2无菌检查法.doc

文件名称：无菌检查法文件编号：SOP-QC255-00第 10 页 共 10 页1. 目的 建立无菌检查法检验标准操作规程，规范操作。2. 范围 适用于无菌检查法。3. 依据 中华人民共和国药典2010 年版二部附录P103-107。4. 职责4.1 起草：QC 审核：QA 批准人：质量负责人4.2 QC 实施本规程。4.3 QA 监督本规程的实施。5. 内容5.1 概述5.1.1 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。5.1.2 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。5.1.3 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。5.2 仪器、设备和用具5.2.1 无菌室分无菌操作间和缓冲间，在缓冲间内应有洗脸手盆、毛巾、无菌衣放置架或钩、拖鞋等，无菌室应具有空气除菌过滤的层装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室温（1826）及除湿装置，缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯及照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。5.2.1.1 无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚酞擦试操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时，在每次操作完毕，同样用2%甲酚酞或0.1%新洁尔灭擦试工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。5.2.1.2 无菌室的无菌程度检查，无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数取直径90mm双碟，在接种室内点燃酒精灯，在酒精灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约15ml，制浅平板，在35-37预培48小时，证明无菌后将平板3个，以无菌方式带入无菌操作间的洁净区左、中、右各放一个，打开碟盖和置平板在空气中暴露30分钟后，将碟盖盖好，置35-37培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得过10个。5.2.1.3 无菌操作台面或超净工作台，应定期检测其洁净度，应达到100级尘埃粒子5um的粒数不得超过3.5/升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s，细菌菌落数平均1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。5.2.1.4 无菌室内应准备好盛有消毒用5%甲酚酞的玻璃罐，酒精灯，火柴，镊子75%酒精棉球，碘精棉及拖鞋等。5.2.2 真空泵极限压力610-2Pa，抽数1L/S，转速1400r/min,功率为0.25KW。置无菌室外，以耐压橡皮管通入无菌操作室。5.2.3 恒温培养箱及可调的30-35生化培养箱。5.2.4 离心机，显微镜、高压灭菌炉、恒温烤箱。5.2.5 玻璃器皿，试管移液管，刻度吸管（1.5ml、10ml）、注射器（2.5ml、10ml）双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次，使用过后如与细菌接触，应先灭菌后倒出内容物，再清洗、晾干，凡无菌操作过程中所用的器皿都应用牛皮纸包扎严密121灭菌30分钟。5.2.5.1 移液管，刻度吸管在管口上端，松松塞上少许棉花，然后放入吸管简内或牛皮纸袋内，消毒备用。5.2.5.2 试管、离心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上角棉胶专用塞或纱布棉塞，塞子应塞进管口内2/3处，用牛皮纸将管口包扎严，消毒备用。5.2.5.3 注射器、针头（9、11、12号），将注射器与针头配对，将注射器、针头、管分别放在双层纱布内扎严，消毒备用。5.2.6 无菌衣、裤帽、口罩等洗净晾干，配套用牛皮纸包严，消毒备用。5.2.7 微孔滤膜，直径50mm，孔径0.45mm。5.2.8 除菌滤器目前多采用STV2型无菌检查薄膜滤器装置，它是由除菌过滤器和底座排液管，两部分组成，新购置的滤器用毛刷将该装置各部件用水刷净，除去附着上的垢物，用水冲洗数次，纯化水冲洗2次，玻璃筒放于清洁液中，再用水及纯化水冲洗净晾干备用。5.2.8.1 除菌滤器的装配将过滤器的漏斗的上面置1个橡皮圈，上面加多孔垫板，在垫板上垫一个四氯乙烯膜垫圈，放上己浸湿的微孔膜片，在其上再垫一个四氯乙稀薄膜垫圈。按装玻璃筒，套上金属固定架，拧上底部圆螺母，漏斗底部大套上橡皮塞。将除菌滤器放于铝板盒中，盖严，外面用牛皮纸包扎灭菌备用。5.2.9 底座排液的排液管口接一条耐压橡皮管并将管口用纱布、牛皮纸包扎，灭菌备用。5.2.10 手术镊、手术剪洗净，擦干，用双层纱布将1把剪子与1个镊子间隔包扎在一起放于铝钣盒内盖严，用牛皮纸包扎灭菌备用。5.2.11 抽气瓶为1000-2000ml，用水及纯化水洗净晾干，瓶口用配有两个玻璃管（一个速至瓶底，一个短些）的橡皮塞盖紧，短的玻璃管套上一个短耐压橡皮管抽气口用耐压橡皮管与空气过滤玻璃器（内充填以棉花）相连，空气过滤玻璃器的另一管口用纱布、牛皮纸包扎严紧，抽气瓶的全部装置，用牛皮纸包扎，灭菌备用。5.2.12 用具的灭菌将包扎妥的用具，在（1210.5）蒸气灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，适于高压灭菌的器皿也可采用160干热灭菌2小时。5.3 培养基 需气菌、厌气菌、真菌培养基按中国药典规定。5.4 培养基灵敏度检查，按中国药典规定。5.5 对照用菌液的制备5.5.1 金黄色葡萄球菌液 取金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003的营养琼脂，斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，在30-35培养16-18小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1：106。5.5.2 生孢梭菌菌液取生孢梭菌CMCC（B）64941的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物少许，接种至相同培养基内，在30-35培养18-24小时后，用灭菌生理盐水稀释成1：106。5.5.3 白色念珠菌菌液取白色念珠菌CMCC（B）98001的真菌琼脂培养基斜面培养物少许，接种至真菌培养基内在23-28培养24小时，用灭菌生理盐水稀释成1：105。5.6 检查法的操作5.6.1 取备好的供试品，培养基在移入缓冲间之前应先编号，并用0.1%新洁尔灭或酒精棉擦试瓶（管）外壁，然后连同其他用具移入缓冲间，打开无菌间紫外光灯和空气过滤装置开关，并使其工作在1小时以上。5.6.2 操作人员用肥皂水清洗双手，关闭紫外灯进入缓冲间，用碘酒棉，酒精棉擦手，穿戴衣帽口罩，将全部物品剥去牛皮纸移入灭菌室。5.7 培养基的制备及培养条件 培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2-25、避光的环境，若保存于非密闭容器，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。5.7.1 硫乙醇酸盐流体培养基的配制 称取29.25g，加水1000ml加热煮沸使溶解，分装于试管中，（50ml/管）其装量与容器高度的比例应符合培养基结束后培养层氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟),迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。硫乙醇酸盐流体培养基置3035培养。5.7.2 改良马丁培养基配制 称取28.5g,加水1000ml加热煮沸使溶解,分装与试管中,(50ml/管)。改良马丁培养基置2328培养。5.7.3 选择性培养基按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法,在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验。5.8 培养基的适用性检查5.8.1 无菌检查用的硫乙醇盐酸流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。5.8.2 无菌性检查 每批培养基随机取下不少于5支(瓶),培养14天,应无菌生长。5.9 灵敏度检查菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术,以保证实验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌 (Staphy lococcus aureus）CMCC(B)26 003 铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10 104 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis)CMCC(B)63 501 生孢梭菌（Clostridium sporogenes)CMCC(B)64 941 白色念珠菌（Candida albicans)CMCC(F)98 001 黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)98 0035.10 菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、 枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，2328培养2448小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，2328培养57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨醇80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。5.11 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存期内使用。5.12 培养基接种 取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。5.13 结果判断空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。5.14 稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。5.14.1 0.1%蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节PH值至7.10.2，分装，灭菌。5.14.2 PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。5.14.3根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。5.15 方法验证试验当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。5.16 菌种及菌液制备除大肠埃希菌（Escherichia coli）CM-CC(B)44 102外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。5.17 薄膜过滤法取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培养35天。各试验菌同法操作。5.18 直接接种法 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定的温度培养35天。5.19 结果判断与对照管比较，如含供试品各容器中的试验均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加配养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证试验。5.20 供试品的无菌检查5.20.1 检查数量检查数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2、表3规定。表1、表2、表3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照用。5.20.2 检验量 是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。5.20.3 阳性对照应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌，阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养4872小时应生长良好。5.20.4 阴性对照供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。5.20.5 无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒。如果容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头），向容器内导入无菌空气，再按无菌操作启开容器取出内容物。5.20.6 供试品处理及接种培养基除另有规定外，按下列方法进行。5.20.6.1 薄膜过滤法 薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45um，直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。 水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，且总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。5.20.6.2 水溶液供试品取规定量，直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3次。所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验，冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将100ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内。如采用一般薄膜过滤器，取出滤膜，将其分成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作阳性对照用。5.20.6.3 可溶于水的