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PCR诊断技术在生猪疾病诊断上的优缺点生命科学学院 09动物科学2009084543 叶兴洁 指导老师：戴爱玲【摘要】：PCR技术以其敏感、特异、快速、准确的优点成为目前病毒学诊断、分子生物学实验最常用的技术之一，也是生猪病原检测和定型中最常用的技术。目前国内外已经建立了多种检测生猪疾病的PCR技术。【关键词】：PCR 诊断 疾病 抗原 转录PCR技术以其敏感、特异、快速、准确的优点成为目前病毒学诊断、分子生物学实验最常用的技术之一，也是生猪病原检测和定型中最常用的技术。目前国内外已经建立了多种检测生猪疾病的PCR技术。一、PCR技术的基本原理PCR基本原理及方法是依据体内细胞分裂中的 DNA半保留复制机理以及体内dNTP分子在不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。PCR是由高温变性(denaturation)、低温退火(annealing)、适温延伸(ex tension)等三个基本反应(称一轮循环)组成的反复循环过程。高温变性，即在95高温下将所要扩增的靶基因或DNA双链解离成单链DNA；低温退火，即以单链DNA为模板在3755低温下与人工合成引物按碱基配对原则相结合；延伸，在耐热TaqDNA聚合酶、M g2+、72、合适缓冲液、4种dNTP条件下合成互补DNA新链。整个 PCR过程一般只需30个循环。每循环一次，目的DNA的拷贝数加倍。由于前轮反应所扩增的DNA可作为后一轮反应的模板，因此最后扩增得到的DNA数量为Y=(1+x)n。式中Y为DNA的量，X为反应平均效率，n为PCR的循环次数。若反应的平均效率为100，循环反应20次后，大约扩增了106倍。每循环一次仅需几分钟，因此在2-4小时内即可使DNA扩增106。通常在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”，产物的量不再增加。二、PCR技术诊断的优点传统的动物疫病诊断方法有临床学诊断、生物学诊断、形态学诊断和免疫学诊断。随着分子生物学知识的不断积累，可能采用各种分子生物学技术直接探查病原体基因的存在和变异，从而对生物体的状态和疫病作出诊断，这就是基因诊断。在多种多样的基因诊断技术中，PCR因其巧妙的原理和与众不同的特点，已成为基因诊断的首选技术。现将其主要优点介绍如下：1. 特异性高针对性强 不仅可以检出正在繁殖生长的病原体，也可以捡出潜伏的病原体；既能确定既往感染，也能确定现行感染。尤其对那些目前尚不能体外培养和难以培养的病原体，采用PCR检测特别有效。PCR技术是检测病原体的核酸，与生物化学和免疫学检测相比较，PCR结果与病原体培养结果更为一致。2. 灵敏度高 在PCR扩增中，靶序列的数目以指数极增长，样品中级微量的靶序列在数小时内即可增至几十万，甚至几百万倍，因此该方法的检测灵敏度极高。理论上推算可以检出一个细菌或一个真核细胞的单拷贝基因的存在。 3. 简便快速 尤其是耐热TaqDNA聚合酶的应用和自动热循环仪的发展，使手工操作被自动化PCR取代。商品化试剂盒的发展和应用，使检测可在24小时内获得结果。4. 对检测样品的要求低 几乎所有的临床标本都可以作为PCR的材料。对病原微生物的检测，只要求标本中有完整的靶序列核酸。因此，无论是经过远途运输或低温保存多年的陈旧标本，还是慢性或隐性感染的病料，都可以用于PCR扩增。5. 安全检测病原体 由于PCR操作的每一步都不需要活的病原体，不会造成病原体逃逸，在防止传染病扩散意义上具有安全性。6. 常规PCR以提取样品病原DNA为模板，在事先设计的引物、dNTP混合液、PCR反应液、Tap酶和镁离子等条件下进行的PCR反应。根据是否有扩增产物、扩增产物是否与预测的目的基因片段一致对疫病进行诊断。7.标记PCR以4种dNTP为原料，将其中一种脱氧单核苷酸用放射性同位素、生物素或地高辛等标记，经 PCR扩增后，可获得大量纯度高的PCR产物，直接作为核酸杂交的探针用于疫病的诊断。8.反向PCR用于扩增位于已知序列两侧的一段未知序列。先用一种能酶解已知序列侧面的限制性内切酶消化已知序列，再利用T4DNA连接酶使具有黏性末端的未知序列环化，然后用另一种限制性内切酶再切开已知序列，经过上述线状一环状一再线状的变化，使原位于已知序列两侧的未知序列变为位于已知序列的中央，这样经 PCR扩增便可测得未知序列。利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。9.不对称PCR采用不等量的一对引物，若干循环后，量少的一种先消耗完，剩下另一引物参与以后的循环反应，产生大量的单链DNA。可用于制备单链探针、DNA序列分析及配合反转录PCR用于研究真核DNA外显子。10.反转录PCR(RT-PCR)首先提取总RNA，然后加入引物在反转录酶的作用下合成eDNA，加热变性成为单链 eDNA后，加入与之互补的另一引物，进行PCR。可广泛用于各种RNA、mRNA的检测和eDNA文库的构建。11.多重PCR(Muhi-PCR) 在同一反应体系中同时加入多对不同PCR引物和相应的模板，可在同一反应管中同时扩增出一条以上的目的基因，可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上有其独特优势和很高的实用价值。12.原位杂交PCR首先将样品组织切片或细胞涂片，然后固定在载玻片上，适当预处理后，将细胞核内的DNA加热变性形成两条单链DNA。针对待检测的选定序列设计一对引物，直接将引物dNTP缓冲液及TaqDNA聚合酶加到载玻片上，在原位聚合酶仪内进行PCR扩增，反应完毕后将PCR产物固定在载玻片上，用相应的检测信号系统进行检测。可以检测组织细胞中微量DNA或RNA，且可精确定位。13.抗原捕获PCR利用单抗对抗原具有特殊敏感性建立的抗原捕获PCR对标本有洁净作用，可降低无关核酸的污染和清除抑制物，并具有捕获和富集标本中病原体的作用，提高PCR的特异性和敏感性。14.半套式PCR指第二次PCR反应中的2个引物之一与第一次PCR反应中一个引物完全相同，它利用内外两对引物先后进行2次PCR扩增，以达到从微量的模板中获得高浓度和高纯度的目的片段。其敏感性比常规 RTPCR敏感性高1000倍，因而在临床样品检测和疾病感染的早期诊断中具有重要的实用价值。15.二温式PCR 只有二种温度变化，即变性温度和退火、延伸温度，其操作更简单，扩增速度更快，具有很高的临床应用价值。二温多重PCR是二温式PCR与多重 PCR结合起来的技术。将PCR扩增时退火和延伸两个温度合并为一个温度，并能够在同一个反应体系中检测到两种以上病原的PCR技术。操作上更简单省时，提高了检测速度。16. PCR基因芯片基因芯片（gene chips)是在固相支持物表面点上数千个基因片段作为探针，然后将被检测的样本DNA或者cDNA用放射物荧光标记并与芯片上的探针杂交。杂交后用计算机分析杂交信号的强弱，了解样本中各种基因存在或者基因表达的情况。PCR基因芯片结合了其他类型的基因芯片体积小却可以检测大量基因和PCR容易发现各种基因变异的特点，采用与其他基因芯片以分子杂交为基础明显不同的、以PCR为基础的检测方式，克服了杂交技术所存在的内在缺陷，大大增强了敏感性和稳定性。PCR基因芯片适用于人类、动物和植物等各种生物的多种基因的基因重排、基因突变和基因缺失的鉴定，在临床肿瘤和白血病的诊断、人类基因组分析、基因多态性和疾病易感性鉴定、遗传性疾病的基因诊断、动物和植物基因变异筛选、各种病原微生物鉴定等多方面有广泛应用前景。三、PCR技术的不足1. Taq酶能在较高的温度下保持稳定不被灭活。它的应用使PCR技术发生了革命性的飞跃，但由于缺乏35端的外切酶活性，不能切除反应中的错误掺入的核苷酸，使PCR扩增产物中包含有一定程度的错误序列。2. 由于PCR技术具有高度灵敏的特性，容易导致交叉扩增反应，从而出现假阳性结果。因此试验中需要设置必要的对照，并要求操作者严格遵守操作规程，不断积累观察和判断结果的经验，排除干扰，保证检测结果的准确性。3.由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。4.Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。5.引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之 间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。6.PCR仪器的价格太高。四、展望综上所述，在我国科技工作者的努力下，PCR技术的研究和应用得到了很大的发展，取得了可喜的成绩。尤其是在动物疫病诊断上有了快速进展。他们研究并运用了PCR技术及其延伸技术，如RT-PCR技术、半套式PCR技术、二温式多重PCR技术、三温式多重PCR技术、复合PCR技术等；并将之充分运用到动物疾病诊断，传染病流行病学调查，外来疫情监测和免疫后强毒株检测等方面。为控制动物疫病的发生和传播起到了不可磨灭的作用。但是由于PCR技术本身的局限性，如缺乏外切酶活性、交叉反应等，限制了此项技术的发展。相信不久我们的科技工作者将会攻克这些难题，从而使PCR技术更加完善。为控制动物疫病发生和传播作出更大的贡献。【参考文献】：1车延平;任晓峰；PCR技术及其在畜禽疾病诊断中的应用2毛文智;苑淑贤;李琳;任科研;杨金生;邵洪泽;姚新华；雏鹅新型病毒性肠炎PCR方法的建立及应用畜牧兽医科技信息2011年04期3刘拂晓;李明义;孙秀峰;单虎;程增青;吴海燕；鸭疫里默氏杆菌PCR检测方法的建立国外畜牧学(猪与禽)2010年06期4张富;巩元玲;栾庆江;何云梅，畜禽微卫星标记的研究进展郑州牧业工程高等专科学校学报2011年02期5孙;郭东春;刘家森;姜骞;司昌德;林欢;曲连东鸭疫里氏杆菌PCR方法初步建立及应用