丹参对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成的影响.doc

丹参对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成的影响丹参对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成的影响中华皮肤科杂志 1998年第1期第31卷 论著作者：李明 王强 杨春欣 陈蕾 秦万章关键词：硬皮病；系统性；成纤维细胞；丹参【摘要】 目的 探讨丹参治疗系统性硬皮病的药理机制。方法 用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法和光度检测法测定了丹参对成纤维细胞增殖和培养基中胶原含量的影响。结果 丹参水溶性提取物丹参注射液(10mg/ml、7.5mg/ml、5.0mg/ml、2.5mg/ml)及其活性单体丹参素(60g/ml、45g/ml、30g/ml、15g/ml)和原儿茶醛(40g/ml、20g/ml、10g/ml、5g/ml)，以及丹参脂溶性总提取物(1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml)及其活性单体丹参酮A(4g/ml，2g/ml)，不仅对患者皮肤成纤维细胞的增殖具有显著的抑制作用，还能显著降低该细胞培养基中可溶性胶原的含量(P0.050.01)。上述抑制作用随药物浓度的增高或作用时间的延长而增强。采用流式细胞仪对该细胞周期的检测显示，丹参素组G期细胞，原儿茶醛组和丹参酮A组G+M期细胞的比例较正常人对照组细胞显著增高(P0.01)。结论 丹参对体外培养的系统性硬皮病患者的皮肤成纤维细胞的增殖和胶原合成具有显著的抑制作用，可能是其治疗系统性硬皮病的药理机理之一。Effects of Salvia Miltiorrhiza Bunge on the proliferation and Collagen Synthesis in SystemicScleroderma Skin Fibroblasts Li Ming,Wang Qiang,Yang Chunxin,et al.Department ofDermatology,Zhongshan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200032【Abstract】Objective To study the pharmacologic mechanism of Salvia miltiorrhiza Bunge(SMB) in the treatment of systemic scleroderma(SSc).Methods We used the cultured sSc skin fibroblasts as an experimental model and detected the effects of SMB both on the cell proliferation by MTT assay and on the collagen production in the culture medium byphotometric determination.ResultsThe results showed that the SMB water soluble extracts, such as SMB injection (10mg/ml、7.5mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml) and its effective monomer danshensu (60g/ml、45g/ml、30g/ml、15g/ml) and protocate chualdehyde(40g/ml、20g/ml、10g/ml、5g/ml), as well as SMB total liposoluble extract (1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml) and its effective monomer tanshinone A (4g/ml、2g/ml), could not onlysignificantly inhibit the proliferation of the cultured SSc skin fibroblasts, but also significantly reduce the soluble collagen production in the culture medium(P0.050.01).The inhibiting effect was increased along with the increasing the concentration of the drugs or the prolonging the time of action. The cell cycle determination by flow cytometer(FCM) analysis showed that the cell proportion in G0/G1 phases after treated by Danshensu and in G2+M phases byprotocate chualdehyde and tanshinone A increased significantly than the controls(P0.01).Conclusion The above results demonstrated that SMB could significantly inhibit the proliferation and the collagen synthesis in cultured SSc skin fibroblasts and this maybe one of its pharmacologic mechanism in the treatment of SSc.【Key words】 Scleroderma,systemic Fibroblast Salvia miltiorrhiza 多年来，国内用丹参注射液及含有丹参的中药复方制剂治疗系统性硬皮病(SSc)，取得了较好的疗效。但迄今为止，丹参治疗SSc的药理机理尚不清楚。我们以体外培养的SSc患者的皮肤成纤维细胞为研究对象，通过观察丹参加入细胞培养基后对该细胞的增殖和胶原合成的影响，从胶原代谢方面对丹参治疗SSc的药理机理进行了探讨。卫生部科研基金资助课题作者单位：200032上海医科大学中山医院皮肤科(李明、王强、陈蕾、秦万章)，中草药制剂室(杨春欣)材料和方法(一)丹参试剂：丹参水溶性成分：丹参注射液系上海第一制药厂产品(批号95038，每毫升折合丹参生药1.5g)；丹参素购自上海医科大学天然药化教研室，使用前用三蒸水溶解，过0.22m滤器除菌；原儿茶醛(3,4-二羟基苯甲醛)系上海试剂一厂产品(批号86-07-01)，使用前用三蒸水溶解，封安瓿中，沸水煮沸15分钟灭菌。丹参脂溶性成分：丹参脂溶性总提取物由本院中草药制剂室选用河南确山产丹参，用乙醇提取，每毫升制剂含丹参生药2g；丹参酮A为中国药品生物制品厂产品(批号766-9504)。上述脂溶性成分均以含有二甲基亚砜(DMSO)的三蒸水溶解，煮沸灭菌。DMSO助溶的最高浓度为0.2%。本文所用丹参水溶性试剂的浓度系根据丹参注射液临床用量折合的丹参生药量，再根据其丹参素和原儿茶醛的含量2，并估算上述成分进入人体时的细胞外液含量而设定。丹参脂溶性试剂的浓度系参考预试验观察到的该试剂对人体皮肤成纤维细胞增殖具有显著抑制作用的最低浓度而设定。(二)人皮肤成纤维细胞培养和生长曲线：在局麻下分别切取1例36岁女性肢端型SSc患者上臂外侧活动性硬化皮损边缘皮肤组织和1例34岁女性整形外科患者上臂外侧正常皮肤组织，修剪去皮下组织后，将皮肤剪成1mm以下碎块，按LeRoy等3介绍的方法进行皮肤成纤维细胞原代培养并传代增殖，实验选用第36代细胞。成纤维细胞生长曲线的测定参照文献。(三)丹参对皮肤成纤维细胞增殖的影响：1.细胞计数法测定细胞增殖：取正常人皮肤和SSc患者皮肤成纤维细胞各1株分别接种24孔培养板(Nunc公司产品)，每孔510个细胞。接种后48小时更换培养基，加丹参试剂，每个试剂测3孔。加药后第5天用0.1%胰蛋白酶消化孔底细胞并用血细胞计数板计数4次取均数。以不含药物的培养基为阴性对照，分别计算每个试剂的3孔细胞的抑制率：抑制率=(阴性对照孔细胞数-给药孔细胞数)/阴性对照孔细胞数。2.改良MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法测定细胞增殖：将SSc患者皮肤成纤维细胞接种96孔培养板(Nunc公司产品)，每孔110个细胞，每孔加入200l培养基。72小时后，更换培养基并加入丹参试剂，每个试剂浓度测3孔。加药后1、3、6天，按秦慧莲等4介绍的方法，在酶标仪(Dynatech公司MR580型)570nm，参考波长630nm处读取A值。丹参水溶性试剂以不含药物的培养基为阴性对照，以甲基泼尼松龙为阳性对照；丹参脂溶性试剂因以DMSO助溶，故以含有0.2% dMSO的培养基为对照(下同)。3.细胞周期的测定：将SSc患者成纤维细胞接种于底面积为25cm的玻璃培养瓶内，每瓶2510个细胞。48小时后加丹参试剂，每个试剂浓度测5瓶。加药后48小时，用流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司产品，型号FACS tar Plus)进行DNA周期采样分析。由中国科学院上海细胞所流式细胞仪室协助测定。(四)丹参对SSc患者皮肤成纤维细胞胶原合成的影响：将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔5个细胞，每孔加1ml培养基。接种48小时后，更换培养基，加入丹参试剂，每个试剂浓度测3孔，加药后第1、3、6天，每孔各吸取0.5ml培养基于玻璃瓶中，加入浓盐酸0.5ml，封口。130烘箱中水解3小时。按文献5的方法测定培养基中羟脯氨酸(HPR)含量，并籍此计算出培养基中的胶原含量。分光光度计为上海第三分析仪器厂生产的721型光栅分光光度计，比色波长570nm。样品HPR浓度(g/ml培养基)=标准液HPR浓度所测样品A值/标准液HPR此浓度A值；样品中胶原浓度(g/ml培养基)=样品HPR浓度7.46稀释倍数(7.46是从HPR换算为胶原时的计算常数)。(五)统计学方法：用t检验。实验重复2次。结 果(一)正常人皮肤和SSc患者皮肤成纤维细胞生长曲线的比较：正常人皮肤和SSc患者皮肤成纤维细胞株细胞生长缓慢时间和群体倍增时间均为01.5天和第45天，平坦时细胞密度分别为1410/cm和1210/cm。(二)丹参对皮肤成纤维细胞增殖的影响：1.改良MTT比色法测定细胞增殖结果：丹参水溶性提取物丹参注射液及其活性单体丹参素和原儿茶醛、丹参脂溶性总提取物及其活性单体丹参酮A对SSc患者体外培养的皮肤成纤维细胞具有不同程度的抑制作用，随药物浓度增高和作用时间延长，抑制作用增强，详见表1。2.细胞周期测定结果：丹参素组G期细胞比例较对照组显著增高，S期细胞较对照组显著降低；原儿茶醛组和丹参酮A组G+M期细胞比例较相应对照组显著增高，G期反而显著降低，详见表2。(三)丹参对SSc患者皮肤成纤维细胞胶原合成的影响测定结果：丹参试剂作用后第1天，各试剂组对SSc患者皮肤成纤维细胞培养基中可溶性胶原含量无显著降低作用；丹参作用后第3天，丹参注射液10mg/ml(=36.26g/ml)和丹参素60g/ml(=35.19g/ml)组与阴性对照组(=48.97g/ml)比较，丹参脂溶性总提取物1mg/ml(=27.76g/ml)和0.5mg/ml(=28.74g/ml)组与DMSO对照组(=42.79g/ml)比较，培养基中可溶性胶原含量显著降低(P0.01)。丹参作用后第6天，上述具有显著抑制作用的药物组除抑制作用进一步加强外，另有丹参注射液5mg/ml(=44.71g/ml)、原儿茶醛20g/ml(=43.52g/ml)与阴性对照组(=57.69g/ml)比较，丹参酮A 4g/表1丹参对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞增殖的影响(A值，s)组 别培 养 时 间1天3天6天阴性对照0.0480.0100.0890.0060.1470.021二甲基亚砜对照0.0440.0150.0600.0070.0700.013甲基泼尼松龙对照(4g/ml)0.0390.0110.0680.0230.0620.018丹参注射液10mg/ml0.0790.011*0.0150.009*0.0140.006*7.5mg/ml0.1140.018*0.0130.003*0.0110.014*5mg/ml0.0940.010*0.0590.015*0.0400.011*2.5mg/ml0.0920.009*0.0800.0180.0800.004*丹 参 素60g/ml0.0990.011*0.0110.010*0.0090.010*45g/ml0.0980.006*0.0090.004*0.0040.002*30g/ml0.0930.010*0.0750.0160.0680.008*15g/ml0.0920.020*0.0800.0040.0600.005*原儿茶醛40g/ml0.0660.0060.0820.0140.0780.006*20g/ml0.0550.0110.0710.014*0.0380.005*10g/ml0.0430.0010.0750.003*0.0410.005*5g/ml0.0490.0050.0870.0220.0460.011*丹参脂溶性总提取物1mg/ml0.0310.0060.0060.003*0.0040.002*0.5mg/ml0.0240.0110.0050.002*0.0030.002*0.25mg/ml0.0430.0100.0200.006*0.0070.003*丹参酮A4g/ml0.0480.0090.0270.015*0.0070.002*2g/ml0.0460.0060.0460.005*0.0300.008*1g/ml0.0300.0050.0580.0040.0460.009注：水溶性试剂与阴性对照比较，脂溶性试剂与二甲基亚砜对照比较，*P?.01，*P0.05；水溶性试剂与甲基泼尼松龙比较，P0.01，P0.05表2丹参对系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞生长周期的影响(%，s)组 别G期S期G+M期阴性对照81.821.9311.911.216.370.72二甲基亚砜对照83.752.4210.621.325.631.04丹 参 素60g/ml89.952.70*3.202.06*6.850.7730g/ml91.601.84*2.951.15*5.450.9215g/ml91.451.13*3.551.30*5.001.10原儿茶醛20g/ml51.222.29*26.613.10*22.172.10*10g/ml48.611.16*19.102.05*32.292.73*5g/ml65.041.94*10.932.4024.131.82*丹参酮A4g/ml78.891.87*9.521.7311.681.61*2g/ml74.432.41*11.911.5713.661.33*1g/ml76.652.74*8.411.7514.942.47*注：每个试剂浓度测5瓶，丹参素、原儿茶醛与阴性对照比较，丹参酮A与二甲基亚砜对照比较，*P0.01ml(=34.16g/ml)与DMSO对照组(=49.60g/ml)比较，也显示有极显著抑制作用(P0.01)。此外，一些试剂的较低浓度组，如丹参注射液2.5mg/ml，丹参素30g/ml和15g/ml，原儿茶醛10g/ml和5g/ml，丹参脂溶性总提取物0.25mg/ml、丹参酮A 2g/ml和1g/ml组与上述相应对照组比较，也具有显著抑制作用(P0.05)。另外，甲基泼尼松龙(16g、8g、4g/ml)各组在药物作用后第6天与阴性对照组比较，也具有显著降低细胞培养基中胶原含量的作用(P0.05)。讨 论本研究中丹参注射液、丹参素、原儿茶醛以及丹参脂溶性总提取物和丹参酮A对体外培养的SSc患者的皮肤成纤维细胞增殖具有显著的抑制作用，且分别与药物作用浓度和作用时间的延长呈正比。丹参注射液和丹参素作用后24小时的检测显示，二者有促进细胞增殖的作用。但该作用持续时间短，第3天的检测显示，该作用已为抑制作用所取代，这与丹参素化学性质不稳定、受热易转化为棕褐色降解产物有关。但该降解产物可