糖尿病21.doc

【关键词】 糖尿病肾病 Effects of blocking renin-angiotensin system on expression of angiotensintype1receptors in the kidney of diabetic rats ZHANG Li，MA Ji，GU Yong，LIN Shan-yan（1.Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing210029，China;2.Department of Nephrology，Huashan Hospital，Fudan University，Shanghai200040，China） Abstract:Objective To investigate the expression of angiotensin（Ang）type1（AT1）receptors in the kidney of diabetic rats and its effects of blocking renin-angiotensin system（RAS）.Methods Diabetic rats were given angiotensinreceptor blocker，irbesartan（40mgkg-1 ），angiotensin-converting enzyme inhibitor，fosinopril（40mgkg-1 ），and irbesartan plus fosinopril（20mgkg-1 ，respectively），or placebo per day for4weeks.The expression of renal AT1receptors were as-sessed by immunohistochemistry and Western blot.Results Immunoblot for AT1receptors showed that the expression of AT1receptors decreased significantly in diabetic kidney.Treatment with irbesartan，fosinopril and their combination significantly increased the expression of AT1receptors compared with that of controls（P0.05）.Conclusion In diabetes mellitus，treatment with irbesartan，fosinopril and their combination changes the expression of AT1receptors in renal cortex，suggesting that local RAS in diabetic kidney be actively involved in the pathogenesis of DN. Key words:diabetic nephropathies;renin-angiotensin system;angiotensin;receptor;rats 摘要目的: 观察糖尿病肾病（DN）患者血清单核细胞趋化蛋白.1（MCP.1）和受活化调节、由正常T细胞表达分泌的趋化蛋白（RANTES）水平，并探讨它们与糖基化终产物.肽（AGE.P）的相互关系。 方法: 设健康对照（NC）组46例，糖尿病（DM）患者176例分为正常蛋白尿（DMN）组、微量白蛋白尿（DMMi）组及显性蛋白尿（DM Ma）组。流动注射分析法检测血清AGE.P，ELISA法检测血清MCP.1和RANTES。 结果: （1）DM患者血清MCP.1、RANTES和AGE.P水平均明显高于NC组（均为P0.01）;（2）DMMa组和DMMi组血清MCP.1水平均显著高于DMN组（均为P0.05）;（3）DMMa组血清AGE.P水平明显高于DM Mi组和DMN组（P0.05和P0.01）;（4）DN患者血清AGE.P与RANTES及MCP.1水平之间呈正相关（r=0.31，P0.05;r=0.53，P0.001）。 结论: DM患者血清AGE.P、RANTES和MCP.1水平升高;血清AGE.P及MCP.1水平与DN病变程度平行，DN患者血清AGE.P与RANTES及MCP.1呈正相关。 关键词 趋化因子;单核细胞趋化蛋白.1;受活化调节、由正常T细胞表达分泌的趋化蛋白;糖基化终产物.肽;糖尿病肾病 蛋白质非酶糖化形成的糖基化终产物（advanced glycosylation end products，AGEs）和CC趋化因子在介导糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）发生发展中的作用已被大量实验和临床研究所证实1 ，而两者相互之间的关系近年来成为新的研究热点2 。有关AGEs诱导单核细胞趋化蛋白.1（monocyte chemoattractant protein.1，MCP.1）表达已经在多个体外培养的细胞24 得到证实。作者先前的研究也观察到，AGEs可增加人肾系膜细胞受活化调节、由正常T细胞表达分泌的趋化蛋白（regulated upon activation，normal T cell expressed and secreted，RANTES）和MCP.1的基因表达和蛋白质分泌5，6 ，但有关在体水平DN患者血清AG-Es与CC趋化因子相关关系的研究则鲜有报道。本研究应用流动注射分析技术和ELISA方法分别测定了糖尿病（DM）伴或不伴DN的患者血清糖基化终产物.肽（AGE-peptide，AGE.P）与CC趋化因子RANTES、MCP.1水平，以期从临床在体水平探讨两者相互作用与DN发生发展之间的关系。 1 对象和方法 1.1 研究对象 正常健康对照（NC）组46例，来自东南大学附属中大医院健康查体中心。DM病人176例，为2000年6月至2004年12月在东南大学附属中大医院内分泌科住院的病人，排除伴有急慢性感染性疾病、严重心脑血管病变、肾功能不全、其他系统性疾病以及有严重DM急性代谢并发症者，根据尿白蛋白水平分为3组:正常蛋白尿（DM N）组，尿微量白蛋白（UMA）300mg（24h）-1 。所有研究对象基本资料见表1。表1 糖尿病各组与健康对照组基本资料（略）注:1mmHg=0.133kPa 1.2 主要试剂和材料 人MCP.1试剂盒（美国Endogen产品），人RANTES试剂盒（法国Immunotech产品），尿白蛋白试剂盒（中国原子能研究所产品），三氯醋酸（TCA）、氯仿等其它试剂系国产分析纯;带荧光检测器的高效液相色谱仪（HPLC，日本岛津公司产品），Model550酶标仪和Mod-el1575洗板机（美国BIO.RAD产品），低温高速离心机（日本日立公司产品）。 1.3 研究方法 1.3.1 标本采集 所有研究对象忌色饮食3d，当晚20:00后禁食，次晨7:00抽取空腹静脉血3ml，留取小便10ml，并记录24h尿量。分离血清-70保存待测，小便即送肾病实验室检测尿白蛋白（ELISA法）。 1.3.2 流动注射分析技术检测血清AGE.P 血清经TCA和氯仿沉淀蛋白及去脂，吸取水层20l注入HPLC进样环，荧光检测器设定激发波长370nm、发射波长440nm测定AGE.P含量，峰高用于计算结果。1UAGE.P相当于1gml-1 AGE.BSA水解所得的AGE.P量。 1.3.3 ELISA法检测血清MCP.1 在预先用抗人MCP.1抗体包被的酶标孔里加入50l孔-1 的生物素标记二抗。然后50l孔-1 加入稀释的MCP.1标准品和待测样品，室温下孵育2h。洗板后加入100l孔-1 链白亲和素标记的髓过氧化物酶，孵育30min。洗板后100l孔-1 加入预混好的TMB显色液，孵育30min后加入反应终止液，酶标仪测450nm吸光度并作标准曲线，求出所测样品的MCP.1浓度（pgml-1 ）。 1.3.4 ELISA法检测血清RANTES 按试剂盒说明书操作。用标准稀释剂B将标准品和血清样本稀释后加入酶标孔（100l），继之加入稀释剂A100l和辣根过氧化物标记的RANTES共轭剂50l，室温孵育2h。洗板后加入显色反应底物液200l，避光孵育30min。终止反应后酶标仪测450nm吸光度，根据标准曲线自动求出样品RANTES浓度（ngml-1 ）。 1.4 数据分析和处理 所有样品均重复3次检测，数据以xs表示，用统计软件Prism3.0分别行方差分析和Newman-Keuls检验分析。 2 结 果 与NC组比较，DM患者血清MCP.1（634.15248.24）pgml-1 vs（359.36134.30）pgml-1 ，P0.01（图1）、RANTES（56.9115.78）ngml-1 vs（12.342.28）ngml-1 ，P0.001（图2）和AGE.P水平（2.860.71）Uml-1 vs（1.380.31）Uml-1 ，P0.001（图3）均明显增高。3 讨 论 越来越多的研究证实趋化因子特别是CC趋化因子（包括MCP.1和RANTES）通过募集单核巨噬细胞在肾小球或间质浸润参与DN发生的早期事件。国内外文献710 一致报道DN患者尿MCP.1和RANTES增高，但关于DM和DN患者血清MCP.1和RANTES水平的意义尚存在争议。Banba等7 和Wada等8 几乎同时报道各自的小样本观察结果，显示DM不同水平蛋白尿各组之间以及和正常对照之间血清MCP.1无差异。新近Petrkova等11 观察到DM合并周围血管病变者血清MCP.1增加。而Nomura的多次结果显示DM12 以及合并高血压13 者血清MCP.1和RANTES水平显著高于无DM者。国内黄文辉等10 比较每组15例不同蛋白尿水平的DM患者与正常人血清MCP.1、RANTES水平，结果显示各组均值基本一样。而包艳等9 检测总共31例DM患者和10例健康人血清MCP.1，从无白蛋白尿到显性蛋白尿各组有逐步增加趋势，正常对照最低，但无统计学差异。 作者先前的初步观察14 发现32例糖尿病患者血清MCP.1水平明显高于23例正常对照组。本研究扩大样本后观察结果与以前一致，而且观察到血清MCP.1水平随DN加重逐步增高（尽管DM Ma组与DM Mi组无统计学差异），提示血清MCP.1有助于判断DN的程度，尤其是预测早期DN的发生。由于高糖、糖基化蛋白7 等许多因子可刺激细胞合成MCP.1，DM N组MCP.1增高可能与高血糖及其相关的代谢产物作用有关。此外，DM患者血清RANTES水平高于正常对照，与Nomura等的结果12，13 一致。但DM各亚组间RAN-TES水平无统计学差异，提示血清RANTES水平对判断DN病变程度帮助不大。 由于可与靶组织或蛋白再次共价联结形成第2代AGEs，小分子AGE.P在DM并发症发生发展中的作用更加重要。为此，作者在国内外首先建立了流动注射分析技术检测血清AGE.P并成功用于临床。本研究再次观察到DM患者血清AGE.P增高且与DN病变程度有关，与作者既往动物实验结果15 一致。此外，相关分析结果显示，DN患者血清AGE.P水平与MCP.1及RANTES均存在明显相关关系。由于体外细胞实验证实AGEs可刺激MCP.1和RANTES表达增加，该结果提示，糖尿病患者体内MCP.1和RANTES增加可能