T细胞表型及脾细胞分离.ppt

研究生实验 一 T细胞表型测定 一 二 小鼠脾细胞分离技术 实验一 T细胞表型测定 一 免疫细胞的分离 细胞涂片 固定及保存 原理 T细胞是一个复杂的 不均一的整体 根据其发育的不同阶段 表面标记以及功能 可将其分为不同的亚群 T细胞介导细胞免疫应答 并且对B细胞介导的体液免疫应答起到辅助和调节作用 T细胞共有标志 CD3 为总细胞T细胞特有标志 CD4 细胞为辅助细胞 CD8 细胞为杀伤细胞 T淋巴细胞表面标志 正常值 正常人外周血中 CD3为60 80 CD4为35 55 CD8为20 30 CD4 CD8的正常值约1 4 2 0 CD4 CD8 1 4 免疫缺陷病 如艾滋病的比值常小于0 5 恶性肿瘤 再生障碍性贫血 某些病毒感染 CD4 CD8 2 0 自身免疫性疾病 如SLE 类风湿关节炎等 T淋巴细胞表面标志的检测 有助于了解机体的细胞免疫功能 对免疫缺陷病 肿瘤 自身免疫性疾病 病毒感染 移植排斥反应等疾病的诊断 分型 预后和疗效观察有着重要的意义 SABC AP法测定T细胞亚群 SABC 为链酶亲和素 生物素 AP为碱性磷酸酶 链酶亲和素 是一种糖蛋白 可由蛋清中提取 分子量60kD 每个分子由4个亚基组成 可以和4个生物素分子结合 亲和素与生物素一经结合就极为稳定 形成一种类似晶格的复合体 实验基本流程 实验材料 肝素 淋巴细胞分层液 Hank s液 PBS等 一次性注射器 试管 滴管 离心机 微量移液器 玻片 显微镜 温箱等 鼠抗人CD3 CD4 CD8单克隆抗体 1抗 羊抗鼠IgG 生物素化2抗 SABC AP 底物 BCIP NBT磷酸甲苯胺蓝盐 等 实验步骤 标本的制备 淋巴细胞悬液的制备标本的染色 结果的观察 标本制备 淋巴细胞悬液的制备 1 取肝素抗凝血5ml与5mlHank s液稀释混匀 每组取2ml 用滴管贴管壁轻轻叠加于2ml分离液上 配平后1500rpm离心10mins 2 洗涤细胞 用滴管仔细吸出位于血浆和分离液之间乳白色的淋巴细胞 放入盛有2mlHank s液的试管 1500rpm离心10mins 弃上清 将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank s液重复洗涤一次 最后一次用PBS洗涤 3 弃去上清 淋巴细胞沉淀用200 lPBS溶解 取20 l细胞涂片 下一次实验检测T细胞亚群用 标本染色 细胞涂片用记号笔划圈 滴固定液1滴 室温固定2 3分钟 滴加鼠抗人CD3 CD4 CD8抗体15 L 轻轻摇晃 使单抗均匀铺在细胞表面 37 孵育2 3h PBS洗3次 滴加生物素标记羊抗小鼠抗体15 L 37 孵育30 45分钟 PBS洗3次 滴加SABC15 L 37 孵育30 45分钟 PBS洗3次 滴加显色剂30 50 L 室温显色20 40分钟 可在显微镜下观察 待细胞膜上出现红色标记物时 用PBS淋洗 滴加细胞核复染液1滴 30秒后自来水淋洗 显微镜下观察结果 注意事项 以上操作中 37 孵育时应将玻片置于湿盒中 切勿干片 特别是加底物后 干片将导致阴阳性结果不能分辨 观察结果时应使涂片保持湿润 观察结果 高倍镜下计数100 200个单个核细胞 计算阳性率 阳性细胞 细胞表面呈红色 标准阳性 细胞表面呈红色 可见深蓝色细胞核 强阳性 细胞周缘及中央均呈红色 看不见细胞核 弱阳性 细胞表面呈淡红色 可见淡兰色细胞核 阴性细胞 细胞表面无着色反应 呈淡兰色 注意事项 为防止试剂受到污染 加样器吸头最好为一次性使用 分离单个核细胞中 将稀释血液加于分层液上时 务必要使之形成良好的界面 否则影响分离结果 孵育过程中 应将涂片置于湿盒中 操作中始终要注意保持涂片的湿润 以确保得到完美的实验结果 淋洗时不要直接对着细胞冲 避免细胞脱落 淋洗后 加试剂前须擦干细胞圈外水分 以免试剂流散 实验二小鼠脾细胞分离与制备技术 分离小鼠脾细胞 细胞计数板进行细胞计数 胎盘蓝染色进行细胞活性检测 实验材料 实验动物 小鼠 细胞培养液 试管 滴管 离心机 培养皿 100目细胞筛等 选择小鼠 拉脱颈椎处死 用碘酒 酒精消毒皮毛 剪开皮肤 打开腹腔 找到红色的脾脏 用镊子分离后摘除 将脾脏放入盛有5 10ml培养液的平皿中轻轻漂洗 并细心剥除脾脏周围的结缔组织 将脾脏移入另一个盛有5 10ml培养液的平皿中 轻轻漂洗后置于100目细胞筛中 轻轻挤压使脾细胞通过筛孔进入培养液中 反复冲洗 以取得脾细胞悬液 1 分离小鼠脾细胞 收集分离出的脾细胞 置于10ml离心管内加入培养液吹打 取10 l细胞 与10 l胎盘蓝染液混匀后染色并观察细胞活力 同时进行细胞计数 细胞活力观察 台盼蓝染色 细胞损伤或死亡时 台盼蓝可穿透变性的细胞膜 与解体的DNA结合 被染成淡蓝色 而活细胞能阻止染料进入细胞内 可以鉴别死细胞与活细胞 细胞计数 采用细胞计数板 2 细胞活力观察及计数 材料 4 台盼蓝母液 称取4g台盼蓝 加蒸馏水研磨 加双蒸水至100ml 用滤纸过滤 4 保存 使用时 用PBS稀释至0 4 血细胞计数板 显微镜等 步骤 制备单细胞悬液 染色 取10 l细胞悬液与10 l台盼蓝溶液并混匀 计数 在三分钟内 用计数板分别计数活细胞和死细胞 注意事项 台盼蓝对人体有毒 尽量避免直接接触 染色时间不宜过长 否则 部分活细胞也会着色 会干扰计数 台盼蓝染色 细胞计数 步骤 用乙醇清洁计数板及专用盖玻片 然后用绸布轻轻拭干 用微量移液器取少许细胞悬液 10 l 将细胞样本从室的一个口注入 液体在室中扩散 空气从另一个口排除 观察计数板四角大方格中的细胞数 并计算细胞浓度 注意事项