个子细胞,从而完成一个细胞周期。2.1.2细胞周期调控理论的提出生理学家和胚胎学家根据对海底无脊椎动物及两栖类卵细胞的研究结果，认为细胞周期受一种不断在有丝分裂和间期(包括Gl期、S期和G2期)之间来回摆动的生化反应机制的控制，称之为时钟。理论家通过对停止在细胞周期特定阶段的酵母突变体的分析，认为细胞周期是一系列依赖性事件准确而有序地进行的过程，即后一事件的起始依赖于前一事件的完成，如有丝分裂的起始必须依赖于DNA复制的完成，称为骨牌(domino)理论3。两种理论似乎很不一致，但细胞融合实验研究结果发现，将M期的细胞与处于间期的任何阶段的细胞融合后，可使处于间期的细胞出现有丝分裂现象，表明有丝分裂和间期的细胞质是不同的，而有丝分裂的细胞质控制所有间期的细胞质的活动，此现象支持时钟理论;另一方面，将处于两个不同间期(如Gl和G2)细胞进行融合，则处于G2期的细胞必须等Gl期细胞进人G2期后才能使细胞周期继续进行，此现象支持骨牌理论。后来就将这两种理论综合起来，认为所有细胞的细胞周期都是受一种以磷酸化一去磷酸化为基础的中心控制体系的调控4。2.1.3中心控制体系的分子基础中心控制体系是由专门调控细胞周期的一系列基因表达产物所组成，其中以周期素(Cyclin)基因和周期素依赖性蛋白激酶(CDK)基因这两大基因家族最为关键。2.1.3.1周期素(Cyclin)Timothy Hunt(1983)首次发现海胆卵受精后，其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡:在每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后突然消失，下轮间期时又重新合成，故命名为周期蛋白(Cyclin)5。后来在青蛙、爪蟾、海胆、果蝇和酵母中均发现类似的情况，各类动物来源的细胞周期蛋白mRNA均能诱导蛙卵的成熟。在高等真核细胞中，Cyclin分为A、B、C、D和E五类，它们分别在细胞周期的不同时期中合成、积累。CyclinA由432个氨基酸组成，其中210295位氨基酸为“Cyclin box” (细胞周期蛋白盒)，在N末端47-55位氨基酸序列称为“destruction box (毁灭盒)，其保守序列RXXLXXIXN可特异性地被泛素识别，在M期可通过泛素途径降解。CyclinA与CDK2结合，在GlS转变过程中被活化，从而调节细胞增殖。此外，CyclinA也与p34cdc2结合，在G2M转变过程中与CyclinB- p34cdc2复合体一起协同作用。CyclinB在人细胞中包括Bl和B2两种亚型。CyclinB1由433个氨基酸组成，其201-288位氨基酸序列为“Cyclin box。其N末端4250位氨基酸序列为“毁灭盒”，在M期也通过泛素途径降解。CyclinB1在S晚期开始合成，在G1M转变过程中，CyclinB1与p34cdc2结合，通过p34cdc2上Thr14和Tyr15的脱磷酸化而活化。CyclinC由303个氨基酸组成，其58-136位氨基酸为“Cyclin box”，在其C末端存在一个PEST序列。CyclinC可能在G1期起作用，但目前尚末分离到与其相对应的CDK。已发现的CyclinD家族包括D1、D2和D3三个亚型。编码人类CyclinD1的基因位于染色体11q13上，全长约15kb，含有5个外显子，启动子区域无TATA盒，但却含有转录因子SP1的结合位点，其表达产物由295个氨基酸组成。在Gl中期，向受血清刺激的成纤维细胞中微注射CyclinDl的反义质粒或抗体可抑制CyclinD1的功能，阻止细胞进人S期，表明D型Cyclin在GlS转变中起重要作用。CyclinD2和CyclinD3分别由290和292个氨基酸组成，在三类D型Cyclin中的第56141位氨基酸均为保守序列，称为“Cyclin box”。在CyclinD的C末端存在一个富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)残基的序列，称为PEST序列，该序列在蛋白质降解过程中具有重要作用。CyclinD的N末端则含有一段与SV40T抗原和腺病毒E1A等病毒DNA的原癌蛋白共同的序列:Leu-X-Cys-x-Glu(x为其它氨基酸残基)，该序列是与Rb蛋白结合的部位。CyclinE由395个氨基酸组成，其中128-215位氨基酸序列为“Cyclin box”，在C末端也含有一个PEST序列。在Hela细胞中CyclinE的量在G1中期上升，G1晚期或S早期达到高峰;在Gl晚期，CyclinE可与CDK2结合对于细胞顺利进入S期具有重要作用。射线可使CyclinE-CDK2激酶活性丧失，从而阻滞细胞周期进程。2.1.3.2 CDKs(Cyclin-dependent Kinases)早在20世纪70年代初期，Johnson等就曾研究发现当把同步到间期不同时期的Hela细胞与M期的Hela细胞相融合时，会产生早熟染色体凝集的现象，提示着M期细胞中存在着一些可诱导间期细胞提前进人分裂期的因子，这种因子被称为M期促发因子(M- phase promoting factor，MPF)，遍存于所有真核生物的M期细胞中。同时，在以酵母为材料的研究中发现了一些与细胞周期调控有关的基因，这些基因被称之为细胞分裂周期基因(cell division cycle gene，cdc)。1987年，纳斯从人体中分离到与酵母cdc2同源的基因，并命名为CDK，该基因的编码产物为周期蛋白依赖性激酶蛋白家族中的一员。CDK在进化上高度保守，其活性调节由其它蛋白的磷酸化和去磷酸化决定，即磷酸基仅连在蛋白分子上或从蛋白分子上脱落下来6，从而使细胞沿着细胞周期顺序不断地进行分裂。后来发现，MPF之所以能够诱导期细胞提前进人分裂期，就是因为其具有使多种底物蛋白磷酸化的功能，即属于蛋白激酶，现已研究证实，MPF是由催化亚基和调节亚基两部分所组成，其催化亚基是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)7。CDK是细胞周期运转必须的蛋白质。在单细胞真核生物中，负责细胞周期内蛋白质磷酸化的CDK通常只有一种，在芽殖酵母中是cdc28，在裂殖酵母中是cdc2。在多细胞真核生物中，参与细胞周期的CDK有多种。在人体细胞中，控制Gl期的主要是CDK2、CDK4和CDK6;S期和G2期依赖于CDK2;而M期主要由CDK1(相当于裂殖酵母的CDC2)负责。对CDK单体及CDK-Cyclin复合体的晶体结构分析表明，CDK以单体形式存在时，其催化中心被掩盖在内部，因而没有活性，与Cyclin的结合导致了CDK结构的变化，催化中心暴露出来，形成了有活性的CDK。2.2中心控制体系对细胞周期的调控2.2.1 CDK活性的调节由于细胞周期的各个时期内有着不同的事件发生，因此作为推动细胞周期运行的CDK的活性受到严格的调节。周期素(Cyclin)在不同时期中合成积累并与相应的CDK结合，以调节CDK活性。Cyclin作为蛋白激酶复合体的调节亚基，对CDKS起着正性调节作用，即激活CDK的蛋白激酶活性，促进细胞周期向前运转。在整个细胞周期中，CDK的量保持恒定，但其调节蛋白。Cyclin在细胞周期的不同时期中周期性地积累与分解。在细胞周期进程中，存在着两个关键性的转折点，即Gl-S和G2-M，细胞一旦通过了这两个转折点，就开始了DNA的复制和细胞的分裂。在Gl后期，D型细胞周期蛋白(CyclinD)合成、积累，与蛋白激酶CDK4或CDK6相结合，激活CDK4或CDK6的蛋白激酶活性，使Rb蛋白磷酸化，导致受Rb蛋白调控的转录激活因子E2F解阻遏，促使一些与DNA复制有关的酶蛋白基因得以表达，从而启动细胞DNA的复制。进人S期后，CyclinD分解，CyclinE和CyclinA逐渐积累并先后结合CDK2，激活CDK2，使DNA复制继续进行。进人G2期后，CyclinE分解，CyclinB合成并与CDK1(p34cdc2)相结合。p34cdc2属于Ser-Thr蛋白激酶家族，其功能结构域中Tyr15的磷酸化状态决定着p34cdc2的活性。与CyclinB之前p34cdc2一直处于磷酸化状态，这是由于weel或mikl基因的表达产物使p34cdc2上的Tyr15和Thr14分别被磷酸化而呈失活状态。在G2M转折点处，由cdc25基因的表达产物(一种蛋白磷酸酶)可将p34cdc2上Tyr15或Thr14的磷酸基水解下来，活化p34cdc2。活化的p34cdc2导致一些与细胞分裂有关的蛋白质磷酸化，如:核纤层蛋白磷酸化，导致核纤层蛋白的溶解和核膜的崩解;组蛋白H1被磷酸化，导致染色体凝聚;微管蛋白被磷酸化，导致细胞骨架的重新组合，从而推动了细胞分裂的进程。进人M期后，CyclinB和泛素(ubiquitin)也分别被磷酸化。泛素是真核细胞内约76个氨基酸残基的一类小分子蛋白，它可在一种特定的连接酶作用下，与磷酸化的CyclinB相连接。然后，在依赖泛素的蛋白水解酶作用下，将泛素连同CyclinB一同降解掉。CyclinB的降解使p34cdc2因失去调节单位而失活，同时被磷酸化8，细胞又处于静止期(G0)。此后，当有新的CyclinD合成后，细胞又开始新一轮的细胞周期。2.2.2 CDK活性的抑制CDK的活性除了受Cyclin的正向调节外，还受另外一类蛋白质的负向调节，这类蛋白质被称为依赖蛋白激酶抑制剂(Cyclin-dependent kinase inhibitons，CKIs)9。在芽殖酵母中，已发现2种CKI，Farl抑制cdc28-Cln复合体的活性，Sicl则通过抑制Cdc28-Clb5、6复合物来调节细胞进人S期的时间。在裂殖酵母的Gl期，依赖周期蛋白激酶抑制剂Ruml结合在cdc2-cdc13复合物上，维持cdc13蛋白在低水平，以防止不成熟的M期出现。哺乳动物细胞中有两类CKI，一类是Cip/Kip家族，它包括p22、p27和p57;另一类是Ink4家族，它拥有p15、p16、p18和p19四种CKI。前一类主要参与调节G1期和Gl/S转变中CDK2和CDK4/6与Cyclin复合物的活性，后一类则只抑制CDK4-CyclinD复合体的活性。8在正常的二倍体成纤维细胞中，p21的分子量为21KD，p21与Cyclin、CDK、PCNA(增殖细胞核抗原)形成四聚体复合物，能有效抑制多种cyclin-CDK复合物的活性，其中包括CyclinD-CDK4，CyclinE-CDK2以及CyclinA-CDK2等，这些Cyclin-CDK复合物都是Gl-S期转换中所需要的，所以p21可引起细胞在Gl期阻滞而不进人S期，抑制了哺乳动物细胞过度繁殖。p21与Cyclin、CDK和PCNA组成四聚体后，CyclinD上N末端的Leu-X-Cys-X-Glu序列与Rb蛋白的结合被抑制。Rb蛋白既可与CyclinD结合，又可与E2F结合。E2F在许多DNA合成和细胞生长调控有关的基因的启动子区域都存在着结合位点，这些基因包括胸苷激酶、二氢叶酸还原酶、DNA聚合酶、Rb蛋白、C-myc和N-myc等的编码基因。E2F可激活这些基因的转录启始，从而促使细胞进人G0期或分化。低磷酸化的Rb蛋白可与E2F结合，阻抑E2F的转录活性。Rb蛋白与Cyclin-CDK结合而被磷酸化，释放E2F，进而使E2F的转录激活作用活化。p21可通过其N端结构域与Cyclin-CDK结合，抑制Cyclin-CDK磷酸化Rb蛋白，阻止细胞进人S期。PCNA是DNA聚合酶的功能亚基，当细胞在S期发生DNA损伤时，p21可通过其C端结构域与PCNA直接结合而抑制DNA聚合酶的活性，阻止损伤DNA长链的复制。但p21不抑制DNA复制起始复合物的形成和DNA缺口的填补，所以可保证损伤DNA的修复得以正常进行。p21还可在CDK缺乏时借助与DNA聚合酶的亚单位(PCNA)竞争性结合，从而抑制DNA聚合酶的活性或者阻断DNA模板的滑动，最终影响DNA的复制。此外p21基因的启动子区域含有p53蛋白的结合位点。当用射线或化学诱变剂引起DNA损伤后，可诱导p53基因表达，促进p21基因转录，使p21通过抑制Cyclin-CDK，而使细胞被阻断在Gl期，使损伤的DNA有机会得以修复。这样，p21分别通过对CDK和PCNA的抑制来阻止发生在S期以前和S期的损伤DNA的复制，从而保证了进人子细胞的染色体的完整性。p27、p57与p21一样是Cyclin-CDK复合体的抑制剂，它们的过表达均可使细胞阻滞在G1期。p27与p21具有同源性，可与CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2、CyclinD-CDK4复合物结合，并按化学计量方式抑制其对底物的磷酸化作用，从而使细胞不能发生Gl-S期的转换，停滞于Gl期。p57与G1期Cyclin-CDK复合物结合，强烈抑制CyclinD-CDK4，CyclinA-CDK2等复合物的活性，使细胞停滞于Gl期，它还与p21的功能有重叠，它们协调作用保证细胞走出细胞周期，实现细胞由分裂到分化的转变。p28可能与p27同源，对多种Cyclin-CDK复合物有抑制作用。它在Gl期活性最大，在Gl早、中期可控制CDK活化时间。p16的分子量约为16KD，其编码基因由3个外显子组成，并有、两个转录本。转录本编码16KD蛋白的完整mRNA，而转录本的外显子1是一个不被转译的开放阅读框(ORF)，故在体外由俘转录本转译的蛋白质仅为9-10KD。P16的N末端含有一个与细胞周期蛋白盒的氨基端同源的(MX-ADWLATAX-RVEEVXLL)(X为其它氨基酸)序列，此外还含有4个锚蛋白重复序列。p16与CyclinD竞争性地结合CDK4或CDK6，从而抑制CDK4或CDK6的活性，抑制Rb蛋白的磷酸化，阻止细胞由Gl期进人S期。在由DNA肿瘤病毒转化的纤维母细胞中，CDK4与CyclinD及p21分离，而与pl6结合，pl6特异性结合CDK4从而抑制CyclinD-CDK4的活性，阻止Rb的磷酸化，进而阻滞Gl-S期的转变。P15基因与pl6基因的序列有相似性,它同样抑制CyclinD-CDK4的活性，阻滞Gl-S期的转变。p15、p18、plg与p16一样均可通过抑制CDK4或CDK6活性而影响细胞周期的进程。p18结构上与p16和p15有一定的同源性，能牢固地与CDK6结合，抑制细胞生长。p24又叫CKI1，其mRNA及蛋白水平在Gl后期达峰值。p24与CDK2结合，可能在G1-S期转换过程中起作用。p21、pl6也与多种类型的细胞终末分化有关。MyoD是生肌因子家族成员之一，具有典型的碱性螺旋-环-螺旋结构域，因而是一种转录激活因子。CyclinD可抑制MyoD的转录激活作用，并使MyoD磷酸化而阻滞细胞的分化。在肌细胞分化的开始，MyoD就可激活P21基因的转录。当将p21或P16转人处于增殖状态的成肌细胞时，可促进成肌细胞特异性基因(如肌球蛋白基因)的表达。2.3其他与细胞周期运转密切相关的基因P53基因与细胞周期运转关系密切。研究表明，p21基因是p53基因产物的靶基因。p53蛋白诱导产生的p21和Gadd45可与PCNA结合，使损伤的DNA得到修复。p53还通过与RPA (复制蛋白A) 结合进而抑制RPA与DNA复制起始点的结合，在Gl后期调节DNA复制起始复合物的组装，对细胞进人S期进行负调控。Rb基因编码的Rb蛋白处于细胞生长和调控的中心环节10，控制细胞进人生长分裂周期或脱离细胞周期而进人分化状态。Rb蛋白有磷酸化和去磷酸化两种形式，去磷酸化形式是Rb的活性形式。去磷酸化的Rb与促进细胞分裂的某些转录因子(E2F，CAB-l蛋白等)结合，转录因子的活性被抑制，细胞周期停滞在G1期。CyclinA、CyclinE、CyclinD2、CyclinD3/CDK激酶复合体都可使Rb磷酸化，其中CyclinD1直接与Rb结合，使Rb磷酸化而失活，失活的Rb释放E2F等转录因子，促使细胞进入S期。ATM基因是从人类常染色体隐性遗传病ATM(运动失调性毛细血管扩张症)患者体内发现的。当DNA稍有损伤时，诱导表达产生ATM蛋白，进而诱导p53的表达，使细胞周期抑制或DNA得以及时修复。近年来研究报道了ATM蛋白参与Gl/S、S、G2/M的关卡调控，证明ATM蛋白是DNA损伤检测器的成员之一，在细胞周期关卡调控中起着重要作用。三 结论综上所述我们可以得到一个细胞周期运行的简化图景：Cyclin负责正调控，与CDK的结合引起CDK的活化;而CKI进行负调控，与CDK-Cyclin复合物的结合将抑制其活性。如果把CDK视为细胞周期的“引擎”，那么Cyclin可以被认为是“油门”，CKI则是“刹车”。这三者组成了负责细胞周期运行的驱动装置。不过人们已经发现，驱动细胞周期运行的真实情况远远要复杂得多。因此，研究细胞周期运行的驱动装置精细结构以及各组成部分间相互作用的复杂性和多样性是目前细胞周期研究领域的重要内容。细胞周期的正常运转需要CDK的正性调控因子Cyclin与负性调控因子CKI的精确协同与平衡。一旦这种平衡失稳就会造成细胞的失控性增殖而发生癌变，例如，编码CyclinD1的基