2010CB944800-牙发生发育分子机理及牙齿再生研究.Doc

项目名称：牙发生发育分子机理及牙齿再生研究首席科学家：田卫东 四川大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部 四川省科技厅一、研究内容关键科学问题1 阐明牙齿发育过程中上皮-间充质细胞相互作用关键基因及最适成牙微环境；2 探讨牙源性上皮及间充质干细胞的发育起源及牙向分化机制；3 探索用于牙再生种子细胞（上皮及间充质细胞）的替代细胞；4 重建牙再生的微环境，在大动物体内用牙源性干细胞及非牙源性成体干细胞复合生物支架材料进行牙再生研究。主要研究内容本项目是围绕牙齿发育和再生进行相关的基础研究，首先要研究并明确牙齿发生、发育的分子调控机理，为全牙再生提供理论依据和实验指导，并为牙发育和牙再生相关干细胞的分化调控及其机理研究奠定基础；同时，研制适于牙齿各种组织成份构建的生物支架材料，为实现牙齿再生奠定实验基础；上述各研究是有机结合、循序渐进的系统，其最终目标是明确牙齿发育机理并实现牙的再生。本项目包含以下主要研究内容：1 牙发育中上皮-间充质细胞相互作用分子机制及微环境的影响在建立牙胚上皮-间充质离解重组体外培养模型的基础上，应用基因敲除、转基因和RNAi等技术探讨FGF、TGF-s、BMPs、Wnt、Shh等在牙胚发育中上皮和间充质各自的作用机制；观察不同外部微环境对于牙胚上皮和间充质干细胞的影响。本课题研究目标：通过对牙发生发育基因调控机制的研究，发现牙胚上皮和间充质中起关键作用的信号分子；明确牙胚上皮和间充质相互诱导的分子机制；寻获牙胚中干细胞和祖细胞诱导分化的微环境，进而获得牙胚发育形态发生期间的分子作用机制。2 牙源性干细胞成牙分化机制研究牙发育过程中的各个阶段理论上都存在牙源性干细胞，这些干细胞遵循发育程序和机理向进行分化直至形成牙齿，在成体牙中，有些牙源性干细胞如牙髓干细胞和牙周膜干细胞等得以部分保留。本课题拟对牙源性干细胞牙向分化的分子机制进行研究，并对牙源性干细胞的特异性调控因子、定向分化诱导技术体系和成牙能力等关键问题进行研究，以进一步阐明其在牙齿发生发育中的作用，并以此作为理论基础指导牙再生研究。本课题研究目标： 通过对牙源性干细胞发育起源及牙向分化的研究，探讨不同发育时期的牙源性干细胞的基因差异表达、成牙分化能力、分子调控机制等，进一步阐明牙发育过程中牙源性干细胞牙向分化机制。3 用于牙再生的上皮与间充质细胞来源的研究进行牙齿再生研究必须具有再生的核心元素即种子细胞。因此，该课题拟对非牙源性成体干细胞的牙向诱导分化进行研究，利于将来控制这些干细胞向成牙种子细胞的定向分化，为牙齿再生提供种子细胞。本课题研究目标：明确多种非牙源性干细胞和iPS细胞的成牙分化潜能，建立非牙源性干细胞和iPS细胞牙向分化的诱导体系，探索可用于牙再生种子细胞（上皮及间充质细胞）的替代细胞。4 基于牙齿发育原理的牙齿构建与再生要形成在形态和结构上类似于天然牙的再生牙齿是我们的最终目标。本课题拟利用牙发生发育的原理，重建牙再生的微环境，探讨生物支架材料的成份和性能对牙源性干细胞及非牙源性成体干细胞的生长和牙向分化影响，并进行种子细胞/支架材料在不同微环境下的构建和大动物体内牙再生研究，阐明牙再生相关机制。本课题研究目标：基于牙发育中上皮-间充质相互作用原理，重建牙再生的微环境，研制出适宜牙再生的生物支架材料，用牙源性干细胞及非牙源性成体干细胞作为种子细胞复合生物支架材料在大动物体内实现牙再生，并明确牙再生相关机理。二、预期目标项目总体目标围绕口腔医学和再生医学发展的重大科学问题，阐明牙发生发育过程中上皮-间充质相互作用机制及微环境对成牙相关干细胞的调控机理，建立牙源性和非牙源性干细胞牙向诱导分化体系，并基于牙发育机理和牙再生微环境的研究探索牙齿再生，重点研究牙根再生和生物性牙根，为临床牙齿缺失修复提供科学依据。通过本项目的研究，搭建牙发育和牙再生研究平台，培养和建立一支学术水平高、创新能力强的研究人才队伍，使我国在相关领域的研究达到国际先进水平。5年具体预期目标及考核指标1、通过对牙发生发育基因调控机制的研究，发现牙胚上皮和间充质中起关键作用的信号分子；明确牙胚上皮和间充质相互诱导的分子机制；寻获牙胚中干细胞和祖细胞诱导分化的微环境，进而获得牙胚发育形态发生期间的分子作用机制。2、通过对牙源性干细胞发育起源及牙向分化的研究，探讨不同发育时期的牙源性干细胞的基因差异表达、成牙分化能力、分子调控机制等，进一步阐明牙发育过程中牙源性干细胞牙向分化机制。3. 明确多种非牙源性干细胞和iPS细胞的成牙分化潜能，建立非牙源性干细胞和iPS细胞牙向分化的诱导体系，探索可用于牙再生种子细胞（上皮及间充质细胞）的替代细胞。4基于牙发育中上皮-间充质相互作用原理，重建牙再生的微环境，研制出适宜牙再生的生物支架材料，用牙源性干细胞及非牙源性成体干细胞作为种子细胞复合生物支架材料在大动物体内进行牙再生研究，重点研究牙根再生和生物性牙根，并明确牙再生相关机理。5发表具有较高影响因子的SCI论文2040篇；申请发明专利510项；培养博士后1020人，博士4060人，硕士2040人；争取12人获得全国百篇优秀博士论文；吸引国外优秀的学者和留学博士回国工作。三、研究方案总体研究方案进行牙齿再生，首先必须了解牙齿生长发育中上皮-间充质细胞相互作用机理，阐明牙源性和非牙源性干细胞定向分化诱导及其机制，并解决牙再生微环境和种子细胞来源等关键问题，因此，本项目总体方案如下：首先明确牙发生发育中上皮-间充质细胞相互作用分子调控机制；明确牙源性干细胞成牙分化机制；寻找牙再生种子细胞来源，进行非牙源性干细胞牙向分化研究；基于牙齿发育原理在大动物体内进行牙再生研究，重点研究牙根再生和生物性牙根。技术路径 创新点和特色1 理论创新：本项目针对牙齿发育机制和牙再生微环境等关键科学问题进行研究，有望阐明牙发生发育过程中上皮-间充质相互作用机制，提出新的理论，发现新的关键调控基因；明确微环境对牙再生的影响；探索出牙再生种子细胞新的来源及其牙向诱导分化体系。以上研究均为国内外前沿研究，为建立牙再生新理论和新技术提供科学依据，具有原始创新性。2 技术创新：本项目将首次建立牙齿再生的微环境体系；研制出适用于牙再生的生物支架材料；利用成牙相关干细胞重建具有发育能力的牙胚；在大型动物（小型猪）进行牙再生研究。在技术上具有首创性。3 研究特色：通过对牙齿发育过程中上皮-间充质相互作用机制与牙齿再生的研究，将为机体其他器官发育与再生提供科学依据。利用小型猪这种大动物进行牙再生研究，重点研究牙根再生和生物性牙根，有望为临床应用奠定基础。可行性分析本项目组在牙齿生长发育及再生领域有雄厚的研究基础，基本包括了国内牙齿发育与再生及组织工程领域的重要研究团队，已获得大量的重要研究成果，论文发表于Lancet、Dev Cell、Stem Cells、PNAS、JBC等杂志上。1 理论和方法可行：上皮-间充质的相互作用是牙齿发育的核心与关键并贯穿于牙齿发育的全过程。牙源性上皮与牙源性或非牙源性间充质干细胞复合形成牙齿样器官，以及非牙源性上皮表达牙源性上皮诱导信号的研究成果为我们在非牙源性细胞中找寻细胞来源提供了有力的理论依据。在适宜的诱导条件下，非牙源性的表皮干细胞和间充质干细胞可分化为具有成牙能力的细胞。重组技术是研究机体发育中多种组织相互作用、相互诱导的重要方法，牙齿再生研究采用重组技术已获得不少可喜的成果。所以将成牙相关干细胞应用于牙齿再生研究显示了较强的理论可行性。2 有前期研究工作基础：本项目组在牙齿发生发育研究领域具有较好的研究基础，从牙发生发育的各个阶段，系统全面地探讨了多种信号通路及关键基因在牙发育中的作用；本项目组已成功掌握牙胚体外离解重组的技术，并发现牙胚间充质的完整性在维持牙胚的发育方面起了关键的作用；前期关于小型猪牙齿生长发育组织学图谱已基本建成，现正尝试进行小型猪牙胚的体外培养。通过对牙再生的研究发现牙胚间充质的完整性在控制牙外形的正确性上起到至关重要的作用，在牙周及生物牙根再生领域已有多项突破性成果，首先分离牙髓干细胞、牙周膜干细胞和脱落乳牙干细胞，相关成果发表在国际著名杂志Lancet、PNAS上。在小鼠体内已成功再生生物牙根，在全牙再生及牙上皮和间充质干细胞领域也已有扎实的基础，将牙上皮和间充质细胞重组再植于动物体内获得一个类似全牙的组织，初步研究表明骨髓间充质干细胞等非牙源性成体干细胞可以作为牙再生的种子细胞。此外，本项目组曾承担“973” 计划前期专项研究、“863”计划”重大专项、国家自然科学基金等多项相关的国家科研计划，为本研究提供了扎实的研究基础。3 实验条件有保障：本项目组在牙齿发育生物学和牙齿组织工程研究方面已建立了相应的技术平台，在细胞培养、组织器官重建、基因工程技术、各种蛋白和分子水平的分析与鉴定、体内外分化模型的建立和应用研究等与干细胞、组织工程和再生医学相关的研究技术方面积累了非常丰富的经验，从而为本项目的完成提供了技术保障。本项目组由口腔疾病研究国家重点实验室、组织工程国家工程研究中心、第四军医大学组织工程研究中心、首都医科大学牙齿再生实验室及生物化学和分子生物学实验室联合组成，拥有完善的实验设施和条件，可提供本项目需要的全部大中型设备。本项目的上述研究成果均基于该研究平台，尤其在牙齿发育与再生中的研究具有自己的特色，得到了国内外同行的广泛重视。与美国南加州大学、英国利兹大学和伯明翰大学等保持密切的合作。这些为本项目的实施提供了物质保障。4 研究队伍实力雄厚：本项目组各课题负责人及学术骨干均为牙再生及组织工程领域的知名学者，本项目组成员施松涛教授、柴洋教授是国际牙发育及再生领域的著名学者，与本项目组有多年合作的研究基础，在课题研究和人才培养方面将发挥重要的作用。各课题组均有年轻的优秀人才在国外培养，为本课题建立了良好的国内外交流途径和人才储备。课题设置本项目是围绕牙齿发育和再生进行相关的基础研究，首先要研究并明确牙齿发生、发育的分子调控机理，为全牙再生提供理论依据和实验指导，并为牙发育和牙再生相关干细胞的分化调控及其机理研究奠定基础；同时，研制适于牙齿各种组织成份构建的生物支架材料，为实现牙齿再生奠定实验基础；上述各研究是有机结合、循序渐进的系统，其最终目标是明确牙齿发育机理并实现牙的再生。本项目拟设置以下四个课题：课题一 牙发生发育中上皮-间充质细胞相互作用分子机制及微环境的影响：在建立牙胚上皮-间充质离解重组体外培养模型的基础上，应用基因敲除、转基因和RNAi等技术探讨FGF、TGF-s、BMPs、Wnt、Shh等在牙胚发育中上皮和间充质相互作用的调控机制；观察不同外部微环境对于牙胚上皮和间充质干细胞相互作用的影响。本课题研究目标：通过对牙发生发育基因调控机制的研究，发现牙胚上皮和间充质中起关键作用的信号分子；明确牙胚上皮和间充质相互诱导的分子机制；寻获牙胚中干细胞和祖细胞诱导分化的微环境，进而获得牙胚发育形态发生期间的分子作用机制。该课题的第一承担单位是首都医科大学。课题二 牙源性干细胞发育起源及其牙向诱导分化机制研究：应用基因敲除、生物芯片、RNAi等技术研究颅神经嵴及其不同发育阶段牙源性干细胞牙向分化的分子调控机制，并对牙源性间充质细胞（如：牙髓干细胞）和牙源性上皮细胞（如：颈环干细胞）的成牙分化及其机理等进行系统性研究。本课题研究目标： 通过对牙源性干细胞发育起源及牙向分化的研究，探讨不同发育时期的牙源性干细胞的基因差异表达、成牙分化能力、分子调控机制等，进一步阐明牙发育过程中牙源性干细胞牙向分化机制。该课题的承担单位是四川大学口腔疾病研究国家重点实验室。课题三 用于牙再生的上皮与间充质细胞的替代细胞诱导分化的研究：建立微环境诱导体系，研究多种非牙源性成体干细胞（骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、表皮干细胞等）牙向分化能力及机制，利用iPS全能干细胞的特点，研究其向牙源性上皮及间充质细胞分化的相关机制，探索用于牙再生种子细胞（上皮及间充质细胞）的替代细胞。本课题研究目标：明确多种非牙源性干细胞和iPS细胞的成牙分化潜能，建立非牙源性干细胞和iPS细胞牙向分化的诱导体系，探索可用于牙再生种子细胞（上皮及间充质细胞）的替代细胞。该课题的第一承担单位是中国人民解放军第四军医大学。课题四，基于牙齿发育原理的大型动物体内牙齿再生研究：基于牙发育中上皮-间充质相互作用原理，重建牙再生的微环境，探讨生物支架材料的成份和性能对牙源性干细胞及非牙源性成体干细胞的生长和牙向分化影响，并进行种子细胞/支架材料在不同微环境下的构建和大动物体内牙再生研究，阐明牙再生相关机制。本课题研究目标：基于牙发育中上皮-间充质相互作用原理，重建牙再生的微环境，研制出适宜牙再生的生物支架材料，用牙源性干细胞及非牙源性成体干细胞作为种子细胞复合生物支架材料在大动物体内实现牙再生，重点研究牙根再生和生物性牙根，并明确牙再生相关机理。该课题的承担单位为组织工程国家工程研究中心（上海国睿生命科技有限公司组织工程（上海）国家工程研究中心）。各课题间相互关系以及与总体目标和5年目标的关系进行牙齿再生，首先必须阐明牙齿发生发育分子机理，因此，通过研究牙胚上皮-间充质细胞相互作用，明确牙胚上皮和间充质相互诱导的分子机制 (课题一)，并探讨牙源性干细胞起源和牙向分化机制，以及不同发育时期的牙源性干细胞的基因差异表达、成牙分化能力、分子调控机制等，进一步揭示牙发育机理（课题二），这是实现牙齿再生的基础和首要任务；在此基础之上，以牙源性干细胞牙向诱导分化为理论依据，研究非牙源性干细胞诱导成牙及其机制，解决牙再生微环境和种子细胞来源等关键问题（课题三）；继而，基于上述牙发育理论，进行大动物体内的牙再生研究，重点研究牙根再生和生物性牙根（课题四）。综上，各课题之间层次分明且环环相扣，其共同目的均为明确牙发育机理和探索牙再生，服务于项目总体目标。四、年度计划研究内容预期目标第一年1） 牙胚上皮-间充质离解及重组体外培养模型的建立2）牙发生发育过程中不同阶段的牙源性上皮和间充质干细胞发育起源研究3）进行各种非牙源性干细胞的生物学特性，及其向牙源性上皮细胞分化的研究4）探讨多种生物材料的不同生物理化特性，进行牙再生生物支架材料的研发1) 通过对牙发生发育基因调控机制的研究，发现牙胚上皮和间充质中起关键作用的信号分子； 通过对牙源性干细胞发育起源及牙向分化的研究，探讨不同发育时期的牙源性干细胞的基因差异表达；明确多种非牙源性干细胞和iPS细胞的成牙分化潜能；基于牙发育中上皮-间充质相互作用原理，重建牙再生的微环境2) 发表具有较高影响因子SCI论文47篇3) 申请国家发明专利23项第二年1） RNAi技术探讨FGF、TGF、BMP、Wnt、Shh 等在牙胚发育中的调控作用，从而研究其在牙发生发育过程中的作用机制2) 牙发生发育过程中不同阶段牙源性上皮和牙源性间充质干细胞在牙向分化过程中，其关键基因调控作用的研究3）各种非牙源性干细胞生物学特性及其向牙源性间充质细胞诱导分化及机理的研究4）应用种子细胞和生物材料技术，研究具有牙周膜结构的生物牙根构建1) 明确牙胚上皮和间充质相互诱导的分子机制； 探讨不同发育时期的牙源性干细胞成牙分化能力；建立非牙源性干细胞和iPS细胞牙向分化的诱导体系；研制出适宜牙再生的生物支架材料2) 发表具有较高影响因子SCI论文59篇;申请国家发明专利23项。3) 培养博士后34人，博士生59人，硕士610人第三年1) 利用基因敲除等技术研究分析TGF信号在牙发生发育过程中对牙齿形态发育的作用2）牙发生发育过程中牙源性间充质干细胞牙向诱导分化的研究3） 多能诱导干细胞iPS向牙源性细胞诱导分化能力及相关分子机理的研究4) 应用生物材料和细胞生物学技术研究