第二章 蛋白质化学2.ppt

第四节蛋白质的分子结构 蛋白质是由一条或多条多肽 polypeptide 链以特殊方式结合而成的生物大分子 蛋白质与多肽并无严格的界线 通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质 蛋白质分子量变化范围很大 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大 多肽链的氨基酸顺序 化学键 肽键 一 蛋白质的一级结构 我国1965年在世界上第一个用化学方法人工合成的蛋白质就是这种牛胰岛素 肽链主链骨架原子的相对空间位置 不涉及残基侧链 化学键 氢键 主要有 螺旋 折叠 转角 无规卷曲 螺旋 环等 二 蛋白质的二级结构 1 螺旋 helix 多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转 形成螺旋结构 螺旋一周 沿轴上升的距离即螺距为0 54nm 含3 6个氨基酸残基 两个氨基酸之间的距离为0 15nm 肽链内形成氢键 氢键的取向几乎与轴平行 第一个氨基酸残基的酰胺基团的 CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的 NH基形成氢键 氨基酸残基R 侧链分布在螺旋外侧 多为右手 螺旋 2 折叠 折叠 折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列 通过链间的氢键交联而形成的 几乎所有肽键都参与链内氢键的交联 氢键与链的长轴接近垂直 肽链的主链呈锯齿状折叠构象 在 折叠中 碳原子总是处于折叠的角上 氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直 两个氨基酸残基之间的轴心距为0 35nm pleatedsheet 折叠有两种类型 一种为平行式 即所有肽链的N 端都在同一边 另一种为反平行式 即相邻两条肽链的方向相反 3 转角 turn 在蛋白质分子中 肽链出现1800回折 在 转角部分 由四个氨基酸残基组成 弯曲处的第一个氨基酸残基的 C O和第四个残基的 N H之间形成氢键 形成一个不很稳定的环状结构 这类结构主要存在于球状蛋白分子中 三 超二级结构与结构域 超二级结构 若干相邻的二级结构单元按照一定规律有规则组合在一起 相互作用 形成在空间构象上可彼此区别的二级结构组合单位 介于二级结构与三级结构之间 结构域 是存在于球状蛋白质分子中的两个或多个相对独立的 在空间上能辨认的三维实体 每个由二级结构组合而成 充当三级结构的构件 其间由单肽链连接 四 蛋白质的三级结构 三级结构 TertiaryStructure 是指多肽链在二级结构基础上非几何状地进一步折叠或卷曲成复杂的空间结构 包括肽链中所有原子的空间排布方式 维系这种特定结构的力主要是次级键 尤其是疏水作用力 在蛋白质三级结构中起着重要作用 三级结构中包含的共价键是二硫键 配位键 一 蛋白质分子结构中的化学键 1 共价键 蛋白质分子中的共价键有肽键 二硫键和配位键 是生物大分子分子之间最强的作用力 二硫键 由含硫氨基酸形成 在蛋白质分子中 起着稳定肽链空间结构的作用 二硫键被破坏 蛋白质的生物活性丧失 配位键 两个原子之间形成的共价键 共用电子对由其中的一个原子提供 金属离子与蛋白质的结合往往是配位键 例如 血红蛋白 细胞色素C等 二硫键 二硫键 半胱氨酸 半胱氨酸 胱氨酸 SH巯 读 qiu 音同球 基 价键牢固 稳定蛋白质结构 2 非共价键 共价键存在于一个分子或多个分子的原子之间 决定分子的基本结构 非共价键 又称为次级键或分子间力 决定生物大分子和分子复合物的高级结构 1 酯键 esterbond 在蛋白质分子中 丝氨酸和苏氨酸的羟基与氨基酸的羧基缩合成酯 形成酯键 磷酸与含羟基氨基酸缩合形成磷酸酯键 2 离子键 又称盐键 一种具有相反电荷的两个基团之间的库仑作用 这种键可以解离 3 氢键 氢键是由两个负电性原子对氢原子的静电引力所形成 X H Y它是质子给予体X H和质子接受体Y之间的一种特殊类型的相互作用 氢键具有方向性 氢键的方向用键角表示 是指X H与H Y之间的夹角 一般为180 250 4 范德华力 这是一种普遍存在的作用力 是原子 基团或分子之间比较弱的 非特异性的作用力 这种作用力分 极性基团之间的相互吸引 取向力 极性基团与非极性基团之间的相互吸引 诱导力 非极性基团之间的相互吸引 色散力 5 疏水作用 非极性侧链在极性溶剂水中为了避开水相而彼此靠近所产生的一种作用力 主要存在蛋白质的内部结构 蛋白质和酶的表面通常具有极性链或区域 这是由构成它们的氨基酸侧链上的烷基链或苯环在空间上相互接近时形成的 键能肽键二硫键离子键氢键疏水键范德华力 数量巨大 二 肌红蛋白 已知某分子量为240000的蛋白质多肽链的一些节段是 螺旋 而另一些节段是 折叠 其分子长度为5 06x10 5cm 求分子 螺旋和 折叠的百分率 解 AA残基的平均分子量是120设 螺旋含有X个残基 折叠含有2000 X0 15x 0 35 2000 x 5 06 10 5 10 7 五 蛋白质的四级结构 QuaternaryStructure 是指由多条各自具有一 二 三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式 各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系 这种蛋白质分子中 最小的单位通常称为亚基或亚单位Subunit 它一般由一条肽链构成 无生理活性 维持亚基之间的化学键主要是疏水作用力 由数条具有三级结构的蛋白质通过次级键叠合而成亚基单独没有生物功能亚基具有独立的结构单位 亚基 血红蛋白 血红蛋白 四亚基两两相同 分别称为 1 2 1 2 虾红素 第五节蛋白质分子结构与功能关系 研究热点 蛋白质的分子具有多种多样的生物功能是以其庞大的分子组成和极为复杂的结构为基础的 充分认识这其间的关系是人工合成功能蛋白质的基础 一 一级结构与功能的关系血红蛋白例如镰刀形贫血病的分子机理 镰刀状贫血病 血液中大量出现镰刀红细胞 患者因此缺氧窒息 正常细胞镰刀形细胞 它是最早认识的一种分子病 流行于非洲 死亡率极高 大部分患者童年时就夭折 活过童年的寿命也不长 它是由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构的突变 正常型 Val His Leu Thr Pro Glu Lys 链谷氨酸镰刀型 Val His Leu Thr Pro Val Lys 链缬氨酸 谷A 极性 缬A 非极性 了解 由于缬氨酸上的非极性基团与相邻非极性基团间在疏水力作用下相互靠拢 并引发所在链扭曲为束状 整个蛋白质由球状变为镰刀形 与氧结合功能丧失 导致病人窒息甚至死亡 胰蛋白酶的激活 肠激酶 激活作用 活性中心 胰蛋白酶原 胰蛋白酶 提问 为什么不直接以酶形式存在呢 答案 保护正常组织不受伤害 46 183 二 高级结构与功能的关系 变构蛋白 一些蛋白质可通过改变其构象来改变其生物活性 肌红蛋白血红蛋白 血红蛋白 氨基酸序列大不相同 功能相似 载氧 结构相似结构决定功能 1 氧合血红蛋白2 氧饱和曲线 S形3 变构作用 当血红蛋白的一个亚基结合氧后 使整个分子的构象发生变化 对氧的亲和力增加 R relaxedstate T tensestate 血中氧分子的运送 静脉 动脉 环境氧高时Hb快速吸收氧分子 环境氧低时Hb迅速释放氧分子 释放氧分子后Hb变回Tstate 第六节 蛋白质的性质 蛋白质与氨基酸一样 能够发生两性离解 也有等电点 在等电点时 蛋白质的溶解度最小 在电场中不移动 在不同的pH环境下 蛋白质的电学性质不同 在大于等电点的pH溶液中 蛋白质粒子带负电荷 在电场中向正极移动 在小于等电点的pH溶液中 蛋白质粒子带正电荷 在电场中向负极移动 一 蛋白质的两性离解和电泳 蛋白质的两性电离及等电点提问 为什么蛋白质具有两性 酸 碱性 含有酸碱氨基酸残基碱 酸越大pI 越大 pI通常在6 0左右 电泳 蛋白质在等电点pH条件下 不发生电泳现象 利用蛋白质的电泳现象 可以将蛋白质进行分离纯化 由于蛋白质的分子量很大 它在水中能够形成胶体溶液 蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质 如丁达尔现象 布郎运动等 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜 因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去 二 蛋白质的胶体性质 蛋白质的胶体性质提问 什么样的分子是胶体性质 答案 分子直径 胶体颗粒大小 1 100nm 且不易聚集沉淀 大多数球状蛋白溶于水 能形成稳定的胶体溶液 提问 蛋白质胶体溶液的稳定的原因是什么 答案 1 同种蛋白质带有同种电荷 相互排斥 2 水膜弹性 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入低浓度NaCl后沉淀溶解 盐溶提问 原因 盐溶 盐析 盐析 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出提问 原因 蛋白质的沉淀 中性盐沉淀有机溶剂沉淀重金属盐沉淀生物碱沉淀 1 定义 某些物理或化学因素 能够破坏蛋白质的结构状态 引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失 这种现象称为蛋白质的变性 denaturation 三 蛋白质的变性 蛋白质的变性 即蛋白质保持一级结构不变的情况下 二 三 四级结构被破坏蛋白质的物理 化学性质发生变化 变性蛋白质有哪些特征 生物活性的丧失一些侧链基团的暴露某些物理化学性质的改变 2 变性因素 1 物理因素 有哪些 加热 70 100 剧烈振荡或搅拌例如卤水 少量MgCl2 点豆腐 煎炒烹炸紫外线 X射线 超生波例如皮肤粗糙 白内障 杀菌 2 化学因素 有哪些 强酸 强碱 尿素 胍 去污剂 甲醛 重金属盐 三氯醋酸 磷钨酸 苦味酸 浓乙醇 例如胃酸 硫酸铜杀菌 烈酒 3 机理分子机理 变性因素破坏了维持蛋白质空间结构的各种次级键以及二硫键 重金属 与 SH生成不溶性的硫化物浓乙醇 去污剂 破坏疏水作用力 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸 酪氨酸和色氨酸 这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收 因此 大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收 利用这个性质 可以对蛋白质进行定性鉴定 四 蛋白质的紫外吸收 第七节蛋白质的分离纯化和一级结构测定 一 分离纯化的一般原则1 用物理和化学的方法进行粗提 2 利用沉淀 盐析 有机溶剂分级分离 色谱 电泳等方法进行纯化 3 蛋白质结晶 1 根据分子大小的分离方法透析和超过滤 密度梯度离心 凝胶过滤2 利用溶解度差别的分离方法等电点沉淀法 盐溶与盐析 有机溶剂沉淀3 根据电荷不同的分离方法电泳 离子交换法4 蛋白质的选择吸附分离5 根据配体特异性的分离 亲和层析 二 分离纯化的方法 三 蛋白质的分析测定 1 蛋白质含量测定凯氏定氮法 双缩脲法 Lowry法 紫外吸收法 考马斯亮蓝法2 蛋白质的纯度的鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳3 蛋白质相对分子量的测定凝胶过滤法 SDS PAGE 蛋白质的分子量一般在一万至一百万 1道尔顿 1 C12绝对质量 12 1 66 10 27千克 之间常用的测定方法有渗透压法 超离心法 凝胶过滤法等 凝胶法只适于球状蛋白分子测量 60000 80000转 分重力60万 80万倍 四 蛋白质氨基酸序列的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础 自从1953年F Sanger测定了胰岛素的一级结构以来 现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定 样品必需纯 97 以上 知道蛋白质的分子量 知道蛋白质由几个亚基组成 测定蛋白质的氨基酸组成 并根据分子量计算每种氨基酸的个数 测定水解液中的氨量 计算酰胺的含量 1 测定蛋白质的一级结构的要求 2 测定步骤 1 多肽链的拆分 2 测定蛋白质分子中多肽链的数目 3 二硫键的断裂 4 测定每条多肽链的氨基酸组成 并计算出氨基酸成分的分子比 5 分析多肽链的N 末端和C 末端 6 多肽链断裂成多个肽段 7 测定每个肽段的氨基酸顺序 8 确定肽段在多肽链中的次序 9 确定原多肽链中二硫键的位置 蛋白质一级结构的测定 选择题1 在下列有关谷胱甘肽的叙述中 正确的是 A 谷胱甘肽中含有胱氨酸B 谷胱甘肽是体内重要的氧化剂C 谷胱甘肽谷氨酸的 羧基是游离的D 谷胱甘肽的C 端是主要的功能基团2 在有关蛋白质三级结构的描述中 错误的是 A 具有三级结构的多肽链都有生物学活性B 三级结构是单体蛋白质或亚基的空间结构C 三级结构的稳定性由次级键维持D 亲水基团多位于三级结构的表面3 在有关蛋白质四级结构的描述中 正确的是 A 蛋白质四级结构的稳定性由二硫键维系B 四级结构是蛋白质保持生物学活性的必要条件C 蛋白质都有四级结构D 蛋白质亚基间由非共价键聚合 4 每一种完整蛋白质分子必定具有 A 螺旋B 折叠C 三级结构D 四级结构5 盐析法沉淀蛋白质的原理A 中和电荷 破坏水化膜B 盐与蛋白质结合成不溶性蛋白盐C 调节蛋白质溶液的等电点D 降低蛋白质溶液的介电常数A B C D 6 空间结构包括 A 螺旋B 折叠C结构域D亚基E超二级结构7 右手 螺旋是一种很稳定的构象 稳定的主要原因 A螺旋内有芳香氨基酸残基B螺旋内所有肽键的 NH与CO都参与氢键形成C侧链基团从螺旋中向外伸出 不彼此作用D每一个碳碳连键的旋转度都相同8 转角中肽链主链出现 A800B1800C600D1500 10 变性蛋白质溶解度减少的原因是 A蛋白质分子表面电荷减少B蛋白质分子表面极性残基减少C疏水残基外露D蛋白质聚集E以上全部填空题1 根据氨基酸的酸碱性质可分为 三类 2 多肽链的氨基酸的 称为一级结构 主要化学键为 3 蛋白质为两性电解质 大多数在酸性条件下带 电荷 在碱性条件下 电荷 当蛋白质净电荷为 此时溶液的pH值称为 4 蛋白质变性主要是其 结构受到破坏 而其 结构仍为完好 5 血红蛋白是含有 辅基的蛋白质 其中的 离子可结合1分子氧 6 维持蛋白质高级结构的非共价键有 等 7 蛋白质空间结构正确形成 除 为决定因素外 还需要一类称为 的蛋白质参加 名词解释等电点蛋白质一 二 三 四级结构蛋白质变性亚基盐析与盐溶协同效应肽平面 本章小节 1 蛋白质的生物学作用 功能